本发明属于多肽药物的合成制备方法技术领域，特别涉及一种亮丙瑞林的合成制备方法。
背景技术：
中文名称：亮丙瑞林
英文名称：Leuprorelin
结构式：Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-(D-Leu)-Leu-Arg-Pro-NHEt
分子式：C59H84N16O12
分子量：1209.45
亮丙瑞林(Leuprorelin)是一种强效的促性腺激素释放激素(GnRH)激动药，是视丘下部所产生的黄体生产激素释放激素(LHRH)的高活性类似物，为合成的两端封闭的水溶性九肽。亮丙瑞林可以刺激垂体分泌促性腺激素，诱发生殖器官生产类固醇，长期大量使用会使LHRH受体脱敏，抑制促性腺激素的分泌以及搞完或卵巢甾类的生产，临床上用来治疗或缓解多种性激素依赖性疾病，如子宫肌瘤、子宫内膜异位症、前列腺癌、中枢性性早熟等。
授权公告号CN 101538315 B公开了一种固相法和液相法结合制备亮丙瑞林的方法，公开如下步骤：1)由Fmoc-Pro-OH和HMPB-AM树脂为起始原料，得到Fmoc-Pro-HMPB-AM树脂；2)逐一偶联合成侧链全保护亮丙瑞林前体肽-HMPB-AM树脂；3)对其进行切割，得到侧链全保护亮丙瑞林前体肽；4)对侧链全保护亮丙瑞林前体肽乙胺化，得到侧链全保护亮丙瑞林；5)对侧链全保护亮丙瑞林经脱侧链保护基团反应，获得亮丙瑞林的粗品；6)亮丙瑞林的粗品经过分离纯化、冻干得到亮丙瑞林精肽。
目前市场上的合成亮丙瑞林的方法，多需要经过两次及以上的切割反应，工艺繁琐、收率低，且生产成本高，不利于亮丙瑞林的大量需求和快速生产。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种亮丙瑞林的合成制备方法，该合成方法缩合收率高、工艺简单周期短、成本低，具有广泛的市场应用前景。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现：
一种亮丙瑞林的合成制备方法，该合成制备方法包括如下具体步骤：
(1)以氯树脂为起始树脂载体，以碱性溶剂溶解巯基乙胺，在恒温条件下与氯树脂混合，反应过夜，得到乙胺化氯树脂；
(2)在乙胺化氯树脂中加入等体积比的甲醇和DIEA，进行封头反应，反应时间20-30min；
(3)用DMF洗涤封头后的乙胺化氯树脂，然后依次向反应容器中投入活化后的Fmoc保护氨基酸，以20％哌啶/DMF溶液为脱保护试剂，进行连续的肽链缩合反应；
(4)每次投入缩合的Fmoc保护氨基酸反应20-30min后，用微波技术处理反应的氯树脂，以DMF溶液洗涤反应后的肽链-氯树脂；
(5)将全保护亮丙瑞林-氯树脂用切割试剂进行切割反应，用-20℃低温预冷的乙醚进行沉降，得到亮丙瑞林粗品肽；
(6)将亮丙瑞林粗品肽采用反相高效液相色谱法纯化，纯化选用C18制备柱，以A、B两相溶剂为流动相，以非等梯度程序进行多肽的分离提纯。
上述的亮丙瑞林的合成制备技术方案中，步骤(1)所述氯树脂优先为2-Cl(Trt)-Cl Resin。氯树脂乙胺化反应中以DCM/DIEA为溶剂，在30℃恒温条件下反应过夜。
步骤(2)所述封头反应，反应的封头试剂为甲醇：DIEA＝1:1(体积比)配置的混合溶液，反应容器置于摇床上摇晃反应，摇床转速20-30r/min。
步骤(3)所述亮丙瑞林肽链的缩合反应，反应中以DIC/HOBT为缩合剂和活化剂，以DMF溶液洗涤反应的氯树脂，反应时间为20-60min，反应温度为28℃-30℃条件。
步骤(3)所述的Fmoc-保护氨基酸投入顺序为Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Arg(pbf)-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-D-Leu-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Pyr-OH。
步骤(4)所述微波技术反应，反应条件是指在Fmoc-氨基酸正常缩合反应后，向反应容器中加入适量的DIEA，然后将氨基树脂微波15s，微波功率25％。
步骤(5)所述全保护亮丙瑞林-氯树脂的切割、沉降反应，切割试剂为TFA:TIS:H2O＝95:2.5:2.5(体积比)，每克树脂使用8-10ml切割试剂，将低温乙醚加入到切割后的多肽中，进行离心沉降，得到亮丙瑞林粗品肽。
步骤(6)所述亮丙瑞林粗品肽的纯化，纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，以B.Cone/％(5→50)，Time.0→45min的梯度程序进行多肽的分离提纯。
本发明的有益效果：本发明采用Fmoc固相合成法，引入创新型技术，在碱性条件下，进行氯树脂乙胺化反应，并利用特异性微波反应依次缩合Fmoc-保护氨基酸，将产物进行一次性切割沉降反应，然后采用反相高效液相色谱法纯化得到亮丙瑞林纯品多肽；大大简化了工艺流程，提高了目标产物的收率，利于快速、低成本地大规模生产。
具体实施方式
通过下述实施例将有助于理解本发明，但不能限制本发明的内容。对于本发明所属技术领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干简单替换或推演，都视为属于本发明的保护范围。
一种亮丙瑞林的合成制备方法，包括树脂的乙胺化反应，树脂的封头反应，肽链的微波缩合反应，得到亮丙瑞林肽链前体肽-树脂，然后进行肽链前体肽-树脂的切割、沉降，得到亮丙瑞林粗品肽，并采用反相高效液相色谱法纯化得到亮丙瑞林纯品多肽；为实现上述目的，本发明采用以下技术方案合成亮丙瑞林纯品多肽：
实施例1
1.2-Cl树脂的溶胀
称取取代度为0.9-1.1mmol/g的2-Cl树脂0.1g于多肽合成反应器中，加入DCM溶剂使其完全浸没氯树脂，溶胀30min。
2.氯树脂乙胺化
称取10mg巯基乙胺，用1ml DCM溶解，加入0.2ml DIEA将其完全溶解，然后加入到溶胀后的氯树脂中，30℃下反应过夜。
3.乙胺化氯树脂的封头反应
向反应容器中加入0.5ml甲醇和0.5ml DIEA溶液，使容器中的树脂在溶液中呈流沙状态，反应容器置于摇床上摇晃反应20min。
4.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的合成
加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次。
称取43mg的Fmoc-Pro-OH原料，和22mg的HOBT原料，用2ml DMF溶解，加入0.5ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应35min，抽干，得到Fmoc-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作3次，抽干。
加入4ml20％哌啶/DMF溶液到反应容器中，摇晃反应20min，抽干；然后加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次，抽干。
称取80mg的Fmoc-Arg(pbf)-OH原料，和22mg的HOBT原料，用2ml D MF溶解，加入0.5ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应35min，抽干，得到Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
按照上述操作方法，依次投入2-Cl树脂端第3-9个Fmoc-氨基酸，缩合反应得到Fmoc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂，抽干。
本发明中使用的保护氨基酸从2-Cl树脂起算第1-9个氨基酸相对应的保护氨基酸及分子量如下表所示：
本发明中一些常用缩写具有以下含义
2-Cl树脂：2-氯三苯甲基氯树脂
DIC：二异丙基碳二亚胺
HOBT：1-羟基苯并三唑
Fmoc：芴甲氧羰基
DIEA：N，N-二异丙基乙胺
DMF：N，N-二甲基甲酰胺
DCM：二氯甲烷
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
5.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的切割沉降
配置切割试剂TFA:TIS:H2O＝4.75ml:0.125ml:0.125ml的混合溶液，加入到抽干后的反应容器中，摇晃反应40-50min。取两个10ml离心管，分别加入6ml在-20℃条件下预冷的乙醚试剂，然后将切割液平均加入到离心管中，充分混匀，然后进行离心沉降反应；沉降一次后取出离心管，然后再加入8ml低温乙醚，混匀，离心沉降，重复操作2次；收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到亮丙瑞林粗品肽。
6.亮丙瑞林粗品肽的纯化
用5％乙腈/水溶剂溶解亮丙瑞林粗品肽，并用有机滤膜过滤。纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，按照如下的梯度程序进行多肽的分离提纯。
7.亮丙瑞林纯品多肽的收率
称量冻干后的亮丙瑞林纯品多肽共61.8mg，用高效液相色谱法分析亮丙瑞林纯品多肽的纯度达到99％，并且单杂小于0.5％，经计算产品收率为80.5％(实测树脂取代度为0.4mmol/g)，与现有技术下的产品纯度有大大的提高，其纯品收率提高2-3倍。
实施例2
1.2-Cl树脂的溶胀
称取取代度为0.9-1.1mmol/g的2-Cl树脂0.1g于多肽合成反应器中，加入DCM溶剂使其完全浸没氯树脂，溶胀30min。
2.氯树脂乙胺化
称取10mg巯基乙胺，用1ml DCM溶解，加入0.2ml DIEA将其完全溶解，然后加入到溶胀后的氯树脂中，30℃下反应过夜。
3.乙胺化氯树脂的封头反应
向反应容器中加入0.5ml甲醇和0.5ml DIEA溶液，使容器中的树脂在溶液中呈流沙状态，反应容器置于摇床上摇晃反应20min。
4.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的合成
加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次。
称取41mg的Fmoc-Pro-OH原料，和20mg的HOBT原料，用2ml DMF溶解，加入0.5ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应25min后，加入0.5ml的DIEA，微波肽链-氯树脂15s，向反应容器中加入3ml的DMF溶液洗涤树脂，抽干，得到Fmoc-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作3次，抽干。
加入4ml20％哌啶/DMF溶液到反应容器中，摇晃反应20min，抽干；然后加入3ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入3ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次，抽干。
称取78mg的Fmoc-Arg(pbf)-OH原料，和20mg的HOBT原料，用2ml D MF溶解，加入0.5ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应25min后，加入0.5ml的DIEA，微波肽链-氯树脂15s，向反应容器中加入3ml的DMF溶液洗涤树脂，抽干，得到Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
按照上述操作方法，依次投入2-Cl树脂端第3-9个Fmoc-氨基酸，缩合反应得到Fmoc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂，抽干。
5.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的切割沉降
配置切割试剂TFA:TIS:H2O＝4.75ml:0.125ml:0.125ml的混合溶液，加入到抽干后的反应容器中，摇晃反应40-50min。取两个10ml离心管，分别加入6ml在-20℃条件下预冷的乙醚试剂，然后将切割液平均加入到离心管中，充分混匀，然后进行离心沉降反应；沉降一次后取出离心管，然后再加入8ml低温乙醚，混匀，离心沉降，重复操作2次；收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到亮丙瑞林粗品肽。
6.亮丙瑞林粗品肽的纯化
用5％乙腈/水溶剂溶解亮丙瑞林粗品肽，并用有机滤膜过滤。纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，按照如下的梯度程序进行多肽的分离提纯。
7.亮丙瑞林纯品多肽的收率
称量冻干后的亮丙瑞林粗品肽共67.3mg，用高效液相色谱法分析亮丙瑞林纯品多肽的纯度达到99.2％，并且单杂小于0.5％，经计算经过微波处理后的纯品多肽产品收率为87.6％(实测树脂取代度为0.4mmol/g)，比实施例1未经过微波处理的多肽收率高出6.2个百分点。
实施例3
1.2-Cl树脂的溶胀
称取取代度为0.9-1.1mmol/g的2-Cl树脂1g于多肽合成反应器中，加入DCM溶剂使其完全浸没氯树脂，溶胀40min。
2.氯树脂乙胺化
称取100mg巯基乙胺，用12ml DCM溶解，加入4ml DIEA将其完全溶解，然后加入到溶胀后的氯树脂中，30℃下反应过夜。
3.乙胺化氯树脂的封头反应
将反应容器中的树脂抽干，然后加入10ml甲醇和10ml DIEA溶液，使容器中的树脂在溶液中呈流沙状态，反应容器置于摇床上摇晃反应20min。
4.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的合成
加入30ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入30ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次。
称取425mg的Fmoc-Pro-OH原料，和230mg的HOBT原料，用20ml DMF溶解，加入3ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应30min后，加入3ml的DIEA，微波肽链-氯树脂15s，向反应容器中加入30m l的DMF溶液洗涤树脂，抽干，得到Fmoc-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
加入30ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入30ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作3次，抽干。
加入40ml20％哌啶/DMF溶液到反应容器中，摇晃反应20min，抽干；然后加入30ml DMF溶液到反应容器中，摇晃洗涤1min，然后将反应容器中的液体抽干，再加入30ml DMF溶液洗涤树脂，摇晃洗涤1min，重复操作4次，抽干。
称取800mg的Fmoc-Arg(pbf)-OH原料，和230mg的HOBT原料，用20m l DMF溶解，加入3ml DIC溶液将其完全溶解，然后加入到反应容器中，28℃条件下反应30min后，加入3ml的DIEA，微波肽链-氯树脂15s，向反应容器中加入30ml的DMF溶液洗涤树脂，抽干，得到Fmoc-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂。
按照上述操作方法，依次投入2-Cl树脂端第3-9个Fmoc-氨基酸，缩合反应得到Fmoc-Pyr-His(Trt)-Trp(Boc)-Ser(tbu)-Tyr(tbu)-D-Leu-Leu-Arg(pbf)-Pro-NHEt-2-Cl树脂，抽干。
5.全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂的切割沉降
配置切割试剂TFA:TIS:H2O＝38ml:1ml:1ml的混合溶液，加入到抽干后的反应容器中，摇晃反应50-60min。取五个50ml离心管，分别加入35ml在-20℃条件下预冷的乙醚试剂，然后将切割液平均加入到离心管中，充分混匀，然后进行离心沉降反应；沉降一次后取出离心管，然后再加入35ml低温乙醚，混匀，离心沉降，重复操作3次；收集沉淀物，真空冷冻干燥，得到亮丙瑞林粗品肽。
6.亮丙瑞林粗品肽的纯化
用5％乙腈/水溶剂溶解亮丙瑞林粗品肽，并用有机滤膜过滤。纯化选用C18，5um制备柱进行反相高效液相色谱纯化，以A相：0.1％TFA/水，B相：0.1％TFA/乙腈为流动相，按照如下的梯度程序进行多肽的分离提纯。
7.亮丙瑞林纯品多肽的收率
称量冻干后的亮丙瑞林粗品肽共665.9mg，用高效液相色谱法分析亮丙瑞林纯品多肽的纯度达到99.1％，并且单杂小于0.5％，经计算，生产量放大10倍后，经过微波处理后的纯品多肽产品收率为86.7％(实测树脂取代度为0.4mmol/g)，与实施例2小规模生产多肽的收率87.6％相差不大；证实本发明实验数据的稳定性和正确性。
经上述实施例1、例2和例3实验，得出在正常缩合反应后，再进行微波技术反应，合成得到的亮丙瑞林纯品多肽的收率更高，效果更佳。
本发明采用Fmoc固相合成法，以2-Cl树脂为固相载体，在碱性条件下，进行氯树脂乙胺化反应，然后以低成本的HOBT/DIC为缩合剂，在特异性微波条件下按照亮丙瑞林肽链顺序依次缩合Fmoc-保护氨基酸，得到全保护亮丙瑞林肽链-氯树脂；用切割试剂和乙醚进行切割沉降，并采用反相高效液相色谱法纯化得到亮丙瑞林纯品多肽。本发明大大简化了工艺流程，缩短了生产时间，降低了生产成本，提高了反应缩合效率和纯品收率，亮丙瑞林纯品收率达到85％，并且单杂小于0.5％，具有可观的市场竞争力和应用前景。
以上内容仅仅是对本发明所作的举例和说明，所属本技术领域的技术人员对所描述的具体实施例做各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离发明或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。