1.一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组,其特征在于,所述引物组由内外两套引物组成,外套引物由外套上游引物和外套下游引物组成,内套引物由内套上游引物和内套下游引物组成,各引物的核苷酸序列如下所示:
外套上游引物:5’-AGRCCAGACTGGTGGCCNTAYGA-3’,其为SEQ ID NO:1序列;
外套下游引物:5’-TTYACCACTTCTGTTCTCA-3’,其为SEQ ID NO:2序列;
内套上游引物:5’-TCRWCAACCAAYGAGATAGGG-3’,其为SEQ ID NO:3序列;
内套下游引物:5’-CACAGYCCRAAYCCRAAGTCATC-3’,其为SEQ ID NO:4序列;
其中,兼并碱基R表示A或G碱基,N表示A、C、G或T碱基,Y表示T或C碱基,W表示A或T碱基。
2.根据权利要求1所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的引物组在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。
3.一种诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包含权利要求1所述的引物组。
4.根据权利要求3所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒,其特征在于,外套上游引物和外套下游引物的摩尔比为1:1;内套上游引物和内套下游引物的摩尔比为1:1。
5.根据权利要求3所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒还包括阴性对照、阳性对照、2×PCR Mixture。
6.根据权利要求5所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒,其特征在于,所述阴性对照为无DNA酶的ddH2O;所述阳性对照为含有猪瘟病毒E2基因片段的克隆质粒pEASY-T1-CSFV671,阳性对照pEASY-T1-CSFV671质粒的终浓度范围为1.0×106copies/μl~1.0×107copies/μl;所述猪瘟病毒E2基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
7.根据权利要求6所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒,其特征在于,所述克隆质粒采用以下方法制备得到:利用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列扩增猪瘟病毒E2基因片段,回收片段与pEASY-T1载体连接,筛选阳性克隆,测序正确的克隆质粒命名为pEASY-T1-CSFV671。
8.根据权利要求3-7任一项所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒在制备诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株试剂中的应用。
9.一种如权利要求3-7任一项所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的使用方法,其特征在于,包括以下步骤:
a.采集经猪瘟疫苗免疫的同一头母猪分娩的所有同窝仔猪的脐带血,同窝仔猪的脐带血混合后作为样品;
b.提取步骤a中的样品的RNA;
c.以步骤b得到的RNA为模板,使用逆转录试剂盒通过逆转录,得到cDNA;
d.以步骤c得到的cDNA为模板,采用SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的引物序列经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物;
e.以步骤d得到的第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板,采用SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示的引物序列经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物;
f.采用琼脂糖凝胶电泳法对第二轮PCR扩增产物进行分析:①有扩增产物,扩增产物长度为272bp,且阴性对照和阳性对照均成立,则表明所检测的脐带血样品中有猪瘟病毒野毒感染;②没有扩增产物,且阴性对照和阳性对照均成立,则表明所检测的脐带血样品中没有猪瘟病毒野毒感染,猪瘟疫苗免疫成功。
10.根据权利要求9所述的诊断猪脐带血猪瘟病毒野毒株的试剂盒的使用方法,其特征在于,第一轮PCR扩增时,PCR反应体系以25μL计为:
10umol/LSEQ ID NO:1所示的上游引物:0.5μL;
10umol/LSEQ ID NO:2所示的下游引物:0.5μL;
2×PCR Mixture:12.5μL;
200ng/μL的cDNA模板:2μL;
ddH2O:补足至25μL;
第二轮PCR扩增时,PCR反应体系以25μL计为:
10umol/LSEQ ID NO:3所示的上游引物:0.5μL;
10umol/LSEQ ID NO:4所示的下游引物:0.5μL;
2×PCR Mixture:12.5μL;
第一轮PCR扩增产物的稀释液:2μL;
ddH2O:补足至25μL;
所述第一轮PCR扩增产物的稀释液为第一轮PCR扩增产物用ddH2O做10倍稀释得到的稀释液;
第一轮PCR和第二轮PCR反应条件均为:95℃预变性5min;94℃变性20Sec,57℃退火30Sec,72℃延伸30Sec,共35个循环;然后72℃延伸10min,最后4℃保护,结束反应。