本发明属于病原微生物学领域，具体涉及一种选择性分离培养B群链球菌的培养基及其制备方法。
背景技术：
B群链球菌是一种常见的条件致病菌，是引起产褥期发热的常见病原体，无论孕妇以哪种方式分娩，这些细菌都可以引起产褥感染。B族链球菌引起的产褥感染大多呈单一细菌感染，症状出现早，高热(>38.8℃)、心动过速等；B族链球菌也是引起孕妇菌血症和伤口感染的主要致病菌，还可发生链球菌性肺炎、脑膜炎、肝脓肿和败血症等，死亡率较高，有报道其死亡率可达29％～52％；胎儿和新生儿B族链球菌感染B族链球菌的宫内感染可以引起胎死宫内，但最常见病变是新生儿脓毒血症：(1)早发性B族链球菌感染一般在产后7天内发病，2/3的病例感染症状出现在产后6小时。新生儿感染主要表现为菌尿或败血症(30％～40％)、肺炎(30％～40％)以及脑膜炎(30％)，发病早者出生时即发生呼吸窘迫综合征。(2)晚发性感染除了早发性感染外，新生儿晚发性B族链球菌感染也是一种常见的类型。晚发性感染往往在产后第1周之后甚至出生10天多后才开始发病。主要以脑膜炎和败血症为主，并且有并发脑膜炎后遗症的危险。引起脑膜炎的最常见血清型是B族链球菌Ⅲ型，占脑膜炎的90％。
在临床样本检验中，常常通过使用血液琼脂培养基培养从检测样本中的众多菌落中挑取高度怀疑的菌落进行分离培养，并在确认所培养聚落无杂菌污染后，再对该培养菌落进行系统鉴定和药物敏感性实验。该传统检测方法检测时间常常达72小时或以上，耗时较长。目前虽然有商业化显色性培养基可以缩短细菌培养鉴定时间、方便观察，但是针对B群链球菌的显色培养基尚未看到文献报道，而且B群链球菌营养需要较高，形成菌落时间稍长，常常被其他杂菌覆盖住，临床阳性率不高。
细菌产生自诱导物质(autoinducers，AIs)作为细菌间相互联系的信号分子，其浓度随着细菌的增殖而升高。由于该信号分子能自由通过细胞膜，因此细胞内外的浓度相近。当该信号分子浓度达到一定范围，能激活细菌胞内的受体，从而改变基因表达，调控细菌的生物行为，如产生毒素、形成生物膜、生成孢子和产生荧光等，这种现象就是群体感应(quorum sensing，QS)。目前研究较多的革兰阳性菌的群体感应物质为寡肽，具有菌种特异性，能促进细菌代谢，但是由于该类群体感应物质分子量及其相近，分离纯化难度大，纯化成本较高。另外，细菌的群体感应物质是极为复杂的，人为地往培养基中添加一种单一物质，在不同条件下效果会不一样。
技术实现要素：
为克服上述技术缺陷，本发明提供了一种选择性分离培养B群链球菌的显色培养基及其制备方法，具有缩短检测时间、灵敏度高和配制方法简便等特点。
本发明目的是通过采用以下技术方案实现的：
一种选择性分离培养B群链球菌的培养基，其特征在于，所述培养基包括B群链球菌选择性显色基础培养基、培养上清液、蒸馏水和抗生素组合。
所述培养上清液为处于对数生长期的B群链球菌的培养上清液；
所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19-1:4；
所述抗生素组合中的各抗生素的添加量均为0.005-0.1g/L。
优选的，所述B群链球菌选择性显色基础培养基的配方为葡萄糖2.5g、二磷酸二钠1g、硫酸镁7水合物0.41g、结晶紫0.0002g、琼脂3g、示蛋白胨25g、可溶性淀粉20g、4-丙磺酸基吗啉11g、磷酸氢二钠8.5g、酵母浸出液2g。
优选的，所述上清液中含有B群链球菌分泌的群体感应物质，所述群体感应物质为B群链球菌分泌的寡肽。
优选的，所述抗生素组合包括氨甲蝶呤、硫酸粘杆菌素、甲硝唑。
优选的，所述抗生素的添加量均为0.005-0.01g/L。
优选的，所述培养基的制备方法包括如下步骤：
(1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养B群链球菌至对数生长期，离心，取上清液，经细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm)除菌，收集滤液即为无菌培养上清液；
(2)按B群链球菌选择性显色基础培养基的配方称取葡萄糖2.5g、二磷酸二钠1g、硫酸镁7水合物0.41g、结晶0.0002g、琼脂3g、示蛋白胨25g、可溶性淀粉20g、4-丙磺酸基吗啉11g、磷酸氢二钠8.5g、酵母浸出液2g，溶于1L蒸馏水中，加热混匀，121℃高压灭菌25min；冷却到60℃左右后添加无菌培养上清液，所述培养上清液与蒸馏水的体积比为1:19-1:4；同时添加氨甲蝶呤、硫酸粘杆菌素、甲硝唑，添加量为0.005-0.01g/L。
优选的，步骤(2)中所述培养上清液与所述蒸馏水的体积比为1:9；步骤(3)中所述抗生素的添加量为氨甲蝶呤0.006g/L、硫酸粘杆菌素0.005g/L、甲硝唑0.01g/L。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明培养基利用了培养上清液中的群体感应物质寡肽，可促进B群链球菌进入对数增生期，缩短菌落开始形成时间，缩短检测时间。
(2)本发明培养基利用细菌的生化反应产物以及pH值变化，形成有色菌落方便观察。
(3)本发明培养基包括抗生素组合，能抑制除B群链球菌的大部分其他杂菌生长，达到选择性分离培养B群链球菌的目的，特异性强，灵敏度高。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
实施例1：哥伦比亚血平板和B群链球菌选择性显色基础培养基对比测试
1、哥伦比亚血平板购自安图生物科技有限公司
2、B群链球菌选择性显色基础培养基：葡萄糖2.5g、二磷酸二钠1g、硫酸镁7水合物0.41g、结晶紫0.0002g、琼脂3g、示蛋白胨25g、可溶性淀粉20g、4-丙磺酸基吗啉11g、磷酸二氢钠8.5g、酵母浸出液2g，溶于1L蒸馏水中，加热混匀，于121℃高压灭菌25min后冷却到60℃，添加经细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm)除菌的抗生素：氨甲蝶呤0.006g/L、硫酸粘杆菌素0.005g/L、甲硝唑0.01g/L，浇注到无菌平板上，室温冷却，获得B群链球菌选择性显色基础培养基琼脂平板，设为实验组。
3、取添加B群链球菌的痰液标本(100份)分别在以上两种琼脂平板上，36℃-37.5℃培养24小时后，观察菌落形态，寻找表面光滑、圆形、灰白色、半透明或不透明的菌落。发现哥伦比亚血平板菌落形态多样，溶血环形态各异，灰白色菌落很少；B群链球菌选择性显色基础培养基菌落显示橙色或橙红色，表面光滑；选取两种培养基上的不同菌落进行菌种鉴定(梅里埃VITEK 2 Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统)，哥伦比亚血平板上的优势菌落以草绿色链球菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷博菌为主，B群链球菌选择性显色基础培养基生的菌落全部为B群链球菌。
实验结果表明B群链球菌选择性显色基础培养基可以选择性培养B群链霉菌，抑制其他杂菌的生长(表1)。
实施例2：B群链球菌选择性显色基础平板培养基和添加培养上清液的B群链球菌选择性显色基础平板培养基对比测试
1、配制添加B群链球菌培养上清液的B群链球菌选择性显色琼脂平板
(1)采用脑心浸液肉汤(BHI)液体培养基接种培养B群链球菌(CM0109株)至对数生长期，10000g离心5分钟，取上清液，经细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm)除菌，获得培养上清液。
(2)B群链球菌选择性显色基础培养基：葡萄糖2.5g、二磷酸二钠1g、硫酸镁7水合物0.41g、结晶紫0.0002g、琼脂3g、示蛋白胨25g、可溶性淀粉20g、4-丙磺酸基吗啉11g、磷酸氢二钠8.5g、酵母浸出液2g，溶于1L蒸馏水中，加热混匀，于121℃高压灭菌25min后冷却到60℃，添加经细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm)除菌的抗生素：氨甲蝶呤0.006g/L、硫酸粘杆菌素0.005g/L、甲硝唑0.01g/L，浇注到无菌平板上，室温冷却，获得B群链球菌选择性显色基础培养基琼脂平板，设为对照组。
(3)添加B群链球菌培养上清液的B群链球菌选择性显色基础培养基：葡萄糖2.5g、二磷酸二钠1g、硫酸镁7水合物0.41g、结晶紫0.0002g、琼脂3g、示蛋白胨25g、可溶性淀粉20g、4-丙磺酸基吗啉11g、磷酸氢二钠8.5g、酵母浸出液2g，溶于900ml蒸馏水中，加热混匀，于121℃高压灭菌25min后冷却到60℃，添加培养上清液100ml，同时添加经细菌过滤器(滤膜孔径为0.22μm)除菌的抗生素：氨甲蝶呤0.006g/L、硫酸粘杆菌素0.005g/L、甲硝唑0.01g/L，浇注到无菌平板上，室温冷却，获得B群链球菌选择性显色基础培养基琼脂平板，设为实验组。
2、从临床样本中分离纯化获得的123株B群链球菌(经梅里埃VITEK 2Compact全自动细菌鉴定及药敏分析系统鉴定)，分别在以上两种琼脂平板上进行培养，每6小时观察1次菌落，发现实验组12小时后开始出现橙红色或橙色针尖样点状物，对照组未见菌落，24小时后两组均有菌落，菌落大小虽然相似，实验组肉眼观察颜色更深(详见表二)。
实验结果说明培养上清液中所含细菌群体感应物质能促进B群链球菌代谢，可提前显示菌落颜色，同时菌落颜色更鲜明，利于观察。并且经过多次试验验证，发现进入对数生长期后的细菌分泌该类信号分子活动最为活跃，且分泌于上清液中的感应物质浓度和活性最佳，因此本发明创造采用进入对数生长期的B群链球菌的培养上清液作为本发明培养基中的关键组分。
实施例3：普通BHI培养基和添加培养上清液的BHI培养基对比测试
1、配制普通BHI培养基：称取商品化的BHI干粉(青岛海博生物技术有限公司)38.5g、溶于1L蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min后分注到L形管设为对照组。
2、配制添加培养上清液的BHI培养基
(1)称取商品化的BHI干粉(青岛海博生物技术有限公司)38.5g、溶于900ml蒸馏水中，混匀，于121℃高压灭菌25min，冷却后添加实施例2获得的培养上清液100ml，分注到L形管作为对照组。
3、取麦克法兰OD0.5的B群链球菌菌液接种10ul，静置培养24小时，每4小时测定一次OD，实验组进入对数生长期时间较对照组加快，维持对数生长期时间长(表三)。
实施例4：添加培养上清液的选择性分离培养B群链球菌琼脂平板的保质期测试
1、将实施例2中所制备的未经测试的添加培养上清液的选择性分离培养B群链球菌琼脂平板空白平板于4℃冰箱中储存一周、1个月和3个月后取出培养基平板，作为试验组。
2、现场制备无添加培养上清液的选择性分离培养B群链球菌琼脂平板培养基，作为对照组。
3、分别在以上两种培养基平板接种从临床样本中分离纯化获得的B群链球菌，培养24h后，观察这些细菌是否能在这两种培养基平板上生长及其生长形态。
测试结果显示，添加培养上清液的选择性分离培养B群链球菌琼脂平板上的菌落大小和现场制备无添加培养上清液的选择性分离培养B群链球菌琼脂平板上的菌落大小无差异，肉眼观察颜色更深。说明该选择性分离培养B群链球菌的琼脂平板在储存上述时间后仍有效，说明本发明培养基耐储存，保存性能良好。
实施例5：阴性对照试验
进行实施例2的同时进行了阴性对照试验，在选择性分离培养B群链球菌琼脂平板(添加抗生素组合)，接种临床分离的耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、超广谱β-内酰胺酶(ESBLs酶)阳性大肠杆菌、肺炎克雷博菌、表皮葡萄球菌、屎肠球菌、粪肠球菌、不动杆菌，均未见生长，说明本发明培养基特异性较好。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对发明专利保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明做了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，在不脱离本发明技术方案的实质和范围的前提下，还可以对本发明的技术方案做出修改或者等同替换，这些都属于本发明的保护范围。
附
表一：哥伦比亚血平板的选择性显色B群链球菌分离培养琼脂平板对比测试结果
表二：B群链球菌选择性显色基础平板培养基和添加培养上清液的B群链球菌选择性显色基础平板培养基对比测试
表三：普通BHI培养基和添加培养上清液的BHI培养基对比测试