本发明涉及一种提高水蛭透明质酸酶酶活的方法，属于酶工程技术领域。
背景技术：
透明质酸酶是一类主要降解HA的酶的总称，于1928年被Duran Reynals发现并称为“扩散因子”，1940年被Chain和Duthie正式命名为透明质酸酶(hyaluronidase,HAase)。HAase广泛存在于真核生物和原核生物中，是一种重要的生理活性物质并在动物机体内参与许多重要的生物学过程，例如细胞分裂、细胞间的连接、生殖细胞的活动、DNA的转染、胚胎发育、受伤组织的修复以及正常细胞和肿瘤细胞增生等。根据HAase的来源、催化机制和底物与产物特异性，HAase可以分为三类：内切-β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.35，主要存在于哺乳动物以及蜜蜂、蛇、蜘蛛等毒液)、内切-β-葡萄糖醛酸苷酶(EC 3.2.1.36，主要存在于水蛭)以及HA裂解酶(EC 4.2.2.1，主要存在于细菌、噬菌体以及真菌)。
第一类HAases和第三类HA裂解酶的相关研究已有较多文献报道。第一类是来源于哺乳动物的透明质酸4-糖基水解酶家族，这类HAase(EC 3.2.1.35)是具有水解和转糖苷活性的糖苷酶，通过水解HA的β-1,4-糖苷键，产物以四糖HA分子为主。也可作用于硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素产生硫酸皮肤素产物。第一类中比较常见的有来自于哺乳动物的睾丸、蛇毒、蜂毒以及溶菌体的HAases。第三类为微生物HAases，这类HAase(EC 4.2.2.1)通过β-消除反应裂解HA的β-糖苷键，产生以不饱和的双糖分子2-acetamido-2-deoxy-3-O-(β-D-gluco-4-enepyranosyluronic acid)-D-glucose为主要产物。这类HA裂解酶来源于包括Clostridium,Micrococcus,Streptococcus,和Streptomyces等菌株，并且它们的底物特异性也不同。第二类代表性的HAase(EC 3.2.1.36)主要来源于水蛭，属于透明质酸3-糖基水解酶家族，通过水解HA的β-1,3-糖苷键，生产以四糖分子HA且还原端带有葡萄糖醛酸为主的产物。水蛭来源的HAase对底物的专一性强，对硫酸软骨素、4-硫酸软骨素和6-硫酸软骨素不具有活性，并且不具有转糖苷活性。
HAase能够降低组织HA的黏稠性，从而提高组织中液体渗透能力。许多病理变化过程往往伴随着HAase和HA的变化，暗示它们可能起着重要的作用。同时HAase也可以改变机体内一些药物和生理活性物质的分布状况。因此，HAase作为一种药理活性物质可促使皮下输液、局部积贮的渗出液或血液加快扩散而利于吸收，广泛用作临床药物渗透剂、促进药物的吸收、促进手术及创伤后局部水肿或血肿消散。研究表明HAase对治疗心肌梗塞效果显著， 能够降解心肌HA显著减少间隙体积，阻止由缺血引起的动脉阻力增大，增加血流量。HAase在抗肿瘤方面也具有重要的作用，HAase能够促进癌细胞的转移，因此肿瘤细胞上结合的HAase可以作为肿瘤药物作用的靶点。如它可以加强阿霉素对乳腺癌的抗癌能力，降低膀胱癌的复发率等。此外，HAase在临床上也作为药物扩散助剂，眼科手术后用于降低眼内压，配合麻醉剂利多卡因盐酸盐使用可加快进入麻醉状态和延长麻醉时间。
水蛭HAase具有强力的抗菌活性，能溶解细菌体内外被膜形成的抗体，从而增强药物对宿主的治疗效果。特别是水蛭HAase由于其底物专一性强，与其它来源的HAase相比，它不能降解软骨素或硫酸软骨素。虽然哺乳动物HAase作为“扩散因子”被广泛应用于药物扩散助剂，然而这类HAase活性易受肝素抑制。因此，理论上来讲，水蛭HAase活性不受肝素影响，在临床上作为“药物扩散因子”、治疗血栓、青光眼和其它药用方面更具医疗价值意义。
技术实现要素：
本发明的第一个目的是提供一种酶活提高的透明质酸酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明的第二个目的是提供编码所述透明质酸酶突变体的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三个目的是提供表达所述透明质酸酶突变体的载体或细胞系。
本发明的第四个目的是提供一种产透明质酸酶的基因工程菌，是以枯草芽孢杆菌为宿主，以pPNMK为载体，表达所述透明质酸酶突变体。
在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌为Bacillus subtilis168。
本发明的第五个目的是提供一种提高透明质酸酶酶活的方法，是将SEQ ID NO.2所示透明质酸酶氨基酸序列的L50-G57区域替换为SLESISPS，并将K120-R125替换为SKSKMQ，并将K163-D167区域替换为EGYGS，并将P280-W287区域替换为RHKDKPTG，并将V307-L313区域替换为WSGFLNI，并将T344替换为K344。
本发明的第六个目的是提供一种提高透明质酸酶酶活的生产方法，是将所述基因工程菌接种至发酵培养基中，在30～37℃培养16～72h。
本发明还提供所述透明质酸酶在食品、生物、化工、医药领域的应用。
在本发明的一种实施方式中，所述应用包括制备含透明质酸的医药配制品、保健品、化妆品。
有益效果：采用本发明的方法构建的基因工程菌MHyal培养48小时后发酵酶活达到6030U/mL，与对照菌株相比酶活提高了500U/mL。
附图说明
图1为突变菌株和野生菌株的酶活变化趋势图。
具体实施方式
透明质酸酶的DNS检测分析方法：
透明质酸酶专一作用于透明质酸的葡萄糖苷酸键，产生具有还原端为葡萄糖醛酸小分子多糖。采用3，5—二硝基水杨酸(DNS)比色法测定水解透明质酸产生的还原糖当量，用分析纯葡萄糖作标准曲线，计算酶活，用pH 5.5、50mM的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液配制2mg mL–1的透明质酸底物，1mL反应体系含有800μL的透明质酸溶液、100μL的酶液，缓冲液补足至1mL。在38℃反应20min，立即沸水终止反应，采用DNS法测定产生的还原糖当量(相当于等量葡萄糖的还原力)，计算酶比活。为确保数据准确可靠，DNS的吸光值控制在0.25-0.85之间。
表1引物
实施例1：采用突变的方法对功能区域进行突变
在SEQ ID NO.1所示透明质酸酶的基础上，进行定点饱和突变。以Hyal基因(SEQ ID NO.4所示)为模板，设计引物，分别以F0和R2、F1和R4、F3和R6、F5和R0为引物(如表1所示)，进行PCR。具体操作程序如下：以Hyal基因为模板(SEQ ID NO.4所示基因)1μmol、上下游引物各1μL、Primestar 25μL、无菌水22μL，混合于PCR管内，混匀后置于PCR仪，按如下程序运行：94℃3min，[94℃30s，55℃30s，72℃30s]×30,72℃5min。将PCR产物进行柱回收，回收产物进行Gibson重组，操作程序如下：加入PCR产物(体积＝0.02×片段长度/DNA浓度μL)，ExnaseII加入2μL，5×CE buffer 1μL，加入无菌水补足10μL 体系，与质粒pPNMK在37℃30min，0℃5min连接，再将基因突变质粒pP43-MHyal转入大肠杆菌JM109，挑取长出的单菌落接种至含100μL/100mL氨苄的LB液体培养基中培养12h，离心收集菌体，提取质粒。
将提取的质粒pP43-MHyal转入Bacillus subtilis 168，挑取阳性克隆MHyal，并将其接种至含100μL/100mL的卡纳霉素抗性的LB液体培养基中培养12h，再将80μL菌液加入含800μL发酵培养基(发酵培养基组分为30g/L蔗糖、20g/L酵母膏、2g/L蛋白胨、15.6g/L磷酸氢二钠、5.94g/L磷酸二氢钾)的96深孔板，在37℃、220rpm条件下培养48h。将发酵液3000rpm离心20min，使用DNS的方法通过酶活进行筛选，筛选出酶活最高的菌株进行发酵，每隔一段时间取样、测酶活，并绘制出酶活变化趋势图(如图1所示)。
采用与基因工程菌相同的载体和宿主表达Hyal基因(SEQ ID NO.4所示)，以其作为对照菌株，其它实施方式与基因工程菌相同。
与对照菌株相比，本发明构建的基因工程菌MHyal培养48小时后发酵酶活达到6030U/mL，相比对照菌株提高了500U/mL(酶活提高了10％)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种提高水蛭透明质酸酶酶活的方法
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<170> PatentIn version 3.3
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