本发明涉及生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌，以及利用该重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法和用途。
背景技术：
3-羟基丙酸(缩写为3-hp)具有羧基和羟基两种官能团，与乳酸互为同分异构体，但是和乳酸相比，3-羟基丙酸的化学性质更为活泼。3-羟基丙酸作为一种重要的平台化合物，具有很多用途，例如，作为很多光学活性物质的前体，用于医药、农药、表面活性剂的生产，其中在医药方面可用于抗癌药环磷酰胺、心可安、泛酸、泛醇以及许多新药的合成中。同时，3-羟基丙酸也是合成丙烯酸、丁二酸、1,3-丙二醇以及特种聚酯等的原料。
生物法制备3-羟基丙酸由于其副产物少、环境友好且产物易分离等优势而备受关注。野生菌和基因工程菌都可以用于生物法生产3-羟基丙酸，它们的代表性例子包括假丝酵母、基因工程大肠杆菌和肺炎克雷伯菌等等。基因工程菌相比于野生菌具有生长迅速、基因背景清晰、副产物较少等优点。
用于生物法生产3-羟基丙酸的底物可以采用丙酸、丙烯酸、甘油、葡萄糖等等。用甘油作为底物生产3-羟基丙酸的产量比较可观，但是这种方法存在的一个弊端是在菌体代谢过程中需要添加价格昂贵的b12作为辅酶，这使得生产成本较高。以葡萄糖为底物生产3-羟基丙酸时原料成本低，但是，3-羟基丙酸的产量相对较低。
技术实现要素：
本发明提供了一种生产3-羟基丙酸的重组大肠杆菌，利用该重组大肠杆菌可以同时以葡萄糖和丙酸为底物高效低成本地制备3-羟基丙酸。
因此，本发明的一个方面提供了一种包含丙酰辅酶a脱氢酶基因、乙酰辅酶a羧化酶基因和丙二酰辅酶a还原酶基因的重组大肠杆菌。
本发明的重组大肠杆菌还可以包含丙酸辅酶a转移酶基因、3-羟基丙酰辅酶a脱氢酶基因。
本发明的另一方面提供了利用本发明的重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法，其中以葡萄糖和丙酸为底物。
本发明的再一方面提供了本发明的重组大肠杆菌在生产3-羟基丙酸中的用途。
具体实施方式
本申请的发明人发现通过在作为宿主菌的重组大肠杆菌中引入丙酰辅酶a脱氢酶基因、乙酰辅酶a羧化酶基因和丙二酰辅酶a还原酶基因，也就是说，重组菌株不仅可以进行以丙酸为底物生产3-羟基丙酸的代谢途径，而且可以进行以葡萄糖为底物生产3-羟基丙酸的代谢途径，当同时以丙酸和葡萄糖为底物时，3-羟基丙酸产量远远大于单独以丙酸为底物时或者单独以葡萄糖为底物时的3-羟基丙酸产量。
上述重组大肠杆菌的制备方法如下：
(1)利用rt-pcr技术从皱褶假丝酵母mrna中扩增出如seqidno.1所示含1329个碱基对的丙酰辅酶a脱氢酶基因pacd，将其插入表达载体pacycduet-1中，得到重组质粒pacycduet-pacd。将所得重组质粒转化e.colijm109(de3)，通过含氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd。
(2)获取包含如seqidno.2所示含6638个碱基对的乙酰辅酶a羧化酶基因acc的重组质粒pcs11(根据以下文献获得：weatherlysc,volrathsl,elichtd.expressionandcharacterizationofrecombinantfungalacetyl-coacarboxylaseandisolationofasoraphen-bindingdomain.biochemicaljournal,2004,380(1):105-110.)。利用pcr技术从橙色绿屈挠菌基因组中扩增出如seqidno.3所示含3660个碱基对的丙二酰辅酶a还原酶基因mcr，将其插入到表达载体pet-28a中，得到重组质粒pet28-mcr。将重组质粒pet28-mcr和表达载体pbad18用xbaⅰ和hindⅲ双酶切后连接，得到重组质粒pbad18-mcr。将重组质粒pcs11和重组质粒pbad18-mcr转化e.colijm109(de3)，筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pcs11/pbad18-mcr。
(3)将重组质粒pacycduet-pacd转入重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pcs11/pbad18-mcr中，得到本发明的重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
也可以进行以下操作中的任一种：
(a)利用pcr技术扩增来自埃氏巨球菌(atcc17753)基因组dna的如seqidno.4所示含1554个碱基对的丙酸辅酶a转移酶(pct)基因pct，将其插入表达载体pet-28a中，得到重组质粒pet28-pct。利用pcr技术扩增来自橙色绿曲挠菌(atcc29365)基因组dna的如seqidno.5所示含945个碱基对的3-羟基丙酰辅酶a脱氢酶(hpcd)基因hpcd，将其插入到重组载体pet28-pct的多克隆位点，得到重组质粒pet28-pct-hpcd。将所得重组质粒pet28-pct-hpcd转化e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd，筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pet28-pct-hpcd。
(b)利用如seqidno.6所示含70个碱基对的引物ygfh-fp和如seqidno.7所示含70个碱基对的引物ygfh-rp，采用文献(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000；97(12):6640-5.)的方法，对大肠杆菌jm109(de3)的丙酰辅酶a:琥珀酰辅酶a转移酶(ygfh)基因进行了敲除，获得了jm109(de3)-δygfh宿主菌。利用如seqidno.8所示含71个碱基对的引物prpc-fp和如seqidno.9所示含70个碱基对的引物prpc-rp，采用文献(datsenkoka,wannerbl.one-stepinactivationofchromosomalgenesinescherichiacolik-12usingpcrproducts.procnatlacadsciusa.2000；97(12):6640-5.)的方法，对大肠杆菌jm109(de3)-δygfh的甲基枸橼酸合成酶(prpc)基因进行了敲除，获得了jm109(de3)-δygfh-δprpc宿主菌。将重组质粒pacycduet-pacd、pcs11、pbad18-mcr转化到jm109(de3)-δygfh-δprpc宿主菌，获得了目标重组菌jm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
利用本发明的重组大肠杆菌生产3-羟基丙酸的方法可以按照常规基因工程菌发酵制备3-羟基丙酸的方法进行，下面的描述给出了优选的实施方式。
(1)种子液的培养：将接种后的培养液在37℃，摇床转速200r/min的条件下培养12-16小时；所述培养液组成为：蛋白胨5-10g/l，nacl5-10g/l，酵母膏1-5g/l，卡那霉素浓度0-50mg/l，氨苄青霉素0-50mg/l，氯霉素浓度0-34mg/l。
(2)发酵培养：培养条件为接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6-0.8时加入iptg至终浓度为10-100μm、阿拉伯糖终浓度为0-20mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达6-12小时，加入丙酸1-10g/l、葡萄糖4-10g/l、nahco30-2g/l、生物素0-25mg/l转到37℃培养，发酵培养25小时；所述发酵培养基组成：蛋白胨5-10g/l，nacl5-10g/l，酵母膏1-5g/l，葡萄糖0-10g/l，丙酸0-10g/l，卡那霉素浓度0-50mg/l，氨苄青霉素0-50mg/l，氯霉素浓度0-34mg/l。
实施例
以下通过实施例将更详细地描述本发明。
基因工程菌的构建：
1：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr的构建
根据genebank公布的皱褶假丝酵母中pacd基因的序列设计引物：
p1其中划线部分为ndei酶切位点
5’-ggtactccatatgtcgattaaggacg-3’(seqidno.10)
p2其中划线部分为xhoi酶切位点
5’-ccgctcgagttacaacttggccaac-3’(seqidno.11)
利用rt-pcr技术，扩增出目的片段插入表达载体pacycduet-1中，得到重组质粒pacycduet-pacd。通过基因测序，获得如seqidno.1所示的pacd基因序列。
根据橙色绿屈挠菌基因组中mcr基因的序列设计引物：
p3其中划线部分为bamhi酶切位点
5’-ctcggatccatgagcggaacaggacgact-3’(seqidno.12)
p4其中划线部分为hindⅲ酶切位点
5’-cctaagcttacacggtaatcgcccgtcc-3’(seqidno.13)
利用pcr技术从橙色绿屈挠菌基因组中扩增出目的片段，将其插入到克隆载体pbsⅱ-t中，得到重组质粒pbs-mcr。通过基因测序，获得如seqidno.3所示的mcr基因序列。将获得的重组质粒pbs-mcr和载体pet-28a利用bamhⅰ和hindⅲ双酶切后连接，得到重组质粒pet28-mcr。将重组质粒pet28-mcr和表达载体pbad18利用xbaⅰ和hindⅲ双酶切后连接，得到重组质粒pbad18-mcr。将两个重组质粒pcs11和pbad18-mcr转化e.colijm109(de3)，通过含卡那霉素和氨苄青霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pcs11/pbad18-mcr。
将重组质粒pacycduet-pacd转化e.colijm109(de3)，通过含氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd。
将重组质粒pacycduet-pacd转化e.colijm109(de3)/pcs11/pbad18-mcr，通过含卡那霉素、氯霉素和氨苄青霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
2:e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pet28-pct-hpcd的构建
根据genebank公布的埃氏巨球菌(atcc17753)中丙酸辅酶a转移酶(pct)基因pct的序列设计引物：
pct-ndeι-fp其中划线部分为ndei酶切位点
5’-ccaatctccatatgagaaaagtagaaatcatta-3’(seqidno.14)
pct-bamhι-rp其中划线部分为bamhι酶切位点
5’-tatggatccttattttttcagtcccatggga-3’(seqidno.15)
利用pcr技术，扩增出目的片段插入表达载体pet-28a中，得到重组质粒pet28-pct。对重组质粒pet28-pct测序获得如seqidno.4所示的pct基因序列。
根据genebank公布的橙色绿曲挠菌(atcc29365)中3-羟基丙酰辅酶a脱氢酶(hpcd)基因hpcd的序列设计引物：
hpcd-ndeι-fp其中划线部分为ndei酶切位点
5’-ccaatctccatatgagtgaagagtctctg-3’(seqidno.16)
hpcd-bamhι-rp其中划线部分为bamhι酶切位点
5’-tatggatccagatcgcaatcgctcgtg-3’(seqidno.17)
利用pcr技术扩增来自橙色绿曲挠菌(atcc29365)基因组dna的如seqidno.5所示含945个碱基对的3-羟基丙酰辅酶a脱氢酶(hpcd)基因hpcd，将其插入到克隆载体pbsⅱ-t中，得到重组质粒pbs-hpcd。将获得的重组质粒pbs-hpcd和载体pet-28a用ndeι和bamhⅰ双酶切后连接，得到重组质粒pet28-hpcd。将重组质粒pet28-hpcd用bglⅱandecorⅰ酶切获得的dna片段，和重组载体pet28-pct用bamhⅰ和ecorⅰ双酶切后获得的dna片段进行连接，得到重组质粒pet28-pct-hpcd。
将所得重组质粒pet28-pct-hpcd转化e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd，通过含卡那霉素和氯霉素的培养基筛选获得重组大肠杆菌e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pet28-pct-hpcd。
3：e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr的构建
利用red重组技术，用卡那霉素抗性基因替换大肠杆菌e.colijm109(de3)基因组上的ygfh基因以及prpc基因，然后通过质粒pcp20表达的flp内切酶消除卡那霉素抗性基因，分别得到敲除ygfh基因、prpc基因，以及两种基因共同敲除大肠杆菌工程菌e.colijm109(de3)-δygfh、e.colijm109(de3)-δprpc以及e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc。
将三个重组质粒pcs11、pbad18-mcr和pacycduet-pacd通过化学法转化大肠杆菌工程菌e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc，涂布于含有氯霉素、卡那霉素和氨苄青霉素的lb培养基上，得到阳性克隆e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
3-羟基丙酸的生产：
实施例1：以葡萄糖和丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr
(2)发酵培养基：丙酸1g/l，葡萄糖4g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l，氯霉素浓度34mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l、葡萄糖4g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为14.2mm。
实施例2：以葡萄糖和丙酸为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr
(2)发酵培养基：丙酸1g/l，葡萄糖4g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l,酵母膏5g/l，卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l，氯霉素浓度34mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.8时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l、葡萄糖4g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为21.49mm。
对比例1：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，丙酸1g/l，氯霉素浓度34mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为0.24mm。
对比例2：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pet28-pct-hpcd
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，丙酸1g/l，氯霉素浓度34mg/l，卡那霉素50mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为0.47mm。
对比例3：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，丙酸1g/l，氯霉素浓度34mg/l，卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为2.52mm。
对比例4：仅以丙酸作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
(2)发酵培养基：蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，丙酸1g/l，氯霉素浓度34mg/l，卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入丙酸1g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为4.69mm。
对比例5：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pcs11/pbad18-mcr
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l，卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为2.69mm。
对比例6：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l,卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l，氯霉素浓度34mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为6.68mm。
对比例7：仅以葡萄糖作为底物摇瓶发酵
(1)菌株：e.colijm109(de3)-δygfh-δprpc/pacycduet-pacd/pcs11/pbad18-mcr。
(2)发酵培养基：葡萄糖4g/l，蛋白胨10g/l，nacl10g/l，酵母膏5g/l,卡那霉素浓度50mg/l，氨苄青霉素50mg/l，氯霉素浓度34mg/l。
(3)发酵条件：接种种子液的量为占培养基体积的1％，发酵温度37℃，待od600在0.6时加入iptg至终浓度为100μm、阿拉伯糖终浓度为6.7mm，转到25℃培养。待诱导目的蛋白表达12小时，加入葡萄糖4g/l，转到37℃发酵培养25小时。用高效液相色谱检测法检测产物3-羟基丙酸的浓度。
(4)发酵结果：3-羟基丙酸产量为8.12mm。
最后所应说明的是：以上实施例仅用以说明而非限制本发明的技术方案，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应该理解：依然可以对本发明进行修改或者等同替换；而不脱离本发明的精神和范围的任何修改或局部替换，均应涵盖在本发明的范围内。
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