一株用于根腐病和青枯病的生物防治的芽孢杆菌的制作方法

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株用于根腐病和青枯病的生物防治的芽孢杆菌菌株fjat-19708。

背景技术：

根腐病是一种系统感染病害，是来蒙、大豆、小麦、番茄、棉花、草莓等植物的常见土传病害，在美国、加拿大、澳大利亚、中国等是一个日益突出的问题。植株由于根腐病，叶片变小，缺少光泽，枝条矮化，果实瘦小，或叶片变黄萎蔫，严重时植株逐渐枯死。根腐病的主要病原种群是尖孢镰刀菌fusariumoxysporum和腐皮镰刀菌fusariumsolani，防治的方法有化学试剂、真菌剂、生物防治、植物性治疗药物、优化施肥等，而采用生防菌控制根腐病是综合防治的一条重要措施。

多种真菌、细菌和一些放线菌都可应用于真菌病害的生物防治，拮抗性细菌有短短芽孢杆菌、绿叶假单胞菌、枯草芽孢杆菌等。细菌在植物生物防治中的应用研究已广泛开展，并取得良好的应用效果。但是，这些细菌对植物根腐病却没有很好的防治效果。

青枯病是由青枯雷尔氏菌ralstoniasolanacearum引起的一种毁灭性土传病害，广泛分布在热带和亚热带地区。该病害堪称“植物癌症”，一旦发病就难以控制，造成植株大面积枯萎死亡和产量的严重下降。尽管对作物青枯病的防治已有很多研究报道，如栽培措施、作物轮作及品种抗性选择等，但尚未出现有效的防治措施。

因此，筛选到防效好、适应性广的生防菌是植物病原菌生物防治工作面临的关键问题。

技术实现要素：

本发明的目的在于寻找新的生防资源，解决根腐病和青枯病的生物防治问题。

为了实现以上目的，本发明的技术方案如下：

一株用于根腐病和青枯病的生物防治的芽孢杆菌，所述的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌fjat-19708(bacillussubtilisfjat-19708)，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号cgmccno.14431，保藏日期为2017年7月17日，保藏地址为中国北京市中国科学院微生物研究所。

芽孢杆菌fjat-19708的菌落形态为：菌落较小、圆形、乳白色、表面光滑且湿润、隆起、边缘整齐、不透明。

芽孢杆菌fjat-19708不仅对尖孢镰刀菌、腐皮镰刀菌有较强的拮抗作用，而且对青枯雷尔氏菌也有较好的抑制效果。

本发明的有益效果是：

(1)从高海拔地区的土壤中筛选到的芽孢杆菌fjat-19708，对根腐病主要病原菌尖孢镰刀菌和腐皮镰刀菌都具有很强的抑制效果，而且对青枯雷尔氏菌也有较好的拮抗效果，因此，芽孢杆菌fjat-19708既可用于防治根腐病，又对青枯病有一定的防治效果。即用一种菌可同时防治两种植物病原菌，节约了微生物资源。

(2)芽孢杆菌fjat-19708是多种植物病原菌的拮抗菌，能有效预防和控制作物病害，是一种对环境友好、经济有效的防治病害的生防菌。芽孢杆菌fjat-19708能产生具有较强抗逆性的内生孢子(芽胞)，能耐盐、耐酸、耐高温且易于保存和运输，有利于快速实现商品化生产。

附图说明

图1芽孢杆菌fjat-19708的菌落形态

图2芽孢杆菌fjat-19708的16srrna序列鉴定结果的进化树

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步详细说明。

实施例1拮抗菌株的筛选

1.土样采集与芽孢杆菌分离纯化

从可可西里采集的草根土土壤样本风干，研磨后，制成土壤悬浊液，再经过无菌水适当稀释，涂布na平板；30℃培养72h，挑取单菌落，甘油保存，作为待测菌株。采用稀释涂板法分离纯化得到了63株菌株作为待测菌株。

2.尖孢镰刀菌生防菌株的筛选

(1)对峙法初筛

供试菌株番茄寄主尖孢镰刀菌fusariumoxysporumfjat-30512(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)，于牛肉膏蛋白胨培养基(na：牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖10g，琼脂粉1.7％，ph7.2-7.4)平板上活化，30℃恒温培养48h。尖孢镰刀菌fjat-30512于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(pda：马铃薯200.0g·l^-1，蔗糖20.0g·l^-1，琼脂17.5g·l^-1)上活化，28℃恒温培养48h。将活化后的fjat-30512接种于pda平板上，28℃培养120h至菌丝长满整个平板，然后用直径7mm的打孔器在菌饼上打下小菌圈，置于pda平板的正中间，再在距离小菌圈外围22mm的地方划线接种供试菌株。28℃恒温培养120h，观察菌株对尖孢镰刀菌fjat-30512的抑制效果。

从可可西里土壤样品分离纯化得到的63株菌株，进行平板对峙法初筛获得了14株对尖孢镰刀真菌fjat-30512有拮抗作用的菌株，菌株编号为：fjat-19699、fjat-19700、fjat-19704、fjat-19708、fjat-19711、fjat-20239、fjat-20264、fjat-20265、fjat-20267、fjat-21720、fjat-21739、fjat-21888、fjat-21902、fjat-22554。

(2)抑菌圈法复筛

将初筛中对尖孢镰刀菌具有抑制作用的14株菌株进行抑菌圈法复筛。将供试菌株接种到na平板上，再把单菌落接到500μlna液体培养基中，170r·min^-130℃恒温培养48h。将5ml尖孢镰刀菌fjat-30512的菌悬液(菌落密度4.0×10⁸cfu·ml^-1)与200ml50℃的pda半固体培养基混合后，倒入已制备好的pda固体培养基，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，用直径7mm的打孔器在平板上打孔，在孔内加入100μl供试菌株培养液，阴性对照为100μl无菌水，阳性对照为100μl潮霉素(质量浓度为5μg·ml^-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养5d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。这14株菌株的抑菌效果如表1所示。

表1芽孢杆菌对尖孢镰刀菌fjat-30512的抑菌作用

注：fjat-8784为对照菌株，保藏于瑞典哥德堡大学菌种保存中心(ccug)，编号ccug163。

3.腐皮镰刀菌生防菌的筛选

将对尖孢镰刀菌fjat-30512具有明显抑制效果的菌株进行腐皮镰刀菌fjat-176的抑菌实验。将供试菌株番茄寄主腐皮镰刀菌fusariumsolanifjat-176(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)接种到na平板上，再把单菌落接入到500μlna液体培养基中，170r·min^-130℃恒温培养48h。将5ml腐皮镰刀菌fjat-176的菌悬液(菌落密度1.7×10⁸cfu·ml^-1)与200ml50℃的pda半固体培养基混合后，倒入已制备好的pda固体培养基，制成含病原菌的双层平板；待培养基凝固后，用直径7mm的打孔器在平板上打孔，在孔内加入100μl供试菌株培养液，阴性对照为100μl无菌水，阳性对照为100μl潮霉素(质量浓度为3μg·ml^-1)，每个供试菌株重复3次，28℃恒温培养5d，用直径交叉法测量抑菌圈直径。

选择对尖孢镰刀菌fjat-30512抑菌圈直径平均值>6mm的5株菌株进行腐皮镰刀菌fjat-176生防菌的筛选，结果见表2，其中fjat-19708和fjat-20265共2株菌株的抑菌效果较好，抑菌圈直径均大于9.9mm。

表2不同菌株对腐皮镰刀菌fjat-176的抑菌圈直径

4.青枯雷尔氏菌生防菌的筛选

将用腐皮镰刀菌筛选到的2株菌株接种到na平板上，再把单菌落接入到500μlna液体培养基(牛肉膏3g，蛋白胨5g，葡糖糖10g，ph7.2-7.4)中，30℃170r·min^-1培养48h。

青枯雷尔氏菌fjat-91(保存在福建省农业科学院农业生物资源研究所)先在ttc平板(葡糖糖5g，蛋白胨10g，水解酪蛋白1g，琼脂粉1.7％，ph7.0-7.2)上活化，然后接入spa液体培养基(蔗糖2％，蛋白胨0.5g，kh2po40.05％，mgso40.0025％，ph7.0-7.2)中30℃170r·min^-1培养48h。在200ml的ttc半固体培养基(葡糖糖5g，蛋白胨10g，水解酪蛋白1g，琼脂粉0.85％，ph7.0-7.2)中加入2ml的fjat-91发酵液(菌落数为3.5×10⁹cfu·ml^-1)、ttc指示剂(每200mlttc半固体中加入1ml1g·l^-1的壮观霉素)。于平板中倒入ttc固体培养基，待固体培养基凝固后，再注入加有青枯雷尔氏菌fjat-91、ttc指示剂的ttc半固体培养基，待凝固，制成双层培养基，用7mm打孔器在培养基上打孔。以无菌水为阴性对照，壮观霉素(浓度为5mg·ml^-1)为阳性对照，分别取100μl待测菌株滴入相应的孔中，置于30℃恒温培养箱中培养2-3d。用游标卡尺测量抑菌圈直径。

实验结果表明，fjat-19708菌株的抑菌圈直径为5.62mm，fjat-20265菌株的抑菌圈直径为4.75mm。fjat-19708菌株对青枯雷尔氏菌fjat-91具有较好的抑制效果。

综上，以尖孢镰刀菌fjat-30512、腐皮镰刀菌fjat-176、青枯雷尔氏菌fjat-91作为致病菌，从可可西里土壤里筛选到了一株对以上三种病原菌有较强抑制效果的菌株fjat-19708。

实施例2拮抗菌株的鉴定

1.形态特征

将芽孢杆菌fjat-19708于na平板上活化，48h后观察菌株的菌落形态、大小、颜色、透明度、突起和边缘情况。

菌株fjat-19708的菌落特征如图1所示，菌落较小、圆形、乳白色、表面光滑且湿润、隆起、边缘整齐、不透明。

2.16srrna基因序列分析

按细菌基因组提取试剂盒(generaybiotech#gk1071，上海捷瑞生物工程有限公司)操作步骤提取菌株fjat-19708的基因组dna，采用16srrna基因通用引物27f和1492r进行pcr扩增，pcr反应程序参照郑雪芳等的文献(郑雪芳,刘波,朱育菁,等.番茄青枯病生防芽孢杆菌的筛选与鉴定[j].中国生物防治学报,2016,32(5):657-665.)，pcr产物送至上海博尚测序，应用ezbiocloud完成序列同源性比对，通过mega4.0.2软件分析序列和构建系统发育树。

将菌株fjat-19708的16srrna基因序列与ezbiocloud基因数据库比对，菌株fjat-19708与bacillussubtilis亲缘关系最近，16srrna基因同源性为99.37％，所以菌株fjat-19708应属于bacillussubtilis枯草芽孢杆菌。将同源性较高菌株的16srrna基因序列下载进行对比分析，构建系统发育树，采用neighbour-joining方法，bootstrap值为1000次时，形成的发育树如图2所示。在构建系统发育树中，菌株fjat-19708与bacillussubtilis聚在同一个分支。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。