本申请属于食品加工领域，具体地说，涉及一种苦荞麦活性肽及其提取方法。
背景技术：
苦荞麦活性肽是苦荞麦蛋白粉经蛋白酶水解后生成的小肽和氨基酸的混合物，它更易被人体消化吸收。近年国内外科研人员不断发现由苦荞麦粉水解制得的水解产物，有降血液、肝脏胆固醇，抑制体内脂肪蓄积，促进排泄、改善便秘，抑制肿瘤、延缓衰老，抑制有害物的吸收等作用，国外将之视为“高级营养保健品”。因此，随着人们对苦荞麦研发的深入，它的营养价值和保健功能将会被了解得越来越清楚，也将会越来越引起人们的重视。
苦荞麦蛋白水解及其水解产物的研究较晚，现在也还没有全面深入的探讨。目前，活性肽产品有能降低高血压和抑制血管紧张素(ACE)的活性肽，该产品用一系列蛋白酶水解苦荞麦蛋白质，得到一种结构与响尾蛇毒素十分相似的三肽，该三肽抑制血管紧张素转移酶，从而使血压下降。目前，我国研究苦荞蛋白水解的较多。崔霞等(崔霞，周艳明，牛森等，酶法水解苦荞蛋白制备可溶性生物活性肽最佳条件研究，食品科技，2006，13(1):39-41)研究了两种蛋白酶(中性蛋白酶、碱性蛋白酶)水解苦荞麦蛋白制备活性肽，发现碱性蛋白酶的水解效果较好，并确定了碱性蛋白酶水解苦荞蛋白的工艺条件。李红敏等(李红敏，周小理，荞麦多肽的制备及其抗氧化活性研究，食品科学，2006,27(10):302-306)利用木瓜蛋白酶、Protamex酶、Alcalase酶、Flavourzyme蛋白酶、Neutrase中性蛋白酶分别水解苦荞蛋白复合物，对各种酶的水解条件进行了优化，研究发现，制备荞麦活性肽的适宜酶为Alcalase酶。周小理等(周小理，李红敏，周一鸣等，苦荞多肽营养饮料的研究《食品科学》,2005,26(11):128-132)确定了制备苦荞活性肽液的工艺条件和苦荞活性肽营养饮料的配方。目前的研究主要集中在水解工艺条件的优化，对苦荞麦蛋白水解物——活性肽的分离、纯化及相关产品的探索还很少，有必要对其进行全面深入的探讨。
技术实现要素：
有鉴于此，本申请针对上述的问题，提供了一种苦荞麦活性肽及其提取方法。
为了解决上述技术问题，本申请公开了一种苦荞麦活性肽的提取方法，包括以下步骤：
1)制备苦荞麦粉；
2)对苦荞麦粉进行脱脂处理；
3)酶法提取苦荞麦蛋白提取液；
4)后处理；
5)活性肽的分离制备，制备得到苦荞麦活性肽。
进一步地，步骤1)中的制备苦荞麦粉具体为：取烘干的苦荞麦种子于粉碎机中磨粉，过40-80目筛，备用。
进一步地，步骤2)中的对苦荞麦粉进行脱脂处理具体为：在步骤1)制备得到的苦荞麦粉中加入石油醚，于室温环境脱脂8-16h，期间搅拌并多次更换石油醚；将脱脂后的苦荞麦分置于通风橱，风干42-54h备用，制备得到脱脂后的苦荞麦粉。
进一步地，步骤3)中的酶法提取苦荞麦蛋白提取液具体为：调整脱脂后的苦荞麦的pH值为6-8，温度为45-65℃，添加木瓜蛋白酶酶解，加酶量为脱脂后的苦荞麦重量的0.01％-0.05％，酶解时间为3h-7h。
进一步地，步骤4)中的后处理具体为：于4000r/min离心机内离心10min，取上清液；加入1/2体积的S-8大孔吸附树脂，上摇床脱色4小时；留上清液备用。
进一步地，步骤5)中的活性肽的分离制备具体为：
5.1)将步骤4)制备得到的上清液用2ml的乙腈水溶液溶清，过滤，上高效液相色谱进行分析；
5.2)将过滤好的上清液进行高效液相色谱分离：制备高效液相色谱平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；
5.3)将分离后的溶液冻干，既得到成品。
本发明还公开了一种由上述的提取方法提取得到的苦荞麦活性肽。
与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：
本发明以苦荞麦为主原料，通过对中性蛋白酶(活力20万U/g)、碱性蛋白酶(活力20万U/g)、胰蛋白酶、植物水解蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶筛选，并对酶解条件进行正交试验，获得了苦荞麦活性肽制备的工艺条件，并对制备出的苦荞麦活性肽进行分离，冻干最终获得苦荞麦活性肽粉，同时为苦荞麦肽其他相关产品的开发奠定基础。
当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。
具体实施方式
以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。
实施例1
一种苦荞麦活性肽的提取方法，包括以下步骤：
1)制备苦荞麦粉：取烘干的苦荞麦种子于粉碎机中磨粉，过60目筛，备用。
2)对苦荞麦粉进行脱脂处理：在步骤1)制备得到的苦荞麦粉中加入石油醚，于室温环境脱脂12h，期间搅拌并多次更换石油醚；将脱脂后的苦荞麦分置于通风橱，风干48h备用，制备得到脱脂后的苦荞麦粉。
3)酶法提取苦荞麦蛋白提取液：调整脱脂后的苦荞麦的pH值为7，温度为60℃，添加木瓜蛋白酶酶解，加酶量为脱脂后的苦荞麦重量的0.04％，酶解时间为5h。
4)后处理：于4000r/min离心机内离心10min，取上清液；加入1/2体积的S-8大孔吸附树脂，上摇床脱色4小时；留上清液备用。
5)活性肽的分离制备：将步骤4)制备得到的上清液用2ml的乙腈水溶液溶清，过滤，上高效液相色谱进行分析；制备高效液相色谱平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；将分离后的溶液冻干，既得到成品。
实施例2
一种苦荞麦活性肽的提取方法，包括以下步骤：
1)制备苦荞麦粉：取烘干的苦荞麦种子于粉碎机中磨粉，过40目筛，备用。
2)对苦荞麦粉进行脱脂处理：在步骤1)制备得到的苦荞麦粉中加入石油醚，于室温环境脱脂16h，期间搅拌并多次更换石油醚；将脱脂后的苦荞麦分置于通风橱，风干42h备用，制备得到脱脂后的苦荞麦粉。
3)酶法提取苦荞麦蛋白提取液：调整脱脂后的苦荞麦的pH值为6，温度为65℃，添加木瓜蛋白酶酶解，加酶量为脱脂后的苦荞麦重量的0.01％，酶解时间为7h。
4)后处理：于4000r/min离心机内离心10min，取上清液；加入1/2体积的S-8大孔吸附树脂，上摇床脱色4小时；留上清液备用。
5)活性肽的分离制备：将步骤4)制备得到的上清液用2ml的乙腈水溶液溶清，过滤，上高效液相色谱进行分析；制备高效液相色谱平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；将分离后的溶液冻干，既得到成品。
实施例3
一种苦荞麦活性肽的提取方法，包括以下步骤：
1)制备苦荞麦粉：取烘干的苦荞麦种子于粉碎机中磨粉，过80目筛，备用。
2)对苦荞麦粉进行脱脂处理：在步骤1)制备得到的苦荞麦粉中加入石油醚，于室温环境脱脂8h，期间搅拌并多次更换石油醚；将脱脂后的苦荞麦分置于通风橱，风干54h备用，制备得到脱脂后的苦荞麦粉。
3)酶法提取苦荞麦蛋白提取液：调整脱脂后的苦荞麦的pH值为8，温度为45℃，添加木瓜蛋白酶酶解，加酶量为脱脂后的苦荞麦重量的0.05％，酶解时间为3h。
4)后处理：于4000r/min离心机内离心10min，取上清液；加入1/2体积的S-8大孔吸附树脂，上摇床脱色4小时；留上清液备用。
5)活性肽的分离制备：将步骤4)制备得到的上清液用2ml的乙腈水溶液溶清，过滤，上高效液相色谱进行分析；制备高效液相色谱平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min；收集从检测器出来的样品；将分离后的溶液冻干，既得到成品。
下面结合具体的实验过程和实验结果来说明本发明的技术效果：
1实验材料与仪器
1.1实验材料
苦荞麦(六苦四号)，由六盘水职业技术学院农业工程系苦荞麦育种基地提供。
取烘干的苦荞麦种子于粉碎机中磨粉，过60目筛。在获得的苦荞麦粉中加入石油醚，于室温环境脱脂12h，期间搅拌并多次更换石油醚。将脱脂后的苦荞麦粉分置于通风橱，风干48h备用。
1.2实验用酶
中性蛋白酶(活力20万U/g)、碱性蛋白酶(活力20万U/g)、胰蛋白酶、植物水解蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶
1.3实验试剂
pH＝6.864和pH＝9.182的成套缓冲剂(天津市科密欧化学试剂有限公司)，氢氧化钠，盐酸，甲醛，酚酞试剂。
1.4实验仪器
TU-1901双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；TDL-60B低速台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；标准检验筛(目60吋，孔径0.3毫米)(浙江上虞市道墟张兴纱筛厂)；PHS-3C实验室PH计(上海虹益仪器仪表有限公司)；101-2型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；DK-98-1型电热恒温水浴锅(天津市泰斯特仪器有限公司)；AL204型电子天平(梅特勒-托利多(上海)有限公司)；DFT-200型高速万能粉碎机(温岭市林大机械有限公司)；冷冻干燥机；LC3000高效液相色谱仪(北京创新通恒)。
2实验方法
2.1蛋白提取液的制备：取脱脂后的苦荞麦粉，加酶量为0.03％，温度65℃，pH＝11，料液比为1:20的条件下水浴提取4h。于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。加入1/2体积的S-8大孔吸附树脂，上摇床脱色4小时。留上清液备用。
2.2蛋白酶的筛选
分别使用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、植物水解蛋白酶、中性蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶进行苦荞麦蛋白质的水解实验。以水解度为指标进行酶的筛选优化，确定出水解苦荞麦蛋白的较适宜用酶为木瓜蛋白酶。
对酸性蛋白酶(pH＝3)、中性蛋白酶(pH＝7)、碱性蛋白酶(pH＝10)、胰蛋白酶(pH＝8)、植物水解蛋白酶(pH＝6)、胃蛋白酶(pH＝2)、木瓜蛋白酶(pH＝7)，按比1:10，提取温度50℃，加酶量0.3％，水解时间6h。100℃灭酶10min,于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。测定蛋白提取液的水解度按照pH-STAT法，稍加改动。只需在水解结束后将反应体系的pH调至7.0，并记录下所用的碱液的量即可。按下式即可计算出酪蛋白的水解度：水解度DH％＝B(Mb)(1/T)(1/MP)(1/htot)×100
其中：B为NaO H的体积(mL)；Mb为NaO H的浓度(mol/L)；在pH7.0，50℃的实验条件下，对于酪蛋白，1/α为2.26；MP为蛋白质的质量(g)；htot为每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对于酪蛋白，该值取8.2。
每组实验做三次重复，取平均值，计算水解度，找出水解效果效果最好的蛋白酶。
2.4酶法提取单因素实验
2.4.1加酶量
反应条件：温度60℃；时间5h；料液比1:15；pH＝7。加酶量设定0.01％，0.02％，0.03％，0.04％，0.05％五个梯度。100℃灭酶10min,于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。测定蛋白提取液的水解度。找出最佳加酶量。
2.4.2水解时间
反应条件：温度60℃；加酶量0.03％；pH＝7。提取时间设定3h，4h，5h，6h，7h五个梯度。100℃灭酶10min，于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。测定蛋白提取液的水解度。找出最佳水解时间。
2.4.3温度
反应条件：时间5h；加酶量0.03％；pH＝7。温度设定，45℃，50℃，55℃，60℃，65℃五个梯度。100℃灭酶10min,于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。测定蛋白提取液的水解度。找出最适水解温度。
2.4.4pH值
反应条件：温度60℃；时间5h；加酶量0.3％。设定pH＝6，pH＝6.5，pH＝7，pH＝7.5，pH＝8五个梯度。100℃灭酶10min,于4000r/min离心机内离心10min，取上清液。测定蛋白提取液的水解度。找出最适pH。
2.5活性肽水解工艺的正交实验
根据单因素试验结果，选择加酶量(A)、温度(B)、料液比(C)、pH值(D)作为检测因素，每因素选择3个较佳水平(表1)，按L9(34)设计正交试验方案(表7)。
表1正交试验因素水平表
2.6活性肽的分离制备
1、取样品放入器皿中，用2ml的乙腈水溶液溶清，过滤，上高效液相色谱进行分析。
2、制备：将溶解好的样品，做进样准备。制备HPLC平衡10min，起始梯度水95％，乙腈5％，结束梯度水25％，乙腈75％梯度时间40min。收集从检测器出来的样品。
3、鉴定：将收集下来的样品，取样上分析型高校液相进行鉴定。
4、最后将分离后的溶液冻干，既得到成品。
3结果与分析
3.1蛋白酶的筛选
表2不同蛋白酶对苦荞麦蛋白质水解度的影响
结果显示，在这七种酶的最适反应条件下，木瓜蛋白酶的水解效果最好，水解度可达48.6％。
3.2酶法提取单因素实验
3.2.1加酶量
结果见表3。
表3加酶量对苦荞麦蛋白质水解度的影响
由表3可看出，在加酶量为0.03％时，蛋白质的水解度最高。
3.2.2水解时间
表4水解时间对苦荞麦蛋白质水解度的影响
由表4可看出，在水解时间4至5小时期间，蛋白质水解度迅速提高。随着水解时间的延长，水解度基本保持不变，所以提取的时间应该控制在4h左右。
3.2.3温度
表5温度对苦荞麦蛋白质水解度的影响
由表5可看出，随着温度的升高，蛋白质的水解度逐渐提高，在60℃时达到最高，当温度再升高时，酶活性受到抑制，从而使水解度下降。因此，应选取60℃为最佳提取温度。
3.2.4pH值
表6pH值对苦荞麦蛋白质水解度的影响
由表6可知，在其他反应条件不变的情况下，随着pH值的增大，蛋白质提取率呈明显上升趋势，在pH＝7时达到最高；当pH再增大时，蛋白酶失去活性，蛋白质水解度下降，说明选取提取pH＝7较为合适。
3.3酶法提取正交实验
根据单因素试验结果，选择加酶量(A)、温度(B)、水解时间(C)、pH值(D)作为检测因素，每因素选择3个较佳水平(表15)，按L9(34)设计正交试验方案。
表7正交试验结果及极差分析
正交试验分析结果表明，优化苦荞麦肽的制备工艺条件：酶用量0.04％、pH值＝7、水解时间5h、水解温度60℃。
3.4酶法提取验证实验
由于表7没有最优组合方案，故有必要对其做验证实验，以进一步确认正交试验的可行性。称取烘干的脱脂苦荞麦粉3份，每份1g，置于10mL离心管内，按优选出的最佳生产工艺条件进行提取，于紫外分光光度计680nm处测定吸光值，并计算出提取率，实验结果见表8。
表8最佳工艺验证试验结果表
由表8的试验结果可知，在最佳的提取工艺条件下，水解度为49.69％，高于正交试验的最高水平(A3B1C3D2)，其水解度为48.43％。故最佳工艺验证试验成功，说明该提取工艺可靠且稳定。
4结论
苦荞麦肽的制备工艺条件：酶用量0.04％、pH值＝7、水解时间5h、水解温度60℃。
上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。