一种酶菌联合降解羽毛的方法与流程

本发明属于养殖业环境资源利用领域，涉及一种酶菌联合降解羽毛的方法。

背景技术：

近年来，全国每年的家禽屠宰量已经突破了100亿只，年产废弃物达400万吨。其中，有近100万吨的羽毛被当作废弃物处理，羽毛资源没有得到充分应用。随着家禽养殖业飞速发展，饲料蛋白资源开始出现严重的短缺，进口大豆、鱼粉等蛋白来源的成本不断攀升，加大了养殖企业的生产负担。因此，寻找一种新的资源无害化饲料蛋白来源成为重中之重。

羽毛中蛋白含量较高，富含多种氨基酸，如亮氨酸、缬氨酸和赖氨酸等多种必须氨基酸，还含有钙、磷等微量元素及生长因子。（张大雷等，2003）因此，羽毛在作为动物饲料蛋白和氨基酸来源方面具有极大的应用潜力。随着对角蛋白的研究越发深入，角蛋白的加工利用状况有所进展。

目前已有的鸡毛处理方法有三大类：（1）物理加工：加压、加热膨胀法；（2）化学水解：酸碱处理、氧化处理、电化学还原处理、铜氨溶液处理及金属盐处理；（3）生物降解：角蛋白酶降解角蛋白。（胡新华，1997）。目前，大规模加工羽毛角蛋白的方法主要是化学水解法、高温加热法和高温膨化法。高温膨化工艺操作相对简单，产品适用范围广，但仍然存在耗能大、成本高等缺点，实际应用不多。（郭素华，1991）而生物降解法是利用微生物发酵或添加蛋白酶酶解，能耗、污染相对较少，微生物发酵产生的酶系能够促进羽毛角蛋白分解为更多的小肽和游离氨基酸，并且减少了热敏性氨基酸的损失。(汪国和等，2010)

使用微生物发酵鸡毛的方法可以改变角蛋白的结构，促进鸡毛角蛋白的降解。另外微生物发酵产品中富含对动物机体有益的微生物本身就是对蛋白质营养价值的补充。目前利用微生物发酵法生产角蛋白饲料主要有厌氧固体发酵和液体深层发酵，但是不管使用哪种方法，单一的菌株是不能完全降解鸡毛。(汪国和等，2010)因而用单一的菌株处理羽毛废弃物是达不到废弃鸡毛最大化利用。

角蛋白酶是一种可专一降解角蛋白的蛋白酶类。角蛋白酶的底物范围一般比较广泛，除角蛋白外，它还可水解多种可溶性和不溶性蛋白质底物。（Tsuboi R, et al.1989）(Ray TL, et al.1990）。由于角蛋白酶在溶解状态下可发生自身水解，这一特点使得角蛋白酶的酶活下降，因此单一使用角蛋白酶处理羽毛效果不理想，且成本较高，不适宜用来大规模降解和处理羽毛及其他类似养殖废弃物。

技术实现要素：

本发明的目的在于根据现有技术中的不足，提供了一种酶菌联合降解羽毛的方法。

本发明综合蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）发酵过程和角蛋白酶酶解过程的优缺点，提出酶菌联合降解鸡毛，以实现鸡毛的无害化、资源化、合理化应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一种酶菌联合降解羽毛的方法，所述方法步骤如下：

S1. 配置发酵缓冲液，将羽毛加入到发酵缓冲液，得到含羽毛的发酵缓冲液；

S2. 将菌种活化培养，得到活化后的菌液；

S3.将S2中活化后的菌液加入到S1中含羽毛的发酵缓冲液中进行一次发酵；

S4.待S3中发酵反应16~48h后，加入角蛋白酶进行二次发酵培养24~56h；

S5.将S4中二次发酵后的液体离心后，取上清液得发酵液；

S1中，羽毛质量占发酵缓冲液质量的1~10%，所述发酵缓冲液的pH值为6~10；

S2中，菌种为蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）YSQ08，于2012 年09 月03 日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC No. M2012322；

S3中，将S2中活化后的菌液按2~6%的加入量加入含羽毛的发酵缓冲液；

S4中，以S3中一次发酵后物质量计，角蛋白酶的添加量为1000~5000U/g；所述角蛋白酶的酶活为10⁵~10⁶U/g。

优选地，S3中，将S2中活化后的菌液按3%加入含羽毛的发酵缓冲液；S4中，以S3中一次发酵后物质量计，角蛋白酶的添加量为2000U/g，S1中，羽毛质量占发酵缓冲液质量的2.5%。

优选地，S4中，待S3中发酵反应24h后，加入角蛋白酶进行二次发酵培养48h。

优选地，所述羽毛为鸡毛，发酵缓冲液的pH值为9。

优选地，所述发酵缓冲液组成为：0.1~1.0g/L氯化钠，0.01~1.0g/L氯化钙，0.1 ~1.0g /L氯化镁，1.0~5.0g/L磷酸氢二钾，0.1~2.0g/L磷酸二氢钾。

优选地，S3和S4中发酵温度为36~42℃。

更优选地，S3和S4中发酵温度为40℃。

优选地，S2中，菌种活化培养步骤如下：

S21.采用平板划线培养的方法，将蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）进行活化，挑取单菌落，置于LB肉汤培养基中，摇床37℃，200r/min培养24h；

S22.将S21中所得液体以2%的菌液加入量加入到S1中含羽毛的发酵缓冲液中，72h后，划线倒置培养14h，挑取单菌落进行液体培养，摇床37℃，200r/min培养14h；

S23. 将S22中诱导好的液体以2%的添加量加入到LB肉汤培养基中进行扩大培养3~5次。

优选地，LB肉汤培养基的制备为：将胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g混合，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.0，121℃高压灭菌20min。

优选地，S21中，所述蜡样芽孢杆菌YSQ08菌株的种龄为8~20h。

根据本发明提供的方法，蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）在24h~72h内将鸡毛降解成短肽或絮状物，鸡毛的梗部也能得到部分降解。加入角蛋白酶后，这些短肽、絮状物、部分降解的梗部得到充分地酶解，72h内能将鸡毛得到彻底降解。游离氨基酸含量约为150~230mg/L，降解率约为70.00~82.00%，相较于单独的酶解氨基酸含量提高了16.20~69.07%，降解率提高了14.54~30.80%；较于单独的菌解，氨基酸含量提高了400.65~628.42%，降解率提高了128.23~160.64%。相比其他的鸡毛微生物发酵方案，鸡毛彻底降解的时间提高48h以上。采用酶菌联合降解的方式，鸡毛中的蛋白质和氨基酸得到充分保留。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明综合蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）发酵过程和角蛋白酶酶解过程的优缺点，能够充分利用废弃物羽毛，且获得良好的饲料添加剂来源，所述方法操作简单，实现了羽毛的无害化、资源化及合理化应用，在养殖业废弃物利用和饲料添加剂领域具备广阔的应用前景。

附图说明

图1为菌株种龄对降解率的影响对比图。

图2为蜡样芽孢杆菌YSQ08的生长曲线图。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

以下实施例中采用的LB肉汤培养基制备为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 5g混合，加蒸馏水定容至1000mL，pH7.0，121℃高压灭菌20min。

发酵缓冲液的制备：0.5000 g 氯化钠，0.0600 g 无水氯化钙，0.1000 g 氯化镁，1.4 000g 磷酸氢二钾，0.7000 g 磷酸二氢钾，pH调至7.0，蒸馏水定容至1000mL。

蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）YSQ08，于2012 年09 月03 日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC No. M2012322。

实施例1：

（1）采用平板划线培养的方法，将蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）进行活化，挑取单菌落，置于LB肉汤培养基中，摇床37℃，200r/min培养24h。培养好后的液体菌液测定吸光度，挑选OD600值最高的一瓶作下一次活化，如此反复多次。菌株生长曲线如下图2：

采用诱导培养的方法，将活化好的菌液以2%加入到含羽毛的发酵液中.72h后，划线倒置培养14h，挑取单菌落进行液体培养，摇床37℃，200r/min培养14h。

将诱导好的蜡样芽孢杆菌YSQ08（Bacillus cereus）以添加量为2%加入到LB肉汤培养基中进行扩大培养3次,，得到活化后的菌液。

针对实施例1中菌株种龄对降解率的影响见图1。

（2）在鸡毛质量含量为2.5%的pH为9的发酵缓冲液中加入（1）中诱导培养好的3%的活化后的菌液。活化后的菌液添加时间为震荡后的0.5h，在活化后的菌液发酵后24h后加入角蛋白酶，添加量为2000U/g，所述角蛋白酶的酶活为10⁵~10⁶U/g。保持发酵温度为40℃，发酵时间为72h（在发酵后24h后加入胶蛋白酶，再发酵48h）。

（3）将锥形瓶中的液体均匀倾倒于两个100mL离心管中，配平后对置于离心机中，3000r离心10min。留取上层清液，用少量的蒸馏水清洗滤渣，再一次配平3000r离心10min。两次离心得到的上层清液即发酵液。

实施例2：制备过程同实施例1，不同的是（2）中，在鸡毛质量含量为2.5%的pH为9的发酵缓冲液中加入（1）中诱导培养好的2%活化后的菌液。

实施例3：制备过程同实施例1，不同的是（2）中，在鸡毛质量含量为2.5%的pH为9的发酵缓冲液中加入（1）中诱导培养好的6%活化后的菌液。

实施例4：制备过程同实施例1，不同的是（2）中，角蛋白酶添加时间为15h。

实施例5：制备过程同实施例1，不同的是（2）中，角蛋白酶添加时间为30h。

实施例6：制备过程同实施例1，不同的是角蛋白酶添加时间为24h，酶活为5000U/g。

对比例1：制备方法和过程同实施例1，不同的是，步骤（2）中在鸡毛质量含量为2.5%的pH为9的发酵缓冲液中先角蛋白酶，然后再加入（1）中诱导培养好的3%的活化后的菌液。角蛋白酶添加时间为震荡后的0.5h，活化后的菌液添加时间为24h，添加量为2000U/g。

对比例2：制备方法和过程同实施例1，不同的是，活化后的菌液添加时间为震荡后的0.5h，并在加入活化后的菌液同时加入角蛋白酶。

对比例3：制备方法和过程同实施例1，不同的是，不经过（1）中菌株降解处理。

对比例4：制备方法和过程同实施例1，不同的是，不经过（2）中加入角蛋白酶处理。

数据验证：

氨基酸含量的计算如下：

将实施例和对比例中两次离心得到的滤液置250mL容量瓶中，充分混匀后，量取20mL到250mL烧杯中，加入60mL蒸馏水，开动磁力搅拌器1min。用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定到8.20。加入含量为37%~40%甲醛溶液10mL，用0.05mol/L NaOH标准溶液滴定到9.20，记录0.05mol/L NaOH标准溶液的消耗量为V₁。加入80mL蒸馏水于250mL烧杯中，重复上述操作，记录0.05mol/L NaOH标准溶液的消耗量为V₀。溶液中氨基酸含量，单位g/100ml=10⁴mg/L。

降解率的计算如下：

m₁为初始羽毛质量，取得发酵液后，加入少量的蒸馏水于离心管中，震荡均匀。将滤渣倒入质量为m₀的滤纸上，使用抽滤装置过滤，将滤渣放入到105℃的烘箱2h，然后滤入到干燥器中，待温度冷却后，称其质量为m₂。降解率。

将实施例和对比例的氨基酸含量和降解率进行测试，数据列表详见表1：

表1：

从表1中可以看出，对比例1先加角蛋白酶后加蜡样芽孢杆菌YSQ08活化后的菌液处理羽毛、对比例2中角蛋白酶蜡样芽孢杆菌YSQ08活化后的菌液同时加入处理羽毛、实施例1中先加蜡样芽孢杆菌YSQ08后加角蛋白酶处理羽毛，三种方式对比发现，实施例1的处理效果更优。原因可能是先加入角蛋白酶时，酶处理羽毛时间过长，受外界因素影响变大，影响了角蛋白酶酶活；同时蜡样芽孢杆菌YSQ08处理羽毛的时间变短，也影响氨基酸态氮含量。而同时酶菌方案中，没有较好的发挥出蜡样芽孢杆菌YSQ08的活化作用，因此选择先加入蜡样芽孢杆菌YSQ08活化后的菌液然后再加入角蛋白酶处理羽毛的方式更好。

经过对比例4中处理发现，单纯的菌解其获得的氨基酸含量和降解率较低，推测与角蛋白酶相比，单纯的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus ）YSQ08产角蛋白酶和酶活较低。

同时，实施例1、4和5之间的对比发现，恰当的角蛋白酶加入时间，对于氨基酸含量和降解率影响较大， 实施例1~3对比发现，恰当的活化菌液浓度才能获得较好的同角蛋白酶处理效果，而实施例6可以看出，角蛋白酶的酶活并非越高越好，综上，只有在恰当的活化后的菌液浓度、角蛋白酶加入量、角蛋白酶酶活性和角蛋白酶加入时间的组合才能获得本发明最优的效果。