本发明属于医药原料加工技术领域，具体地说，涉及一种从鸡蛋蛋黄中高效提取蛋黄卵磷脂的方法。
背景技术：
现代医学科学研究证明，卵磷脂可激活脑细胞、消除疲劳、增强记忆、改善精神状态，从而保持脑组织及神经系统的健康。特别是蛋黄的卵磷脂含量高于10%，磷脂酰胆碱含量高，具有更好的生物活性和人体利用率，可促使胆固醇和蛋白质分子之间的结合，减轻血管壁类脂质的浸润，抑制动脉粥样硬化的产生和改善动脉壁的组织结；高纯度卵磷脂更是载药脂质体/ 脂微球的首选乳化剂，是制药行业不可或缺的药用辅料。
由于蛋黄卵磷脂稳定性差，易被氧化，特别是其活性与温度关联度极高。在25℃时最强，超过50℃后活性基本丧失。因此其提取工艺和技术比较复杂、难度较大。为了实现稳定、规模化提取蛋黄卵磷脂，技术人员进行了不断地尝试。根据已有公开资料显示，目前国内外生产蛋黄卵磷脂的方法主要有溶剂提取法、色谱提取法和超临界CO2萃取法。
中国发明专利CN100376588 公开了一种高纯度蛋黄卵磷脂的制备方法，用溶剂丙酮脱中性脂肪，用酒精提取，经真空浓缩得到卵磷脂。国发明专利CN102924506 A公开了一种高纯度卵磷脂的制备方法，采用模拟移动床连续色谱分离技术确保卵磷脂与原料脂质中所含其他成分的有效分离，得到高纯度的卵磷脂产品。根据已有研究，在蛋黄中提取卵磷脂的过程中，中性脂肪的去除是关键。然而，在溶剂法除脱中性酯过程中引入的有毒溶剂，使得卵磷脂存在有毒物残留的风险，而且卵磷脂中磷脂酰胆碱含量低；而色谱提取法尽管纯度高，但效率低，难以满足规模化提取的要求。
超临界二氧化碳萃取法由于在无毒无污染环境下进行萃取，全过程无残留溶媒，非常适合于制备医用卵磷脂。中国发明国专利CN101029057公开了一种蛋黄卵磷脂的制备方法，用酒精提取分离出卵磷脂初品，将卵磷脂初品再进行超临界CO2萃取,脱除中性脂肪,制得脱除中性脂肪的卵磷脂。但在具体操作过程中，由于在高压过程中萃取，因此对设备要求较高，且需要较高的温度,在大规模生产过程中，会出现萃取器中的物料黏度太大，致使超临界萃取效率降低。另外，采用超临界二氧化碳流体萃取卵磷脂中的中性脂时，由于有中性脂的极性差异，其溶解的速度存在差异，导致萃取时间长、得到的卵磷脂纯度低。
技术实现要素：
针对目前提取蛋黄卵磷脂存在的缺陷，本发明提供一种高效提取蛋黄卵磷脂的方法。突出的特点是利用乙醇从蛋黄中提取含有中性脂的卵磷脂粗品，通过超临界二氧化碳液流进一步萃取，在萃取釜中设置变频磁化装置，使中性脂与卵磷脂（磷脂酰胆碱）发生明显的极性变化，促使其分离。从而加速超临界二氧化碳流体萃取的效率，防止物料黏度对萃取的影响，大幅降低萃取时间，提高萃取的精度。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种高效提取蛋黄卵磷脂的方法，其特征在于：具体提取方法如下：
（1）将低温存储的鸡蛋在全程氮气保护或真空条件下分离出蛋黄，将蛋黄与体积浓度为90-95%的乙醇以体积比1:0.5-5加入搅拌机，搅拌机温度恒定在15-20℃，以400-800rpm的转速搅拌分散15-30min，然后静置15min，乙醇从蛋黄中萃取出卵磷脂粗品形成上清液；
（2）将步骤（1）得到的上清液在30-35℃条件下真空减压浓缩至膏状，然后送入真空冷冻干燥机，真空冷冻干燥机内部温度降低至-30℃，真空度控制在100Pa以内并维持30min以上，进一步升温至30℃真空干燥1-3h,得到干燥的卵磷脂粗品；
（3）将步骤（2）得到的卵磷脂粗品在氮气保护下通过气流磨粉碎至微细颗粒，加入萃取釜，萃取釜设置温度为30-40℃，萃取釜内壁设置变频磁化装置，内部设置搅拌装置，在搅拌过程中通入液态二氧化碳进行超临界萃取，压力8-10MPa；第一阶段萃取，保持磁化频率1000Hz-1500Hz，磁化强度为600-800mT，萃取时间10-30min，然后进行第二阶段萃取，磁化频率调至2000-2500Hz，磁化强度为1000-1200mT，萃取时间5-10min，超临界流体二氧化碳与卵磷脂粗品中的中性脂在变频磁化条件下快速溶解萃取出来；
（4）减压至3-5MPa，将步骤（3）二氧化碳与中性脂的混合流体送入分离器，进一步泄压使得二氧化碳与中性脂迅速分离，回收中性脂；收集萃取釜内的精细蛋黄卵磷脂。
优选的，步骤（1）所述的乙醇体积浓度为95%。
优选的，步骤（3）所述的超临界萃取压力为8MPa。
优选的，步骤（3）所述的第一阶段萃取磁化频率1200Hz，磁化强度为800mT。
优选的，步骤（3）所述的第二阶段萃取磁化频率2000Hz，磁化强度为1200mT。
优选的，步骤（3）所述的液态二氧化碳通入量为卵磷脂粗品体积的1-3倍。
优选的，步骤（3）所述搅拌装置的搅拌速度为100-150rpm。
本发明突出的特点是通过在萃取釜设置变频磁化装置，使中性脂与卵磷脂（磷脂酰胆碱）发生明显的极性变化，促使其分离。从而加速超临界二氧化碳流体萃取的效率，防止物料黏度对萃取的影响，大幅降低萃取时间，提高萃取的精度。特别的，通过改变磁化频率进行分级萃取，使卵磷脂粗品中的甘油三酯、胆固醇先后分级脱离卵磷脂，从而提高了萃取精度，得到纯度大于98%以上的高纯蛋黄卵磷脂。相较于完全超临界二氧化碳萃取，降低了工作压力，提升了萃取效率，提高了卵磷脂纯度。由于萃取在完全在安全环境中进行，没有引入有毒溶剂，且纯度高，为高效提取医用蛋黄卵磷脂提供了技术支撑。可以作为医用口服液及注射用的首选原料。
本发明一种高效提取蛋黄卵磷脂的方法，与现有技术相比其突出的特点和优异的效果表现在：
1、在超临界二氧化碳流体萃取的过程中，通过分级变频磁化，使卵磷脂粗品中的甘油三酯、胆固醇先后分级脱离卵磷脂，从而提高了萃取精度，得到纯度大于98%以上的高纯蛋黄卵磷脂。为高效提取医用蛋黄卵磷脂提供了技术支撑。
2、通过分级变频磁化，从而加速超临界二氧化碳流体萃取的效率，防止物料黏度对萃取的影响，大幅降低萃取时间。
3、通过分级变频磁化，相较于完全超临界二氧化碳萃取，降低了工作压力。
4、本发明提供的制备方法，对设备的要求比较低，大幅缩短了萃取时间，萃取过程实现了零排放，不会对环境造成污染，适合工业化生产。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步的解释，但不应将此理解为本发明的范围仅限于以下的实施例。在不脱离本发明上述方法思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段做出的各种替换或变更，均应包含在本发明的范围内。
实施例1
（1）将低温存储的新鲜鸡蛋自动破壳，在氮气氛围中分离出蛋黄，并将蛋黄与体积浓度为95%的乙醇水溶液以体积比1:2加入密闭搅拌机，搅拌机温度恒定在15-20℃，以400rpm的转速搅拌分散15min，然后静置15min，乙醇从蛋黄中萃取出卵磷脂粗品形成上清液；整个过程在氮气氛围的洁净中进行，从而避免环境氧以外界的污染；
（2）将步骤（1）得到的上清液在30-35℃条件下真空减压浓缩至膏状，然后送入真空冷冻干燥机，真空冷冻干燥机内部温度降低至-30℃，真空度控制在80Pa并维持60min，进一步升温至30℃真空干燥3h,得到干燥的卵磷脂粗品；
（3）将步骤（2）得到的卵磷脂粗品在氮气保护下通过气流磨粉碎至微细颗粒，加入萃取釜，萃取釜设置温度为30-40℃，萃取釜内壁设置变频磁化装置，内部设置搅拌装置，在100rpm的搅拌过程中通入液态二氧化碳进行超临界萃取，压力8MPa，液态二氧化碳通入量为卵磷脂粗品体积的1倍；第一阶段萃取，保持磁化频率1200Hz，磁化强度为800mT，萃取时间30min，然后进行第二阶段萃取，磁化频率调至2200Hz，磁化强度为1200mT，萃取时间5min，超临界流体二氧化碳与卵磷脂粗品中的中性脂在变频磁化条件下快速溶解萃取出来；
（4）减压至3MPa，将步骤（3）二氧化碳与中性脂的混合流体送入分离器，进一步泄压使得二氧化碳与中性脂迅速分离，回收中性脂；收集萃取釜内的精细蛋黄卵磷脂。
通过对收集的精细蛋黄卵磷脂进行常规检测，其成分为：含磷脂酰胆碱98.5％，磷脂酰乙醇胺0.2％，溶血性磷脂酰胆碱0.5%。
实施例2
（1）将低温存储的新鲜鸡蛋自动破壳，在氮气分为保护下分离出蛋黄，将蛋黄与体积浓度为90%的乙醇水溶液以体积比1:5加入真空搅拌机，搅拌机温度恒定在15-20℃，以800rpm的转速搅拌分散30min，然后静置15min，乙醇从蛋黄中萃取出卵磷脂粗品形成上清液；整个搅拌静置在真空环境中进行；
（2）将步骤（1）得到的上清液在30-35℃条件下真空减压浓缩至膏状，然后送入真空冷冻干燥机，真空冷冻干燥机内部温度降低至-30℃，真空度控制在90Pa并维持45min，进一步升温至30℃真空干燥2h,得到干燥的卵磷脂粗品；
（3）将步骤（2）得到的卵磷脂粗品在氮气保护下通过气流磨粉碎至微细颗粒，加入萃取釜，萃取釜设置温度为30-40℃，萃取釜内壁设置变频磁化装置，内部设置搅拌装置，在120rpm搅拌过程中通入液态二氧化碳进行超临界萃取，压力10MPa，液态二氧化碳通入量为卵磷脂粗品体积的3倍；第一阶段萃取，保持磁化频率1000Hz，磁化强度为600mT，萃取时间10min，然后进行第二阶段萃取，磁化频率调至2000Hz，磁化强度为1000mT，萃取时间5min，超临界流体二氧化碳与卵磷脂粗品中的中性脂在变频磁化条件下快速溶解萃取出来；
（4）减压至5MPa，将步骤（3）二氧化碳与中性脂的混合流体送入分离器，进一步泄压使得二氧化碳与中性脂迅速分离，回收中性脂；收集萃取釜内的精细蛋黄卵磷脂。
通过对收集的精细蛋黄卵磷脂进行常规检测，其成分为：含磷脂酰胆碱98.0％，磷脂酰乙醇胺0.3％，溶血性磷脂酰胆碱0.5%。相比于实施例1，降低磁化频率下，磷脂酰胆碱有降低的趋势，但磷脂酰乙醇胺有所上升。因此磁化频率的控制对于控制磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的含量至关重要。
实施例3
（1）将生产出2小时内的新鲜鸡蛋破壳，在全程真空条件下分离出蛋黄，将蛋黄与体积浓度为92%的乙醇以体积比1:0.5加入搅拌机，搅拌机温度恒定在15-20℃，以500rpm的转速搅拌分散30min，然后静置15min，乙醇从蛋黄中萃取出卵磷脂粗品形成上清液；
（2）将步骤（1）得到的上清液在30-35℃条件下真空减压浓缩至膏状，然后送入真空冷冻干燥机，真空冷冻干燥机内部温度降低至-30℃，真空度控制在100Pa以内并维持60min，进一步升温至30℃真空干燥3h,得到干燥的卵磷脂粗品；
（3）将步骤（2）得到的卵磷脂粗品在氮气保护下通过气流磨粉碎至微细颗粒，加入萃取釜，萃取釜设置温度为30-40℃，萃取釜内壁设置变频磁化装置，内部设置搅拌装置，在搅拌过程中通入液态二氧化碳进行超临界萃取，压力10MPa，液态二氧化碳通入量为卵磷脂粗品体积的2倍；第一阶段萃取，保持磁化频率1500Hz，磁化强度为800mT，萃取时间10min，然后进行第二阶段萃取，磁化频率调至2500Hz，磁化强度为1200mT，萃取时间5min，超临界流体二氧化碳与卵磷脂粗品中的中性脂在变频磁化条件下快速溶解萃取出来；
（4）减压至3MPa，将步骤（3）二氧化碳与中性脂的混合流体送入分离器，进一步泄压使得二氧化碳与中性脂迅速分离，回收中性脂；收集萃取釜内的精细蛋黄卵磷脂。
通过对收集的精细蛋黄卵磷脂进行常规检测，其成分为：含磷脂酰胆碱98.6％，磷脂酰乙醇胺0.2％，溶血性磷脂酰胆碱0.5%。相比于实施例1，提升磁化频率和强度，可以在较短时间内完成萃取，磷脂酰胆碱含量上升，磷脂酰乙醇胺没有明显变化。因此磁化频率和强度的控制可以实现短时间高效萃取高纯度卵磷脂。
实施例4
（1）将低温存储的鸡蛋破壳，在全程真空条件下分离出蛋黄，将蛋黄与体积浓度为90%的乙醇以体积比1:2加入搅拌机，搅拌机温度恒定在15-20℃，以800rpm的转速搅拌分散30min，然后静置15min，乙醇从蛋黄中萃取出卵磷脂粗品形成上清液；
（2）将步骤（1）得到的上清液在30-35℃条件下真空减压浓缩至膏状，然后送入真空冷冻干燥机，真空冷冻干燥机内部温度降低至-30℃，真空度控制在60Pa，并维持30min以上，进一步升温至30℃真空干燥1h,得到干燥的卵磷脂粗品；
（3）将步骤（2）得到的卵磷脂粗品在氮气保护下通过气流磨粉碎至微细颗粒，加入萃取釜，萃取釜设置温度为30-40℃，萃取釜内壁设置变频磁化装置，内部设置搅拌装置，在搅拌过程中通入液态二氧化碳进行超临界萃取，压力8MPa，液态二氧化碳通入量为卵磷脂粗品体积的1倍；第一阶段萃取，保持磁化频率1000Hz，磁化强度为600mT，萃取时间30min，然后极性第二阶段萃取，磁化频率调至2000Hz，磁化强度为1000mT，萃取时间10min，超临界流体二氧化碳与卵磷脂粗品中的中性脂在变频磁化条件下快速溶解萃取出来；
（4）减压至5MPa，将步骤（3）二氧化碳与中性脂的混合流体送入分离器，进一步泄压使得二氧化碳与中性脂迅速分离，回收中性脂；收集萃取釜内的精细蛋黄卵磷脂。
通过对收集的精细蛋黄卵磷脂进行常规检测，其成分为：含磷脂酰胆碱98.1％，磷脂酰乙醇胺0.4％，溶血性磷脂酰胆碱1%。