1.诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于包括如下工艺步骤:
A、菌种的纯化及复壮
A1、将酿酒酵母溶于无菌水后划线于孟加拉红培养基上,于30-35℃恒温培养2-3天,选取长势良好的单菌落划线培养,于32-37℃继续培养,挑取长势良好的菌株发酵并进行酶活力检测,最终选取酶活较高的菌株作为后续发酵用菌株;
将筛选出的酿酒酵母单菌落接种于灭菌后的试管培养基中,在温度为28-30℃条件下培养12-16小时,试管培养基采用如下质量百分含量的原料组成:
蛋白胨1%-3%;酵母粉0.5%-1.5%;葡萄糖1%-3%;余量为水;pH=6.5-7.5;
酿酒酵母为安琪酵母股份有限公司生产,产品标准代码为GB/T20886;
A2、纯化及复壮后菌种的保藏
按质量比为1:1-3的比例,将步骤A1培养后的菌种置于质量百分含量为30%-50%的无菌甘油溶液中于-20℃保藏;
B、发酵制备含有己糖激酶的发酵液
将步骤A2中保藏的菌种活化后接种于灭菌后的发酵培养基中,在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵制成含有己糖激酶的发酵液;
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成:
蛋白胨1%-3%;酵母粉0.5%-1.5%;葡萄糖1%-3%,余量为水;pH=6.5-7.5;
C、对发酵液进行后处理制备己糖激酶粗酶液;
D、对己糖激酶粗酶液进行纯化。
2.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤B包括如下工序:
B1、摇瓶种子的制备
将步骤A2中保存的菌种活化后,按质量百分含量为1%-4%的接种量接种于灭菌后的摇瓶种子培养基中,在温度为28℃-30℃,转速为180-220rpm的条件下培养12-16小时制成摇瓶种子液;
摇瓶种子培养基采用如下质量百分含量的原料组成:
蛋白胨1%-3%;酵母粉0.5%-1.5%;葡萄糖1%-3%;余量为水;pH=6.5-7.5;
摇瓶装液量为15%-25%;
B2、发酵罐发酵
将步骤B1中制成的摇瓶种子液按照体积百分含量为1%-4%的接种量接种于灭菌后的发酵培养基中,在温度为28℃-30℃、压力为0.03MPa-0.05MPa、搅拌转速为150rpm-200rpm的条件下发酵36-40小时制成含有己糖激酶的发酵液;
发酵培养基采用如下质量百分含量的原料组成:
蛋白胨1%-3%;酵母粉0.5%-1.5%;葡萄糖1%-3%,余量为水;pH=6.5-7.5;
发酵罐装量为60%-70%。
3.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤C的工艺步骤如下:
将步骤B制成的含有己糖激酶的发酵液离心弃上清后收集菌体,将收集到的菌体溶解于pH=7.6、浓度为40-50mmoL的TEA-HCl中并置于碎冰上用超声波对菌体破壁,将破壁后的溶液体系离心后收集上清制成己糖激酶粗酶液。
4.根据权利要求1所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤D包括如下工艺步骤:
D1、将步骤C制备的己糖激酶粗酶液经过中空纤维超滤滤除小分子杂质;
D2、利用阴离子交换柱对步骤D1超滤处理后的粗酶液纯化,包括如下步骤:
D2-1、上样缓冲液Tris-HCl平衡4-5个柱体积后进行样品上样,流速为1-2mL/min;
D2-2、用上样缓冲液Tris-HCl洗3-4个柱体积,使未与填料结合的杂蛋白完全去除;
D2-3、用含有浓度为0-0.5mol/L的NaCl溶液的上样缓冲液Tris-HCl线性洗脱15-25个柱体积,流速为1-3mL/min,收集洗脱液;
D2-4、将洗脱液中有己糖激酶酶活力的样品合并,进行下一步纯化;
步骤D2-1、D2-2中所述的上样缓冲液Tris-HCl浓度为0.01-0.05mol/L,pH=6.0-7.0,步骤D2-3中所述的上样缓冲液Tri s-HCl浓度为0.01-0.05mol/L,pH=7.0-8.0;
D3、用Tris-HCl缓冲液平衡4-5个柱体积的Sephadex凝胶柱,然后将步骤D2-4纯化后的样品浓缩液上样0.3-0.6mL,洗脱速度0.5-1mL/min,收集有己糖激酶酶活性的洗脱液,进行SDS-PAGE凝胶电泳,所述的Tris-HCl缓冲液浓度为6-12mmol/L、pH=6.0-8.0、其中NaCl 0.05-0.2mol/L。
5.根据权利要求2所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤B2中是将步骤B1中制成的摇瓶种子液接种于灭菌后温度为25℃-32℃的发酵培养基。
6.根据权利要求3所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤C中破壁体系的装液量为容器总体积的50%-80%,选用6mm变幅杆、200W-300W的功率破壁7-15分钟,破壁过程采用间歇破壁,即每破壁1-1.5秒间歇1-1.5秒。
7.根据权利要求4所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤D1中中空纤维的截留分子量为10KD-15KD。
8.根据权利要求4所述的诊断用己糖激酶的制备方法,其特征在于所述的步骤D2中阴离子交换柱的规格为DEAE Sepharose FF。