一种利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法
【专利摘要】本发明公开了一种利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，是以半乳糖或（2-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖、6-脱氧半乳糖）、乳糖、UTP、ATP、二硫苏糖醇、MgCl2、酵母无机焦磷酸酶、Tris-HCl缓冲液为反应体系，分别加入半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α-(1→4)半乳糖基转移酶LgtC三种酶进行反应，之后离心除蛋白，收集含Globotriose的上清液并用活性炭色谱柱和分子筛柱纯化，经冷冻干燥后得到粉末状Globotriose及其类似物。本发明方法中所用底物主要为半乳糖，其价格便宜，来源广泛；且所用到的酶SpGalK、SpGalU和LgtC具有广泛的底物适应性，为大量快速的生产Globotriose及其类似物提供了可能。
【专利说明】—种利用一锅酶法制备G 1botr iose及其类似物的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种多糖的制备方法,尤其涉及一种利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，属于生物【技术领域】。
【背景技术】
[0002]Gb3 (Globotriose)是Gb3_cer的碳水化合物部分,参与许多生理学过程。例如，在 Burkitt’ s 淋巴瘤(Mangeney et al.，1993),睾丸癌(Kang et al.，1995)，结肠腺瘤(Kovbasnjuk et al.，2005)和乳腺癌(Johansson et al., 2009)中经常发生Gb3_cer 过量表达。Gb3可以用在结肠癌症治疗中，因为它可以诱导肿瘤细胞的选择性凋亡(FalguiSreset al.，2008)。Desselle A.等人最近发现，与静止期的细胞相比，增殖的内皮细胞中Gb3大量表达。这个研究表明，在抑制血管生成和肿瘤发展中Gb3是一种有效的分子标记(Desselle et al.，2012)。Gb3也参与自然杀伤T(iNKT)细胞形成，它的积累是(iNKT)细胞数量减少和其与树突状(DCs)相互作用减弱的主要起因(Porubsky et al.，2012)。最新研究表明，Gb3的状态是机体对HIV-1感染敏感度的重要指标。当细胞表面Gb3表达增多时，机体对HIV-1感染的抵抗性增加(Lund et al.，2009，Branch.，2010)。Gb3及其类似物功能及应用的开发或许能找到一种抑制HIV/AIDS的新的治疗方法。
[0003]许多人类的病原菌触发疾病是通过连接它们的微生物黏附蛋白到宿主细胞粘膜表面糖复合物的糖链上。来自于病原菌0157:H7的志贺氏毒素通过与肠细胞表面的糖链Gb3[Gala (I, 4)Gal^ (l,4)Glc]结合引起痢疾甚至是致命性的溶血性综合尿毒症(HUS) (Paton et al., 1998;Boyce et al., 1995)。Stx 和 Gb3 的相互作用为我们提供了一种有前景的抗 Stx 感染的治疗策略(Takeda et al., 1999;Li et al., 2012;Paton etal.,2000;Pinyon et al., 2004;Paton., 2010).。
[0004]由于Gb3在临床前期和免疫研究中的重要作用，许多实验组对Gb3的合成进行了研究(Liu et al., 2003; Yao et al., 2005; Antoine et al., 2005; Zhou et al., 2011) ? 一般来说，多糖的化学合成法涉及到反复的加保护和脱保护步骤，这种繁琐的合成步骤阻碍了它的应用。Ye等人报道了一种一锅法连续糖基化的方法，简化了化学合成的步骤。然而，与寡糖的生物酶法合成相比还是比较繁琐(Palcic et al.，1996)。最有效的酶法合成Gb3是直接以UDP-半乳糖作底物加上半乳糖基转移酶的催化，把半乳糖基连接到乳糖上。但是，以UDP-半乳糖作底物大规模生产Gb3的成本太高。由于现阶段Gb3合成方法的不足，探索新的合成Gb3的方法是迫切需要的。
【发明内容】
[0005]本发明针对现有技术的不足，提供一种利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法。
[0006]本发明所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法,步骤是:
[0007](I)按终浓度计，以半乳糖5~15mM,乳糖5~25mM, UTP5~15mM, ATP5~15mM,二硫苏糖醇I~IOmM, MgCl25~35mM，酵母无机焦磷酸酶O~10U，pH7.0~8.0的Tris_HCl缓冲液10~300mM为反应体系，加入终浓度均为0.5~1.5mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0008](2)置30~45°C水浴条件下，反应时间5~50h ;
[0009](3)将反应后溶液置于沸水中煮3~10分钟使其中的酶沉淀，然后以10000~12000转/分离心5~15分钟,收集含Globotriose的上清液；
[0010](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用5~20倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用5~25倍柱体积的2%~8%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用I~16倍柱体积的12%~25%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液；
[0011](5)将步骤(4)获得的Globotriose溶液浓缩后过分子筛柱，用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0012](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose产品；
[0013]上述制备方法中，若将终浓度为5~15mM的2-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖或6-脱氧半乳糖替换步骤(1)中的半乳糖，进行步骤(1)至步骤(5)所述的同样步骤，即可得到其相应的Globotriose的类似物。
[0014]进一步的,上述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法中:
[0015]步骤(1)所述反应体系优选按终浓度计，半乳糖8mM,乳糖15mM,UTPlOmM, ATPlOmM，二硫苏糖醇 5mM，MgCl220mM，酵母无机焦磷酸酶 2U，pH7.5 的 Tris-HCl 缓冲液IOOmM。
[0016]步骤(1)所述半乳糖激酶S`pGalK、UTP-葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC由如下方法制得:
[0017]①将来源于Streptococcus pneumonia TIGR4基因组中SpGalK基因重组到载体质粒pMCSG7 上，得到重组质粒 pMCSG7_SpGalK ;将来源于 Streptococcus pneumonia TIGR4基因组中的SpGalU基因重组到载体质粒pET15b上，得到重组质粒pET15b_SpGalU ;将来源于Neisseria.Meningitidis MC58基因组中的LgtC基因重组到载体质粒pET15b上,得到重组质粒pET15b-lgtC ；
[0018]②将上述三个异源重组质粒分别导入到大肠杆菌BL21中，得到分别含有pMCSG7-SpGalK、pET15b_SpGalU 或 pET15b_lgtC 质粒的重组大肠杆菌 BL21 ；
[0019]③将上述三种重组大肠杆菌BL21分别在含有1%。氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG在16°C诱导20h，之后收集菌体超生破碎，对破碎后的菌液离心收集上清，用亲和镍柱纯化，分别收集含SpGalK、SpGalU或LgtC蛋白的洗脱液，超滤脱盐，即分别得到半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC的溶液。
[0020]步骤(2)所述水浴温度优选37°C，反应时间优选25~30h。
[0021]步骤(4)所述上清液过活性炭色谱柱的方法是:先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为 2.5cmX14cm。[0022]步骤(5)所述分子筛柱优选用Bio-Gel P_2gel尺寸为2.5cmX IOOcm的分子筛柱。
[0023]步骤(5)所述将Globotriose 溶液优选用 Eppendorf Concentrator Plus 真空浓缩机浓缩。
[0024]上述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法中:所述替换半乳糖的2-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖或6-脱氧半乳糖的终浓度优选是8mM。
[0025]本发明公开了一种简便有效地利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法。本发明方法合成Globotriose所用底物为半乳糖，价格便宜，来源广泛，大大降低了Globotriose的生产成本,可以应用于Globotriose的大规模生产；一锅酶法是在温和的液体条件下进行，连续的糖基化步骤都发生在一个反应容器内，这就避免了中间产物的反复分离和纯化，大大简化了工艺流程；本合成法所用到的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC具有广泛的底物适应性，这就为大量快速的生产多种Globotriose类似物提供了 可能。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明所述一锅酶法制备Globotriose及其类似物的反应示意图，其中Gal，半乳糖；Lac，乳糖。
[0027]图2为以半乳糖为供体底物一锅酶法合成产物的薄板层析色谱(TLC)图。
[0028]图3为以半乳糖为供体底物一锅酶法合成产物的质谱(MS)图。
[0029]图4为以三种半乳糖类似物为供体底物一锅酶法合成产物的薄板层析色谱(TLC)图。
[0030]其中:P2，2-脱氧半乳糖的产物；P4，4-脱氧半乳糖的产物；P6，6_脱氧半乳糖的产物。
[0031]图5为以2-脱氧半乳糖为供体底物一锅酶法合成产物的质谱(MS)图。
[0032]图6为以4-脱氧半乳糖为供体底物一锅酶法合成产物的质谱(MS)图。
[0033]图7为以6-脱氧半乳糖为供体底物一锅酶法合成产物的质谱(MS)图。
【具体实施方式】
[0034]下面结合实施例对本发明做进一步描述，实施例中的实验方法及试剂如无特殊说明，均为本领域常规方法与市售试剂。
[0035]实施例1半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC的制备
[0036]本发明所述半乳糖激酶(SpGalK，E.C.2.7.1.6)和UTP-葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶(SpGalU, E.C.2.7.7.9)来自于肺炎链球菌(Streptococcus pneumonia TIGR4)；α -(I — 4)半乳糖基转移酶(LgtC, E.C.2.4.1.44)来自于脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria.Meningitidis MC58)。
[0037]1.构建含有SpGalK, SpGalU或LgtC的三种质粒
[0038]将来源于Streptococcus pneumonia TIGR4基因组中SpGalK基因重组到载体质粒pMCSG7上，得到重组质粒pMCSG7-SpGalK ;其中所用引物如下:[0039]SpGalK 正引物:5’ -TACTTCCAATCCAATGCGATGGCACAACATCTTACT-3’
[0040]SpGalK 反引物:5，-TTATCCACTTCCAATGCTAGTCAAGGACGCGAG-3’
[0041]将来源于Streptococcus pneumonia TIGR4基因组中的SpGalU基因重组到载体质粒pET15b上，得到重组质粒pET15b-SpGalU ;其中所用引物如下:
[0042]SpGalU 正引物:5 ’ -CGCGGATCCATGACATCAAAAGTTAG-3 ’
[0043]SpGalU 反引物:5’ -GCTCTAGA TTATTCCTTCTCAGTC-3，
[0044]将来源于Neisseria.Meningitidis MC58基因组中的LgtC基因重组到载体质粒Petl5b上，得到重组质粒pET15b-lgtC ;其中所用引物如下:
[0045]LgtC 正引物:5，-CGGAATTCATATGGACATCGTATTTGCG-3 ’
[0046]LgtC 反引物:5，-GCCGGATCCTCATCAGTGCGGGACGGCAAGTTTGCC-3 ’
[0047]2.半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC的溶液的制备
[0048]将上述三个异源重组质粒(pMCSG7-SpGalK、pET15b_SpGalU和 pET15b_lgtC)分别导入到大肠杆菌BL21 (E.coli BL21)中，得到分别含有pMCSG7_SpGalK、pET15b_SpGalU或pET 15b-l gtC质粒的重组大肠杆菌BL21。
[0049]将上述三种重组大肠杆菌BL21分别在含有1%。氨苄抗生素的LB(Luria-Bertani)液体培养基中培养，生长条件为37°C、220转/分。当培养的菌液0D_达到0.6 - 0.8时，加IPTG诱导，并使IPTG的终浓度为0.2mM，然后在16°C的条件下培养20h，之后10000转 / 分离心 10 分钟，收集菌体并用 40mT,的 start buffer (500mM NaCl, 20mM Tris - HClbuffer, pH8.0)溶解菌体。把溶解的菌液在冰浴条件下超生破碎20分钟(400W)。破碎后的菌液在4°C条件下，12000转/分离心30分钟,然后收集上清并加入到已用start buffer预平衡过的5mL的亲和镍柱中。经过10个柱体积的washing buffer (500mM NaCl, 20mMTris - HCl buffer, 20mMimidazole, pH8.0)洗漆，用 elution buffer (500mM NaCl, 20mMTris - HCl buffer, 500mM imidazole, pH8.0)洗脱，分别收集含 SpGalK>SpGalU 或 LgtC 蛋白的洗脱液。
[0050]将上述分别收集的蛋白洗脱液在4°C、4000转/分条件下超滤，用pH7.5,50mMTris - HCl缓冲液分别对三种含蛋白溶液脱盐，即分别得到了半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC的溶液。
[0051 ] 3.半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC分子量和浓度的测定
[0052]用12%SDS_PAGE电泳检测上述得到的半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC。检测结果是=SpGalK的分子量为47kDa、SpGalU的分子量为36kDa、LgtC的分子量为32kDa。
[0053]考马斯亮蓝法确定蛋白的浓度，用牛血清白蛋白(BSA)做蛋白标准曲线。检测结果是:SpGalK126.24mg/L、SpGalU107.05mg/L、LgtC68.9mg/L。
[0054]实施例2利用一锅酶法制备Globotriose
[0055](I)按终浓度计，以半乳糖8mM，乳糖15mM，UTPlOmM, ATPlOmM, 二硫苏糖醇5mM，MgCl220mM,酵母无机焦磷酸酶2U，pH7.5的Tris-HCl缓冲液IOOmM为反应体系，加入终浓度均为0.8mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0056](2)置37°C水浴条件下，反应时间30h ；
[0057](3)将反应后溶液置于沸水中煮5分钟使其中的酶沉淀，然后以10000转/分离心15分钟，收集含Globotriose的上清液；
[0058](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液,得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为2.5cm X 14cm ；
[0059](5)将步骤(4)获得的 Globotriose 溶液用 Eppendorf Concentrator Plus 真空浓缩机浓缩后过Bio-Gel P-2gel尺寸为2.5cmX 100cm的分子筛柱,用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0060](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose产品。
[0061]将上述粉末状Globotriose用薄板层析色谱法(TLC)和质谱法(MS)检测，在TLC的检测中，以正丁醇:乙酸:水=2:1:1 (体积比)作为展开剂。茴香醛-硫酸溶液作为显色剂。在MS检测中，用液相色谱-离子井-飞行时间(LCMS-1T-T0F)质谱仪进行正离子模式的检测。结果见图2、图3。
[0062]实施例3利用一锅酶法制备Globotriose[0063](I)按终浓度计，以半乳糖5mM，乳糖5mM，UTP5mM, ATP5mM, 二硫苏糖醇ImM, MgCl25mM, pH7.0的Tris-HCl缓冲液IOmM为反应体系，加入终浓度均为0.5mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶 LgtC ；
[0064](2)置30°C水浴条件下，反应时间50h ；
[0065](3)将反应后溶液置于沸水中煮3分钟使其中的酶沉淀，然后以12000转/分离心5分钟，收集含Globotriose的上清液；
[0066](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用5倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质,接着用5倍柱体积的8%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用2倍柱体积的25%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液；
[0067](5)将步骤(4)获得的Globotriose溶液浓缩后过分子筛柱，用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0068](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose产品。
[0069]实施例4利用一锅酶法制备Globotriose
[0070](I)按终浓度计，以半乳糖15mM，乳糖25mM，UTP15mM, ATP15mM, 二硫苏糖醇10mM，MgCl235mM，酵母无机焦磷酸酶10U，pH8.0的Tris-HCl缓冲液300mM为反应体系，加入终浓度均为1.5mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0071](2)置45°C水浴条件下，反应时间5h ；
[0072](3)将反应后溶液置于沸水中煮10分钟使其中的酶沉淀，然后以10000转/分离心12分钟，收集含Globotriose的上清液；
[0073](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用20倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用25倍柱体积的2%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用16倍柱体积的12%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液；
[0074](5)将步骤(4)获得的Globotriose溶液浓缩后过分子筛柱，用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0075](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose产品。
[0076]实施例5利用一锅酶法制备Globotriose的类似物
[0077](I)按终浓度计，以2-脱氧半乳糖8mM，乳糖15mM，UTPlOmM, ATPlOmM, 二硫苏糖醇5mM，MgCl220mM，酵母无机焦磷酸酶2U，pH7.5的Tris-HCl缓冲液IOOmM为反应体系，加入终浓度均为0.8mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0078](2)置37°C水浴条件下，反应时间30h ；
[0079](3)将反应后溶液置于沸水中煮5分钟使其中的酶沉淀，然后以10000转/分离心15分钟，收集含Globotriose的上清液；
[0080](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液,得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为2.5cm X 14cm ；
[0081](5)将步骤(4)获得的 Globotriose 溶液用 Eppendorf Concentrator Plus 真空浓缩机浓缩后过Bio-Gel P-2gel尺寸为2.5cmX 100cm的分子筛柱,用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0082](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose类似物产品。
[0083]将上述粉末状Globotriose类似物用薄板层析色谱法(TLC)和质谱法(MS)检测，结果见图4、图5。
[0084]实施例6利用一锅酶法制备Globotriose的类似物
[0085](I)按终浓度计，以4-脱氧半乳糖8mM，乳糖15mM，UTPlOmM, ATPlOmM, 二硫苏糖醇5mM，MgCl220mM，酵母无机焦磷酸酶2U，pH7.5的Tris-HCl缓冲液IOOmM为反应体系，加入终浓度均为0.8mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0086](2)置37°C水浴条件下，反应时间30h ；
[0087](3)将反应后溶液置于沸水中煮5分钟使其中的酶沉淀，然后以10000转/分离心15分钟,收集含Globotriose的上清液；
[0088](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液,得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为2.5cm X 14cm ；
[0089](5)将步骤(4)获得的 Globotriose 溶液用 Eppendorf Concentrator Plus 真空浓缩机浓缩后过Bio-Gel P-2gel尺寸为2.5cmX 100cm的分子筛柱,用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0090](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose类似物产品。[0091]将上述粉末状Globotriose类似物用薄板层析色谱法(TLC)和质谱法(MS)检测，结果见图4、图6。
[0092]实施例7利用一锅酶法制备Globotriose的类似物
[0093](I)按终浓度计，以6-脱氧半乳糖8mM，乳糖15mM，UTPlOmM, ATPlOmM, 二硫苏糖醇5mM，MgCl220mM，酵母无机焦磷酸酶2U，pH7.5的Tris-HCl缓冲液IOOmM为反应体系，加入终浓度均为0.8mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ；
[0094](2)置37°C水浴条件下，反应时间30h ；
[0095](3)将反应后溶液置于沸水中煮5分钟使其中的酶沉淀，然后以10000转/分离心15分钟，收集含Globotriose的上清液；
[0096](4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液,得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为2.5cm X 14cm ；
[0097](5)将步骤(4)获得的 Globotriose 溶液用 Eppendorf Concentrator Plus 真空浓缩机浓缩后过Bio-Gel P-2gel尺寸为2.5cmX 100cm的分子筛柱,用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液；
[0098](6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose类似物产品。
[0099]将上述粉末状Globotriose类似物用薄板层析色谱法(TLC)和质谱法(MS)检测，结果见图4、图7。
【权利要求】
1.一种利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法,步骤是: (1)按终浓度计，以半乳糖5~15mM,乳糖5~25mM,UTP5~15mM，ATP5~15mM, 二硫苏糖醇I~IOmM, MgCl25~35mM，酵母无机焦磷酸酶O~10U，pH7.0~8.0的Tris-HCl缓冲液10~300mM为反应体系，加入终浓度均为0.5~1.5mg/L的半乳糖激酶SpGalK、UTP-葡萄糖-1-磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC ； (2)置30~45°C水浴条件下，反应时间5~50h; (3)将反应后溶液置于沸水中煮3~10分钟使其中的酶沉淀，然后以10000~12000转/分离心5~15分钟，收集含Globotriose的上清液； (4)将步骤(3)获得的上清液过活性炭色谱柱，即:先用5~20倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用5~25倍柱体积的2%~8%的乙醇洗去反应后余下的乳糖,再用I~16倍柱体积的12%~25%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液； (5)将步骤(4)获得的Globotriose溶液浓缩后过分子筛柱，用去离子水洗脱并收集洗脱液，得到二次纯化的Globotriose溶液； (6)将步骤(5)得到的洗脱液冷冻干燥，得到粉末状Globotriose产品； 上述制备方法中，若将终浓度为5~15mM的2-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖或6-脱氧半乳糖替换步骤(1)中的半乳糖，进行步骤(1)至步骤(5)所述的同样步骤，即可得到其相应的Globotriose的类 似物。
2.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:步骤(1)所述反应体系是按终浓度计，半乳糖8mM，乳糖15mM，UTPlOmM, ATPlOmM，二硫苏糖醇5mM，MgCl220mM，酵母无机焦磷酸酶2U，pH7.5的Tris-HCl缓冲液lOOmM。
3.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:步骤(1)所述半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC由如下方法制得: ①将来源于Streptococcuspneumonia TIGR4基因组中SpGalK基因重组到载体质粒pMCSG7 上，得到重组质粒 pMCSG7_SpGalK ;将来源于 Streptococcus pneumonia TIGR4 基因组中的SpGalU基因重组到载体质粒pET15b上，得到重组质粒pET15b_SpGalU ;将来源于Neisseria.Meningitidis MC58基因组中的LgtC基因重组到载体质粒pET15b上,得到重组质粒 pET15b_lgtC ； ②将上述三个异源重组质粒分别导入到大肠杆菌BL21中，得到分别含有pMCSG7-SpGalK、pET15b_SpGalU 或 pET15b_lgtC 质粒的重组大肠杆菌 BL21 ； ③将上述三种重组大肠杆菌BL21分别在含有1%。氨苄抗生素的LB液体培养基中培养，然后加IPTG在16°C诱导20h，之后收集菌体超生破碎，对破碎后的菌液离心收集上清，用亲和镍柱纯化，分别收集含SpGalK、SpGalU或LgtC蛋白的洗脱液，超滤脱盐，即分别得到半乳糖激酶SpGalK、UTP_葡萄糖_1_磷酸尿甙基转化酶SpGalU和α - (I — 4)半乳糖基转移酶LgtC的溶液。
4.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:步骤(2)所述水浴温度是37°C，反应时间是25~30h。
5.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:步骤(4)所述上清液过活性炭色谱柱的方法是:先用10倍柱体积的蒸馏水洗去无机杂质，接着用12倍柱体积的5%的乙醇洗去反应后余下的乳糖，再用14倍柱体积的15%的乙醇洗脱并收集洗脱液，得到初步纯化的Globotriose溶液；其中所述活性炭色谱柱的尺寸为2.5cmX 14cm。
6.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法,其特征在于:步骤(5)所述分子筛柱选用Bio-Gel P-2gel尺寸为2.5cmX IOOcm的分子筛柱。
7.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:步骤(5)所述将Globotriose溶液用Eppendorf Concentrator Plus真空浓缩机浓缩。
8.如权利要求1所述利用一锅酶法制备Globotriose及其类似物的方法，其特征在于:所述替换半乳糖的2-脱氧半乳糖、4-脱氧半乳糖或6-脱氧半乳糖的终浓度是8mM。
【文档编号】C12P19/18GK103740788SQ201410019795
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2014年1月16日 优先权日:2014年1月16日
【发明者】陈敏, 赵雪尔, 王鹏 申请人:山东大学