本发明属于生物技术领域，具体涉及一种D型氨基酸抗菌肽PRW4-d及其制备方法和应用。
背景技术：
抗生素作为饲料添加剂的应用要追溯到1943年，但是近年来研究表明抗生素的应用在带给人们极大利益的同时，抗生素耐药菌开始出现在饲喂抗生素的动物中，以及患有疾病的人类和动物中。人们对饲喂抗生素产生耐药性的关注远超于其对产业利益的关注。
抗菌肽(Antimicrobial Peptide，AMP)，又被称为宿主防御肽(Host Defense Peptide，HDP)，是机体内源免疫系统的重要组成部分，是宿主抵御外来病原菌侵袭的首要屏障。抗菌肽来源广泛，包括动物、植物、微生物等，具有抗菌、抗癌、抗寄生虫、抗病毒、免疫调节等多种生物学功能。抗菌肽主要是通过破坏细胞膜发挥作用的，不易产生耐药性，因此是开发新型抗菌药物的理想模板。但是天然的阳离子抗菌肽并非完美无缺，大部分天然抗菌肽存在抗菌活性不强、抗菌谱相对较窄、合成成本较高、部分抗菌肽对真核生物有一定的毒性、在具有对病原微生物高杀灭活性的同时往往伴随着对真核生物的溶血作用和对蛋白酶敏感等不足。因此如何提高其活性和最大程度降低其毒性成为抗菌肽分子改造的目的，也是目前抗菌肽药物开发的难点和希望所在。所以，通过改造抗菌肽使其具有更高的抑菌活性，降低其毒性，提高其稳定性已成为现在研究的热点。
技术实现要素：
基于以上不足之处，本发明提供一种D型氨基酸抗菌肽PRW4-d及其制备方法和应用；该方法在通过螺旋倾向性的改造提高对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌活性较高降低细胞毒性的同时利用D型氨基酸提高其稳定性。
本发明的目的通过如下技术实现：一种D型氨基酸抗菌肽PRW4-d，序列如序列表SEQ ID No.1所示。
本发明还具有如下技术特征：
1、如上所述的一种D型氨基酸抗菌肽PRW4-d的制备方法包括如下步骤：
(1)以抗菌肽PRW4为模板，利用具有不同螺旋倾向性的氨基酸D-色氨酸替换抗菌肽PRW4中的色氨酸；将PRW4中的赖氨酸全部替换成精氨酸；
(2)采用固相化学合成法通过多肽合成仪得到肽树脂，将得到的肽树脂经过TFA切割后，得到一条多肽PRW4-d；
(3)经过反相高效液相色谱纯化和质谱鉴定后，即完成多肽的制备。
2、如上所述的一种D型氨基酸抗菌肽PRW4-d，在制备治疗革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌感染性疾病药物中的应用。
本发明的抗菌肽的制备技术简单，对得到的抗菌肽进行抗菌和溶血活性检测，发现PRW4-d对大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等多种菌种有明显的抑制作用，而且具有很低的溶血活性，该肽表现出较高的细胞选择性。综上所述，PRW4-d是一种具有较高应用价值的抗菌肽。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
抗菌肽的设计
首先，截取来源于猪骨髓含36个氨基酸的阳离子抗菌肽PMAP-36的N末端的16个氨基酸序列，命名为RI16，截取后的该序列具有完美的两亲性结构。其次，基于α-螺旋蛋白质框架和折叠原则设计非完美两亲性抗菌肽进而得到PRW4。
以抗菌肽PRW4为模板，分别利用具有不同螺旋倾向性的氨基酸半胱氨酸(Cys)、天门冬氨酸(Asp)、异亮氨酸(Ile)、脯氨酸(Pro)和D-色氨酸(D-Trp)替换PRW4中的色氨酸。同时，为了研究精氨酸(Arg)的重要作用，将PRW4中的Lys全部替换成Arg。其中，用D-色氨酸(D-Trp)替换的抗菌肽PRW4-d的氨基酸序列如表1所示。
表1衍生肽的氨基酸序列
肽的羧基末端酰胺化以提高一个正电荷并增加肽的稳定性。
实施例2
固相化学合成法合成抗菌肽
1、抗菌肽的制备从C端到N端逐一进行，通过多肽合成仪来完成。首先将Fmoc-X(X是每个抗菌肽的C端第一个氨基酸)接入到Wang树脂，然后脱去Fmoc基团后得到X-Wang树脂；再将Fmoc-Y-Trt-OH(9-芴甲氧羧基-三甲基-Y，Y为每个抗菌肽C端第二个氨基酸)；按照这个程序依次从C端合成到N端，直至合成完毕，得到脱去Fmoc基团的侧链保护的树脂。
2、在上述得到的肽树脂中，加入切割试剂，20℃避光下反应2h，过滤；沉淀TFA(三氟乙酸)洗涤，将洗液与上述滤液混合，旋转蒸发仪浓缩，再加入10倍左右体积的预冷无水乙醚，-20℃沉淀3h，析出白色粉末物，以2500g离心10min，收集沉淀，再用无水乙醚洗涤沉淀，真空干燥，得到多肽，其中切割试剂由TFA、水和TIS(三异丙基氯硅烷)按照质量比95:2.5:2.5混合而成。
3、使用0.2mol/L硫酸钠(磷酸调节至pH7.5)进行柱平衡30min，用90％乙腈水溶液溶解多肽，过滤，C18反相常压柱，采用梯度洗脱(洗脱剂为甲醇和硫酸钠水溶液按照体积比为30:70～70:30混合)，流速为1mL/min，检测波为220nm，收集主峰，冻干；再利用反相C18柱进一步纯化，洗脱液A为0.1％TFA/水溶液；洗脱液B为0.1％TFA/乙腈溶液，洗脱浓度为25％B～40％B，洗脱时间为12min，流速为1mL/min，再同上收集主峰，冻干。
4、抗菌肽的鉴定：将上述得到的抗菌肽经过电喷雾质谱法分析，抗菌肽的纯度大于95％。
实施例3：抗菌肽抗菌活性的测定
1、抗菌活性的测定：将肽配置成为一定储存液以备使用。利用微量肉汤稀释法测定几种抗菌肽的最小抑菌浓度。以0.01％乙酸(含0.2％BSA)作为稀释液，使用二倍稀释法依次配置系列梯度的抗菌肽溶液。取上述溶液100μL置于96孔细胞培养板中，然后分别添加等体积的待测菌液(～105个/mL)于各孔中。分别设置阳性对照(含有菌液而不含有抗菌肽)和阴性对照(既不含菌液也不含肽)。37℃恒温培养20h，以肉眼未见孔底部有混浊现象的即为最小抑菌浓度。结果表明，与抗菌肽PRW4相比，D-色氨酸取代的抗菌肽PRW4-d比Cys(C4)、Asp(D4)、Ile(I4)和Pro(P4)取代的抗菌肽活性高；同时，经精氨酸取代后的抗菌肽的抗菌活性和细胞选择性都有了进一步的提高。抗菌肽PRW4-d的检测结果如表2所示。
表2抗菌肽的抑菌活性
通过表2可以看出，PRW4-d对于革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的抑菌效果都很好，因此PRW4-d具有成为新一代抗菌药物的潜力。
2、溶血活性的测定：采集人的新鲜血液1mL，肝素抗凝后溶解到2mLPBS溶液中，1000g离心5min，收集红细胞；用PBS洗涤3遍，再用10mL PBS重悬；取50μL红细胞悬液与50μL用PBS溶解的不同浓度的抗菌肽溶液混合均匀，在37℃培养箱内恒温孵育1h；lh后取出，4℃、1000g离心5min；取出上清液用酶标仪在570nm处测光吸收值；每组取平均值，并比较分析。其中50μL红细胞加50μLPBS作为阴性对照；50μL红细胞加50μL0.1％Tritonx-100作为阳性对照。最小溶血浓度是抗菌肽引起10％溶血率时的抗菌肽浓度。PRW4-d的溶血活性检测结果如表3所示。
表3抗菌肽溶血活性的测定
通过表3可以看出,随着序列增加其抗菌活性显著提高。综合分析抗菌肽的抑菌和溶血活性，可以通过治疗指数(溶血浓度与抑菌浓度的比值)来更全面的评价各个抗菌肽的生物学活性。由表3可以看出，设计得到的PRW4-d抗菌肽具有较高的替代抗生素的发展潜力。
<110> 东北农业大学
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<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
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Arg Phe Arg Arg Leu Arg Trp dLys Thr Arg Trp dArg Leu Lys Lys Ile-NH2
1 5 10 15