一株生物合成20‑羟基‑23,24‑二降胆‑4‑烯‑3‑酮的分枝杆菌及合成方法与流程

本发明涉及一种生产甾体激素的菌株和制备方法，具体是一株生物合成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮(22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one)的分枝杆菌及其合成方法。

背景技术：

20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，英文名为22-hydroxy-23,24-bisnorchol-4-ene-3-one，化学式为C₂₂H₃₄O₂，分子量为330.25。20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮可以作为合成许多甾体激素药物的中间体，如肾上腺皮质激素，孕激素，蛋白同化激素等。

二十世纪70年代，研究学者在考察利用分枝杆菌转化甾醇为C19甾体化合物(雄甾-4-烯-3,17-二酮，雄甾-1,4-二烯-3,17-二酮)时，20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮做为一种副产物被发现并且鉴定出来，产量仅为40μg/ml，与主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮的比例不到1/10(Marsheck W J,Karychy S,Muir R D.Microbial degradation of sterols.Applied Microbiology,1972,23:72-77；US Pat.No.3759791)。为了提高20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的产量，研究学者通过诱变选育或基因改造的手段去改造菌种，取得了相应的研究成果。US Pat.No.4223091报道了用紫外诱变的方法得到一株分枝杆菌Mycobacterium parafortuitum complex MCI0617，转化胆固醇得到的主产物为20-羟基-23,24-二降胆-1,4-二烯-3-酮，副产物为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，产量为0.44g/l。Xu等报道了用基因改造的手段得到的分枝杆菌，利用大量静息细胞转化植物甾醇，底物投料浓度为40g/l，转化144h，底物转化率仅60％，得到的主产物为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，摩尔产率为47％，反应中还包含其它副产物，不适合大规模工业生产(Xu L Q,Liu Y J,Yao K,et al.Unraveling and engineering the production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism,2016,6:21928)。

综上所述，目前由甾醇制备20-羟基-23,24-二降胆-1,4-二烯-3-酮的方法，还存在转化效率低，副产物多，转化时间长等问题，仍需要探索利用新的菌种转化甾醇制备20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的研究，从而提高投料浓度、产率和产品纯度，以进一步降低生产成本，同时减少对环境的污染。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一株发酵植物甾醇生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16，并提供了使用该分枝杆菌生物合成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下：

本发明提供一株发酵植物甾醇生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16，该菌株已于2016年11月3日在国家知识产权局指定的保藏单位保藏，保藏单位名称为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为Mycobacterium sp.，保藏编号为CGMCC NO.13234。分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16通过自行分离得到的分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3诱变选育得到。原始菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3，该菌株转化植物甾醇得到主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮，副产物20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，两者的比例为2∶1。该菌株于天津益海嘉里油脂公司的土壤中筛选得到。

所述分枝杆菌(Mycobacterium sp.)FJH0105-16的主要特征如下：革兰氏染色阳性，细胞为杆状，菌落圆形，规则，表面光滑，边缘整齐，质地粘状，菌落颜色为黄色。其16S rDNA具有如序列表中所示的核苷酸序列，序列长度为1422bp。

本发明的发酵反应方程式可为：

利用上述的菌株发酵生产20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，该方法包括如下步骤：

(1)斜面种子培养：将Mycobacterium sp.FJH0105-16接种于斜面种子培养基，28～32℃培养3-4天，所述斜面培养基配方为，马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，自然pH值；

(2)一级种子培养：将上述斜面种子培养的菌落接入液体种子培养基中，28～32℃，180～220r/min培养2-4天，得到种子液，所述液体种子培养基的配方为，葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na₂HPO₄ 4.5g/l，KH₂PO₄ 3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0；

(3)发酵罐发酵转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮：将步骤(2)得到的种子液体按照接种量10-15％，在28～32℃，转速为400～600rpm，通气比0.2～0.4vvm条件下转化120～192小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆40～60g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油50～200g/l，植物甾醇5～40g/l，pH 7.0。

(4)产物的分离提取：加入等体积乙酸乙酯萃取三次，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂，得到20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮粗品，重结晶后得到产品。

本发明的有益效果：本发明所提供的菌株发酵制备20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，能以高底物投料浓度，获得高收率的目标产物，摩尔收率不低于71％，得到的产品纯度高，大于95％，易于分离纯化，降低了生产成本，同时减少对环境的污染。相对于现有技术具有明显的进步。

附图说明

图1所示的是20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮标样的HPLC图；

图2所示的是实施例中转化产品20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的HPLC图；

图3所示的是实施例制得的20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的¹H-NMR图。

具体实施方式

实施例1：诱变获得菌株Mycobacterium sp.FJH0105-16

1.1原生质体制备

原始菌株为分枝杆菌(Mycobacterium sp.)1229-3，该菌株转化植物甾醇得到主产物雄甾-4-烯-3,17-二酮，副产物20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮，两者的比例为2∶1。该菌株于天津益海嘉里油脂公司的土壤中筛选得到。将保藏的原始菌株甘油管融化后以2％的接种量接种于种子培养基中，30℃，200rpm培养36h，将种子液以5％接种量转接到含12.5g/l甘氨酸的种子培养基中，培养24h，6000rpm，10min收集菌体。用高渗缓冲液(加0.2％吐温80)洗涤菌体两遍。将菌体重悬到高渗酶解液中，溶菌酶浓度50mg/ml，酶解3h，8000rpm，20min离心去除上清酶液，再用高渗缓冲液将沉淀重悬，即得原生质体悬液。

种子培养基：酵母提取物10g/l，Na₂HPO₄ 4.5g/l，KH₂PO₄ 3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0。

高渗缓冲液：蔗糖171g/l，马来酸2.32g/l，六水氯化镁4.06g/l，pH 6.5。

1.2原生质体诱变

将得到的原生质体悬液，分别加入不同浓度的MNNG(0.1-2.0mg/ml),于30℃，85rpm避光振荡1h。诱变后的原生质体悬液稀释不同倍数涂布于高渗再生固体培养基上，培养4-6天以获得单菌落。

高渗再生固体培养基：蔗糖103g/l，硫酸钾0.25g/l，六水氯化镁10.12g/l，葡萄糖10g/l，酵母提取物5g/l，磷酸二氢钾0.05g/l，二水氯化钙2.22g/l，Tris乙磺酸5.73g/l，琼脂15g/l。

1.3菌株筛选

挑取高渗再生固体培养基上的菌落接种到初筛培养基中，凡是在初筛培养基中能快速生长的菌株，再进行摇瓶转化测试。

初筛培养基：醋酸铵1.5g/l，磷酸二氢钾0.8g/l，磷酸氢二钾0.4g/l，七水硫酸镁0.2g/l，七水硫酸亚铁0.005g/l，七水硫酸锌0.002g/l，七水氯化锰0.0005g/l，植物甾醇0.8g/l，琼脂15g/l，pH 7.0。

1.4菌种摇瓶转化测试

诱变后的菌株在液体种子培养基中，30℃，200rpm培养3天，以10％的接种量转接到转化培养基中，30℃，200rpm，转化3天，转化样品用三倍体积的乙酸乙酯萃取，取上清进行高效液相色谱(HPLC)分析，根据液相结果确定目标菌株优劣。

高效液相色谱测定方法：色谱柱：Agilent C18(4.6mm×250mm，5μm)，流动相：甲醇∶水＝80∶20，柱温30℃，等梯度洗脱，流速为1.0ml/min，进样量2μl，检测波长254nm。

液体种子培养基：葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na₂HPO₄ 4.5g/l，KH₂PO₄ 3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0。

转化培养基：甘油5g/l，硫酸铵3g/l，七水硫酸镁0.2g/l，七水硫酸亚铁0.01g/l，七水硫酸锌0.002g/l，植物甾醇5g/l，0.05M磷酸缓冲液，pH 7.0。

通过上述方法筛选得到一株优秀的变异菌株，将之命名为分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，即分枝杆菌(Mycobacterium sp.)CGMCC NO.13234。

实施例2：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法

2.1斜面种子培养

将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCC NO.13234，30℃培养3天。所述斜面培养基配方为，马铃薯200g/l，葡萄糖20g/l，琼脂15g/l，pH值自然。

2.2一级种子培养

将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养2天，得到种子液。所述液体种子培养基的配方为，葡萄糖6g/l，酵母提取物10g/l，Na₂HPO₄4.5g/l，KH₂PO₄3.4g/l，0.2％吐温80，pH 7.0。

2.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮

将步骤2.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量10％，转化温度30℃，转速400rpm，通气比0.2vvm，转化时间72小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆40g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油50g/l，植物甾醇5g/l，pH 7.0。

2.4产物的分离提取

植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。

实施例3：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法

3.1斜面种子培养

将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCC NO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。

3.2一级种子培养

将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养2天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。

3.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮

将步骤3.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量10％，转化温度30℃，转速400rpm，通气比0.3vvm，转化时间108小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆50g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油75g/l，植物甾醇10g/l，pH 7.0。

3.4产物的分离提取

植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。

实施例4：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23，24-二降胆-4- 烯-3-酮的方法

4.1斜面种子培养

将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCC NO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。

4.2一级种子培养

将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，200rpm培养3天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。

4.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮

将步骤4.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量12％，转化温度30℃，转速500rpm，通气比0.4vvm，转化时间156小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆50g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油125g/l，植物甾醇20g/l，pH 7.0。

4.4产物的分离提取

植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。

实施例5：本发明提供的分枝杆菌转化植物甾醇为20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮的方法

5.1斜面种子培养

将分枝杆菌FJH0105-16(Mycobacterium sp.FJH0105-16)，保藏编号为CGMCC NO.13234，30℃培养3天。所述培养基组分如实施例2所示。

5.2一级种子培养

将上述斜面种子培养的菌落接入灭菌后的液体种子培养基中，30℃，220rpm培养3天，得到种子液。所述液体种子培养基的组分如实施例2所示。

5.3发酵罐发酵及转化生成20-羟基-23,24-二降胆-4-烯-3-酮

将步骤5.2得到的种子液体接种到灭菌后的转化培养基中，接种量15％，转化温度30℃，转速600rpm，通气比0.35vvm，转化时间192小时，所述发酵培养基的配方为，玉米浆60g/l，磷酸氢二钾2g/l，七水硫酸镁1g/l，硝酸钠2g/l，豆油200g/l，植物甾醇40g/l，pH 7.0。

5.4产物的分离提取

植物甾醇转化完全后，等体积乙酸乙酯萃取三次后，合并有机相，无水硫酸钠干燥后，减压除去溶剂。HPLC检测，产品质量收率59％，摩尔收率71.1％。使用有机溶剂石油醚、乙酸乙酯等有机溶剂重结晶后，产物纯度>95％。

以上仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一株生物合成20-羟基-23

,24-二降胆-4-烯-3-酮的分枝杆菌及合成方法

<130> Xu L Q, Liu Y J, Yao K, et al. Unraveling and engineering the

production of 23,24-bisnorcholenic steroids in sterol metabolism,

2016, 6: 21928

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1422

<212> DNA

<213> Mycobacterium sp. FJH0105-16

<400> 1

ggcaaggggg cagcttacca tgcagtcgaa cggaaaggcc cttcggggta ctcgagtggc 60

gaacgggtga gtaacacgtg ggtgatctgc cctgcacttt gggataagcc tgggaaactg 120

ggtctaatac cgaatatgat catcggcttc atggtcggtg gtggaaagct tttgcggtgt 180

gggatgggcc cgcggcctat cagcttgttg gtggggtaat ggcctaccaa ggcgacgacg 240

ggtagccggc ctgagagggt gaccggccac actgggactg agatacggcc cagactccta 300

cgggaggcag cagtggggaa tattgcacaa tgggcgcaag cctgatgcag cgacgccgcg 360

tgagggatga cggccttcgg gttgtaaacc tctttcagca cagacgaagc gcaagtgacg 420

gtatgtgcag aagaaggacc ggccaactac gtgccagcag ccgcggtaat acgtagggtc 480

cgagcgttgt ccggaattac tgggcgtaaa gagctcgtag gtggtttgtc gcgttgttcg 540

tgaaaactca cagcttaact gtgggcgtgc gggcgatacg ggcagactag agtactgcag 600

gggagactgg aattcctggt gtagcggtgg aatgcgcaga tatcaggagg aacaccggtg 660

gcgaaggcgg gtctctgggc agtaactgac gctgaggagc gaaagcgtgg ggagcgaaca 720

ggattagata ccctggtagt ccacgccgta aacggtgggt actaggtgtg ggtttccttc 780

cttgggatcc gtgccgtagc taacgcatta agtaccccgc ctggggagta cggccgcaag 840

gctaaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg cggagcatgt ggattaattc 900

gatgcaacgc gaagaacctt acctgggttt gacatgcaca ggacgctggt agagatatca 960

gttcccttgt ggcctgtgtg caggtggtgc atggctgtcg tcagctcgtg tcgtgagatg 1020

ttgggttaag tcccgcaacg agcgcaaccc ttgtcctatg ttgccagcgg gttatgccgg 1080

ggactcgtag gagactgccg gggtcaactc ggaggaaggt ggggatgacg tcaagtcatc 1140

atgcccctta tgtccagggc ttcacacatg ctacaatggc cggtacaaag ggctgcgatg 1200

ccgtgaggtg gagcgaatcc tttcaaagcc ggtctcagtt cggatcgggg tctgcaactc 1260

gaccccgtga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg tgaatacgtt 1320

cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg 1380

gcctaacccc ttgtgggagg agccgtcgaa ggtgatcgcg gt 1422