新型雷公藤甲素衍生物、及其制备和用途的制作方法

本发明涉及一类类似于雷公藤内酯醇的新型雷公藤甲素类衍生物、及其制备方法及在制备抗肿瘤、免疫抑制的药物中的应用。

背景技术：

卫矛科植物雷公藤（Tripterygium wilfordii Hook.F.），主要分布于中国南部，包括浙江、湖南、安徽、云南、福建和台湾等地。近几年的研究发现雷公藤具有抗炎、免疫抑制、抗肿瘤等药理作用，目前已广泛应用于治疗类风湿性关节炎、肾炎、红斑狼疮及各种皮肤病。上市产品为雷公藤多甙片，抗肿瘤治疗疗效不理想。

在雷公藤的各种成分中，二萜类化合物药效最强，雷公藤属植物所含二萜化合物，属松香烷型，多数具有不饱和内酯结构。 二萜类化合物主要包括雷公藤甲素（triptolide）、雷公藤乙素（tripdiolide）、雷公藤内酯三醇（triptriolide）、雷公藤酮（triptonide）等。其中雷公藤甲素（Triptolide）， 是雷公藤的主要活性化合物。在临床上，可以应用于抗肿瘤、免疫抑制，同时还可用于风湿性关节炎、类风湿性关节炎、红斑狼疮等疾病治疗等方面的治疗。

雷公藤甲素有明显的抗肿瘤活性。 雷公藤甲素可以诱导caspase 3依赖的细胞凋亡。研究表明随着雷公藤甲素的作用浓度和时间的增加，caspase 3被剪切激活，细胞进入凋亡程序。雷公藤甲素抑制NF-kB活性和抑制HSP70。NF-kB是重要的转录因子，参与炎症、肿瘤、免疫、细胞增殖和凋亡等广泛的生理病理过程的调控。 人恶性黑色素瘤中HSP70过表达，抑制HSP70将有利于抑制肿瘤细胞增殖。雷公藤甲素可以抑制HCT116（人结肠癌细胞系), 并且不断降低B细胞淋巴瘤和白血病-2相关蛋白Bcl-2的水平，抑制许多白血病相关细胞系。有研究表明，雷公藤甲素对MCF-7、BT-20、MKN-45、MKN-7等乳腺癌细胞株、胃癌细胞株细胞增殖具有抑制作用。胰腺癌是一种特别具有攻击性和毁灭性的疾病，5年存活率不到5%。目前没有能有效延长患者的存活率有效药物 。雷公藤甲素能够抑制Aspc-1等胰腺癌细胞株增殖。雷公藤甲素也是一个有效的肿瘤血管生成抑制剂。国内外实验数据显示，雷公藤甲素对治疗乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、脑胶质瘤、前列腺癌、恶性黑色素瘤均有效。

雷公藤甲素具有免疫抑制作用和抗炎作用。雷公藤甲素可以抑制T细胞早期活化因子CD69、CD25 等的表达。除了抑制T细胞增殖之外还可以诱导T细胞杂交瘤，Jurkat细胞和未活化T细胞的凋亡。另外雷公藤甲素还可以抑制B细胞的增殖。由于雷公藤甲素具有抑制免疫细胞增殖的作用，可以应用于多种免疫系统相关疾病，包括治疗系统性红斑狼疮。雷公藤甲素能够抑制COX-2蛋白酶和IL-2等炎症因子的表达，这也和抑制NF-kB有关，可以应用于抗炎治疗，明显降低小鼠关节炎的发生。

雷公藤甲素具有多种药理活性，但是雷公藤甲素水溶性差，半衰期较短，据研究表明，其半衰期约38分钟左右，毒性大，不利于临床运用，阻碍了进一步的研究和开发。有必要对雷公藤甲素进行化学修饰，增加水溶性，改善理化性质，有利于制成适当的制剂。成盐的雷公藤甲素衍生物将大大改善其水溶性。

技术实现要素：

本发明以降低毒性、增加水溶性、提高生物利用度为目的，设计了一类雷公藤内酯醇的新型雷公藤甲素类衍生物。本发明所述化合物的合成方法工艺科学合理简单、质量可控、适用于生产。

本发明的一个目的是提供一类新型雷公藤甲素衍生物。

本发明的另一个目的是提供一种该类雷公藤甲素衍生物的制备方法。

本发明的再一目的在于提供该类雷公藤甲素衍生物在制备用于治疗肿瘤、免疫抑制药物中的应用。

本发明的又一目的在于提供一种治疗肿瘤、免疫抑制的药物组合物，其包含一种或多种治疗有效量的根据本发明的新型雷公藤甲素衍生物和药学上可接受的辅料。

本发明提供了通式（I）所示的雷公藤甲素衍生物，其光学异构体及其药学上可接受的盐及水合物：

（I）

通式（I）中：

其中：

R₁为-CONRR’；

R、R’一起形成含1-2个N、O、S的5-8元杂环，该杂环有0-3个取代基R’’，R’’为氟、氯、溴、碘、羟基、甲氧基、或者为XY；

XY中，X为0-2个碳组成的脂肪链，Y为含有1-3个杂原子N、O、S的5-8元杂环；

R₂为氢、羟基；

R₃为氢、甲酰基、乙酰基、丙酰基、苯甲酰基、对氯苯甲酰基、间氯苯甲酰基；

C₁₈与R₄之间、C₃和C₁₈之间、C₃和C₄之间、C₄和C₁₉之间的” ”代表单键或双键，如果C₁₈和R₄之间为双键，则R₄为O，且C₁₈和C₃之间以及C₄和C₁₉之间为单键，C₃和C₄之间为双键；如果C₁₈和R₄之间为单键，则R₄为OR₃，且C₁₈和C₃之间以及C₄和C₁₉为双键，C₃和C₄之间为单键。

根据本发明雷公藤甲素衍生物，其为：具有以下通式（II）所示结构的化合物，或光学异构体或药学上可接受的盐水合物：

(II)

其中，R₁的定义与通式（I）中相同；

或者为具有以下通式（III）所示结构的化合物，或光学异构体及其药学上可接受的盐及水合物：

（III）

其中，R₁、R₃、R₄的定义分别与通式（I）中相应的R₁、R₃、R₄的定义相同。

根据本发明，其中：R和R’形成有取代基的哌啶、哌嗪、吡咯、四氢吡咯，取代位置为哌啶、哌嗪、吡咯、四氢吡咯的3或者4位，取代基为哌啶、哌嗪、吡咯、四氢吡咯。

雷公藤甲素衍生物与酸形成的盐，所述的酸为盐酸、硫酸、磷酸 、柠檬酸、氢溴酸、酒石酸、琥珀酸、乳酸、盐酸、对甲苯磺酸、三氟甲酸、三氟乙酸、乙酸、枸橼酸马来酸。

根据本发明雷公藤甲素类内酯衍生物选自以下化合物组合：

TTBT-1

TTBT-1A

TTBT-1B

TTBT-1C

TTBT-2

TTBT-2A

TTBT-2B

TTBT-2C。

本发明的雷公藤甲素衍生物的合成方法如下：

通式（II）、（III）所示的化合物合成方法：

含14位羟基的雷公藤甲素衍生物（MI）溶于吡啶中，然后加入摩尔数1-20倍的酰化试剂，在氮气保护下4-100℃下搅拌10-40小时后，加入摩尔数1-50倍氨基试剂，反应温度为10-110℃，反应3-24小时。 反应液浓缩，加入甲醇， 过滤，制备分离得到通式为（MII）所示结构的化合物。通式（II）所示结构的化合物在低温条件下，在NaH/THF中，反应1-5小时，加入酸酐，得到通式为（MIII）所示结构的化合物，R₁, R₂, R₃, R₄分别和通式(I)中相应的R₁, R₂, R₃, R₄定义相同，

反应方程式（1）

化合物TTBT-1及TTBT-2的合成过程：

如反应方程式（2）所示，以雷公藤甲素为起始物，然后加入摩尔数1-20倍的苯甲酰氯，在氮气保护下， 4-100℃搅拌10-40小时后，加入摩尔数1-50倍4-哌啶基哌啶，反应温度为10-110℃，反应3-24小时，反应液浓缩，加入甲醇， 过滤，制备分离得到产物（TTBT-1），TTBT-1在低温条件下，在NaH/THF中，反应1-5小时，加入1-10倍苯甲酸酐，在-C₁₈O 、C₁₉位接上苯甲酰基， 制备分离纯化得到化合物（TTBT-2），

反应方程式（2）。

本发明在C₁₄位引入了含氮取代基，可以和酸形成盐，大大提高了水溶性。并且western blot显示这类化合物可以抑制NF-kB，具有抗炎和抑制肿瘤细胞增殖作用。肝微粒体实验表明此类化合物代谢稳定性较好，有利于应用于制备长效缓释的药物。

附图说明

图1为TTBT-1在人肝微粒体中随时间的变化。

图2为TTBT-1和TTBT-2对MDA-MB-231细胞中NF-kB蛋白的抑制作用。

具体实施方式

通过以下具体实施方法将有助于理解本发明，但并不限于本发明的内容。

实施例1

化合物4-哌啶基哌啶甲酸雷公藤甲素酯 （TTBT-1）的结构

TTBT-1

化合物TTBT-1 （4-哌啶基哌啶甲酸雷公藤甲素酯）的合成

雷公藤甲素 (50 mg) 室温下溶于吡啶 (5 mL) 中，加入苯甲酰氯（40 mg），氮气保护下室温搅拌24小时。室温下向反应液中加入4-哌啶基哌啶(400mg)，升温到80℃，反应3小时。 反应液浓缩，甲醇溶解 ，制备液相分离得到产物淡黄色固体(19.8 mg，收率26%) 。

纯化（采用高效液相制备色谱）

色谱条件：色谱柱为Waters Sunfire 20*250mm, 10µm；以水（0.1%TFA）-ACN为流动相，梯度条件控制0-10min，乙腈30%-40%；检测波长为214nm/254nm；Mass为555[M+1]。

制备方法： 取反应浓缩液，用甲醇溶解并配成每1ml中约含10mg的溶液，作为供试品溶液。精密量取5ml注入制备液相色谱仪，在C18反相制备色谱上实现产物与杂质的分离，通过设置Trigger Mass 555[M+1]，得到化合物TTBT-1。

化合物TTBT-1（分子式：C₃₁H₄₂N₂O₇ ），ESI-MS m/z: 555 [M+H]⁺. 1H-NMR (400 MHz, CDCl3) δ 1.539-1.471 (2H, m, H-1), 1.362 (2H, m, H-6), 1.231 (3H, m, H-20), 1.185 (3H, m, H-16), 1.125 (3H, m, H-17), 1.790 (2H, m), 1.889 (2H,m), 1.889 (2H, m), 2.042 (2H, m), 2.042 (2H, m), 2.042-2.128 (2H, m, H-2), 2.128 (1H, M, H-15), 2.230-2.277 (1H, d, J=18.8 Hz, H-5), 2.649 (1H, s), 2.716 (2H, m), 2.894 (2H, m), 3.408 (2H, m), 3.450 (2H, m), 3.762 (1H, s, H-7), 4.276 (1H, d, J= 9.2Hz, H-12), 4.440 (1H, d, J= 12 Hz, H-11), 4.606 (2H, m, H-19), 4.810 (1H, s, H-14)。

TTBT-1在人肝微粒体中的稳定性

以下实施例中，受试化合物由本发明化学合成实施例提供。

目的

考察TTBT-1在人肝微粒体中的代谢稳定性。

实验材料

人肝微粒体购于XENOTECH公司，批号1410013，于-80oC保存。

还原性辅酶II购于上海驷佳生物技术有限公司，货号Roche 10621706001，有效期2017年7月, 于4°C保存。

实验方法

在反应体系中TTBT-1浓度为2 μM，分别在反应后0、5、15、30、45和60分钟取样；以咪达唑仑为阳性对照，浓度为2 μM，分别在反应后0、5、10、15和30分钟取样；以水代替还原性辅酶II作为阴性对照，取样时间与受试物相同。每个时间点平行准备2份。用LC-MS/MS法测定样品中TTBT-1或咪达唑仑，计算各时间点化合物TTBT-1平均峰面积与内标平均峰面积的比值，并计算该比值相对于0时间点的百分率，并以此百分率的变化表示TTBT-1代谢稳定性。

结果

见图1，化合物TTBT-1在人的肝微粒中半衰期大于1小时，化合物TTBT-1在人的肝微粒中很稳定。

实施例2

化合物 TTBT-2的结构

TTBT-2

化合物TTBT-2的合成

化合物TTBT-1（0.1 mmol）在低温THF中，滴入到NaH（0.12 mmol）的低温（-78℃）THF溶液中。1小时后，滴入乙酸酐（0.25 mmol），20度以内反应1小时，加入乙醇和水，MgSO4干燥，浓缩，制备分离得到TTBT-2（3 mg）。

纯化（采用高效液相制备色谱）

色谱条件：色谱柱为Waters Sunfire20*250mm, 10µm；以水（0.1%TFA）-ACN为流动相，梯度条件控制0-10min，乙腈20%-50%；检测波长为214nm/254nm；Trigger Mass为763 [M+1]。

纯化方法：取反应浓缩液，用乙腈溶解并配成每1ml中约含4mg产物的溶液。注入制备液相色谱仪，在C18反相制备色谱上实现产物与杂质的分离，通过设置Trigger Mass 763[M+1]，得到化合物TTBT-2。

化合物TTBT-2（分子式：C₄₅H₅₀N₂O₉），ESI-MS m/z: 763 [M+H]⁺. ¹H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ1.559-1.592 (2H, m, H-1), 1.415 (2H, m, H-6), 1.283 (3H, m, H-20), 1.215 (3H, m, H-16), 1.151 (3H, m, H-17), 1.838 (2H, m), 1.930 (2H, m), 1.925 (2H, m), 2.113 (2H, m), 2.062 (2H, m), 2.051-2.156 (2H, m, H-2), 2.123 (1H, m, H-15), 2.241-2.285 (1H, m, H-5), 2.683 (1H, s), 2.752 (2H, m), 2.934 (2H, m), 3.441 (2H, m), 3.472 (2H, m), 3.792 (1H, s, H-7), 4.285-4.295 (1H, m, H-12), 4.491-4.463 (1H, m, H-11), 4.831 (1H, s, H-14)，7.581-7.7.672 (6H, m), 7.984 (4H, m)。

实施例3

化合物TTBT-1和TTBT-2抑制肿瘤细胞的NF-kB蛋白表达

NF-kB蛋白在细胞增殖抗凋亡中起重要作用，抑制在肿瘤细胞中的NF-kB有利于抑制肿瘤细胞生长。雷公藤甲素以及类似物可以抑制NF-kB，促进肿瘤细胞凋亡。人乳腺癌细胞MDA-MB-231细胞培养于37℃， 5%二氧化碳，含10%胎牛血清的DMEM培养基，调整细胞浓度至2x10⁵个/10cm。24小时后，待细胞贴壁生长良好，以0，100，200，600 nM浓度的TTBT-1和TTBT-2的DMSO溶液处理72小时。分别收集不同化合物不同浓度处理的细胞，RIPA裂解液于冰上裂解细胞30分钟。检测各个样品的蛋白质总浓度，取总蛋白质为50 µg的样品上样Mini-PROTEAN 凝胶电泳，150 V，30分钟。在恒流200mA下，转膜80分钟至PVDF膜。以5%脱脂奶粉的TBST（50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0.5% Tween-20)封闭液室温封闭PVDF膜1小时。一抗beta actin和NF-kB用封闭液稀释1000倍，4℃过夜孵育PVDF膜。用TBST漂洗PVDF膜3次30分钟。在室温下，用二抗孵育PVDF膜1.5小时，然后TBST漂洗PVDF膜3次30分钟，用PIERCE ECL溶液处理PVDF膜，在tanon 4200上曝光，结果如图2。

结果显示化合物TTBT-1和TTBT-2明显抑制肿瘤细胞中NF-kB蛋白的表达。这类化合物可用于抗炎、免疫抑制、抗肿瘤药物中的制备。

根据上述研究结果，本发明的化合物水溶性高，其肝微粒体代谢显示化合物代谢时间长，代谢稳定性优于雷公藤甲素。且化合物TTBT-1和TTBT-2明显抑制肿瘤细胞中NF-kB蛋白的表达。这类化合物可用于抗炎、免疫抑制、抗肿瘤药物中的制备。