一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法与流程

本发明涉及微生物的基因工程技术领域，尤其涉及一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法。

背景技术：

由病原真菌引起的病害，约占植物病害的70～80％，是提高我国农业产量、质量和效益的主要障碍之一。生产上防治真菌病害一般采用化学防治，然而，化学农药残留带来的食品质量安全问题和生态安全问题已成为社会各界关注的焦点。因而，开发生态安全、环境友好型的生物农药是解决上述问题的有效途径之一。

近年来，溶杆菌作为一类潜在的生防细菌受到广泛关注。溶杆菌（Lysobacterspp）是属于黄单胞科、溶杆菌属的一类革兰氏阴性细菌，1978年由Christensen 和 Cook建属。溶杆菌在环境中普遍存在，其主要特征是无鞭毛但有滑行能力，能产生大量胞外酶和小分子次生代谢产物，对许多微生物，如真菌、卵菌、酵母、细菌等都有较好的拮抗活性。

胶状溶杆菌（Lysobacter gummosus）OH17是本实验室从作物根际土壤中分离鉴定的一株溶杆菌属的细菌。OH17已保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.8649。OH17对植物病原真菌和卵菌具有广谱、高效的拮抗活性（专利申请号201410814846.9）。因此，这一菌株及其活性代谢产物的研究对于新型、高效和广谱生物农药（农用抗生素）的开发具有重要意义。

细菌的遗传操作系统即基因敲除和互补技术，是研究基因功能的必要手段，也是代谢产物合成和调控研究等必需的遗传学方法。然而，由于溶杆菌对许多抗生素具有抗性，且敏感的抗生素种类也不相同，导致溶杆菌的遗传操作系统不易构建。

技术实现要素：

针对上述存在的问题，在前期明确了OH17抗生素敏感性的基础上，本发明目的在于提供一种OH17的遗传操作系统，以期为该菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。

为了达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法，所述的遗传操作系统的构建方法包括如下步骤：

A）确定目的基因：根据基因组的序列分析，在胶状溶杆菌OH17的基因组中定位指定基因的同源序列，确定为目的基因；

B）构建基因敲除重组载体：采用PCR扩增目的基因的上游和下游片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到自杀性质粒上，得到基因敲除重组载体；

C）构建基因敲除突变株：基因敲除重组载体通过电击转化的方式进入到OH17感受态细胞中，进行同源双交换，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得基因敲除突变株；

D）构建回补菌株的重组载体：采用PCR扩增目的基因及其自身启动子的片段，酶切这些片段，纯化回收后连接到质粒上，得到回补菌株的重组载体；

E）构建回补菌株：回补菌株的重组载体通过电击转化的方式进入到步骤C）得到的基因敲除突变株感受态细胞中，采用LA培养基进行筛选，经PCR验证后获得回补菌株。

本发明所述的步骤B）的操作过程中，所用的自杀性质粒为pJQ200SK，所述的自杀性质粒上携带庆大霉素的抗性基因Gm。

本发明所述的步骤B）的操作过程中，得到的基因敲除重组载体需要经过验证，验证方法如下：将自杀性质粒通过热激转化到检测菌株上，采用LA培养基进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的基因敲除重组载体。

本发明所述的步骤D）的操作过程中，所用的质粒为pSEVA321CM。

本发明所述的步骤D）的操作过程中，得到的回补菌株的重组载体需要经过验证，验证方法如下：将质粒通过热激转化到检测菌株上，采用LA培养基进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的回补菌株的重组载体。

本发明所述步骤B）和步骤D）中采用检测菌株为大肠杆菌DH5α。

本发明的优点在于：本发明构建了OH17的遗传操作系统，实现了OH17的基因敲除以及互补，为该菌株的分子操作和基因功能研究提供基本保障。

附图说明

图1重组载体pJQ-pilR的PCR验证；

图2重组载体pJQ-pilR的双酶切验证；

图3一次交换子庆大抗性片段的PCR验证；

图4 pilR敲除突变体的PCR验证；

图5 重组载体pJQ-Lg2296的双酶切验证（1, 2, 3）；

图6 Lg2296突变体的PCR验证；

图7 重组载体pSEVA321-pilR的PCR验证；

图8 重组载体pSEVA321-pilR的双酶切验证；

图9 pilR突变体及回补菌株的菌落形态；

图10 pilR突变体及回补菌株的HSAF产量；

图11 重组载体pLAFR6TET-pilR的PCR验证；

图12 重组载体pBBR-pilR及pURF047-pilR回补菌株的HSAF产量

图13 OH17对不同抗生素的敏感性。

具体实施方式

下面结合附图说明和具体实施方式对本发明作进一步详细的描述。

本发明的实施例中应用的培养基为以下几种培养基：

1）10% TSB培养基：胰蛋白胨大豆肉汤培养基（Tryptic-Soytone-Broth-Medium）3 g，

蒸馏水1 L。

2）LB固体培养基：Tryptone 10 g，NaCl 10 g，Yeast Extract 5 g。

将以上组份加入水溶解，最后定容至1 L，调节pH =7.0-7.2，分装后，LA固体培养基另加琼脂粉15 g/L。

实施例1：本发明所述的一种胶状溶杆菌OH17遗传操作系统的构建方法如下：

一）基因敲除重组载体的构建；

1）在目的基因上下游各设计一对引物，以OH17基因组DNA为模板，进行PCR扩增。

2）将回收的上下游片段分别利用内切酶进行酶切，连接到用BamHI/XbaI酶切的质粒pJQ200SK上，热激转化到大肠杆菌DH5α中。

3）利用LA培养基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体。

二）基因敲除突变株的构建；

1）将重组载体电击转入OH17感受态细胞，电压为1.8 kv。

2）将细胞涂布于含25 μg/mL庆大霉素的LA培养基。

3）挑取单菌落进行PCR筛选一次交换子。

4）挑取单菌落在无抗生素LB培养基中培养6-8 h，进行二次交换。

5）取上述培养液100 μL涂布于含10%蔗糖的LB平板上，10%的蔗糖使未发生二次交换的一次交换子致死，长出的单菌落即为二次交换子。

6）通过PCR筛选验证基因敲除突变株。

三）回补菌株重组载体的构建；

1）根据已知目的基因序列设计引物，以OH17基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增产物包括目的基因及其自身启动子。

2）扩增片段酶切后与相应酶切位点的质粒pSEVA321Cm连接。

3）连接产物热击转化入大肠杆菌DH5α。

4）LA培养基（Cm 34 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体。

四）回补菌株的构建；

1）将回补菌株重组载体，通过电击转化的方式导入相应基因敲除突变株感受态细胞中。

2）长出后的菌落，通过表型是否恢复进行筛选，最终得到回补成功菌株。

实施例2：本实施例说明胶状溶杆菌OH17中pilR基因的敲除。

一）OH17中pilR基因序列的获得及引物的设计；

以产酶溶杆菌OH11的pilR基因为参考序列，利用BioEdit软件通过同源比对，在OH17的基因组中定位同源序列。比对到相应序列后，利用NCBI和SMART网站进行序列分析。利用Primer Premier软件对引物进行设计，引物序列如下：

pilR-F1: CGGGATCCGTCCGTTCTTCACCACCTCCAG

pilR-R1: GGAATTCGTCGGTCAGGCACAAGTCGTAA

pilR-F2: GGAATTCGAAAACCGCTACAACAAGAC

pilR-R2:GCTCTAGAGAGTGGTGATTGAGTTGCTT

二）基因敲除重组载体的构建；

1）PCR扩增pilR基因上下游片段，将回收上下游片段分别用BamHI/EcoRI，EcoRI/XbaI进行酶切，酶切片段纯化回收后连接到用BamHI/XbaI酶切的质粒pJQ200SK上，连接产物热激转化至大肠杆菌DH5α。

2）利用LA培养基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体（图1，图2）。

三）胶状溶杆菌OH17电转感受态的制备；

1）LA培养基上挑取单菌落，在10% TSB液体培养基中培养，28℃，200 rpm，过夜培养。

2）接种量按1:100进行转接到10% TSB中，28℃培养6-10 h（OD_{600 nm}≈1.0）。

3）将菌液倒入50 mL离心管中，冰浴30 min。

4）4℃，6000 rpm，离心15 min。

5）弃去上清，预冷的10%甘油悬浮菌体，冰上静置20 min。

6）4℃，6000 rpm，离心15 min。

7）弃上清，用预冷的10%甘油悬浮菌体（重复2次）。

8）最后将离心的菌体沉淀用2 mL 10%的甘油重悬，100 μL每管分装，置于-70℃冰箱中保存备用。

四）重组载体电转化到胶状溶杆菌OH17感受态细胞；

1）将重组载体pJQ-pilR（200 ng~2 µg）加入100 µL OH17感受态细胞轻轻混匀，转至1 mm电转化杯（Bio-Rad）中，电击参数设为：电压1.8 kv（电转化仪为Bio-Rad）。

2）经电转化后，立即在无菌条件下向电转化杯中加入800 µL的10% TSB培养液，然后将菌液转移至2 mL离心管中，放入28℃摇床中180 rpm，3 h。

3）离心浓缩后均匀涂布在LA培养基（Gm 25 µg/mL）上，待平板干燥后，在28℃温箱中培养2~3 d。

4）利用PCR扩增庆大抗性片段，筛选获得一次交换子（图3）。

5）挑取单菌落在无抗生素LB培养基中培养6-8 h后，涂布于含10%蔗糖的LB平板上。

6）10%的蔗糖使未发生二次交换的一次交换子致死，长出的单菌落即为二次交换子，通过PCR筛选验证基因敲除突变株，验证引物为pilR-F1/pilR-R2（图4）。

实施例3 ：本实施例说明胶状溶杆菌OH17中Lg2296基因的敲除。

一）引物设计；

根据基因组序列分析及比对，OH17中编号为Lg2296的基因与产酶溶杆菌OH11中抗真菌物质HSAF的合成基因PKS/NRPS同源，因此选择该基因进行敲除，设计目的基因上下游片段引物如下：

Lg2296-F1: CGGGATCCAGGTGTCGCTGGCATTGATC

Lg2296-R1: CCCAAGCTTGAGGCTTTGCTGCTGGAATC

Lg2296-F2: CCCAAGCTTAGGGTGTGGGCGACGAACTG

Lg2296-R2: GCTCTAGATCCGACAGCCAGCCGTTGAG

二）重组载体的构建；

1）PCR扩增Lg2296基因上下游片段，将回收上下游片段分别用BamHI/HindIII，HindIII/XbaI进行酶切，酶切片段纯化回收后连接到用BamHI/XbaI酶切的质粒pJQ200SK上，连接产物热激转化至大肠杆菌DH5α。

2）利用LA培养基（Gm 25 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）进行筛选，并进行双酶切验证，得到正确的重组载体（图5）。

三）重组载体电转化到胶状溶杆菌OH17感受态细胞；

1）将重组载体pJQ-Lg2296（200 ng~2 µg）加入100 µL OH17感受态细胞轻轻混匀，转至1 mm电转化杯（Bio-Rad）中，电击参数设为：电压1.8 kv（电转化仪为Bio-Rad）。

2）经电转化后，立即在无菌条件下向电转化杯中加入800 µL的10% TSB培养液，然后将菌液转移至2 mL离心管中，放入28℃摇床中180 rpm，3 h。

3）离心浓缩后均匀涂布在LA培养基（Gm 25 µg/mL）上，待平板干燥后，在28℃温箱中培养2~3 d。

4）筛选获得一次交换子，进行PCR验证一次交换子。

5）挑取单菌落在无抗生素LB培养基中培养6-8 h后，涂布于含10%蔗糖的LB平板上。

6）通过PCR筛选验证基因敲除突变株，验证引物为Lg2296-F1/Lg2296-R2（图6）。

实施例4 ：本实施例说明胶状溶杆菌OH17中pilR基因敲除突变株的回补菌株构建。

一）pilR基因敲除突变株的回补菌株构建；

1）根据pilR基因序列设计一对引物如下，以OH17基因组DNA为模板，进行PCR反应，扩增产物包括基因及其自身启动子。

pilR-F: CGGGATCCCTGTTTCCGCATCCGCCTTG

pilR-R: CCCAAGCTTTAAATAAGTCGCCGGGTTCG

2）片段用BamHI/HindIII进行酶切后，尝试多种自主复制性载体构建互补菌株连接，热激转化导入到大肠杆菌DH5α中，最终选择质粒pSEVA321。

3）LA培养基（Cm 34 μg/mL，X-gal 100 μg/mL）进行筛选，并进行PCR和双酶切验证，得到正确的重组载体（图7，图8）。

4）将重组载体电转导入pilR敲除突变体感受态细胞中，长出后的菌落通过菌落形态及HSAF产量恢复情况进行筛选获得回补菌株。

二）菌落形态的检测；

挑取LA培养基上的野生型及其衍生菌株单菌落于10% TSB培养基中培养，摇至OD_{600 nm}≈1.0，取2 μL菌液点于LA培养基上，28℃培养24-48h，与野生型进行比较，恢复为野生型菌落形态的菌株则为回补成功（图9）。

三）HSAF的提取与HPLC检测；

1）挑取LA培养基上的单菌落于10% TSB液体培养基中，28℃，200 rpm过夜培养；

2）以1%的接种量转接至5 mL的10% TSB培养基中，28℃，200 rpm培养12 h（OD_{600 nm}≈1.0）；

3）以1%的接种量转接至25 mL的10% TSB培养基中，28℃，200 rpm发酵24 h；

4）取4 mL上述发酵液于大试管中，在发酵液中加入12 μL浓盐酸和4 mL的乙酸乙酯抽提1 h；

5）取2 mL上清于新的2 mL的离心管中，通风橱中制成干样；

6）在上述2 mL的离心管，加入200 μL甲醇溶解残留物，用有机过滤器过滤，待下一步实验使用；

7）HSAF的HPLC检测。

HPLC检测采用Agilent SB-C18柱（4.6×250 mm），HPLC为Agilent。具体条件如下：流速：1 mL/min；检测波长：318 nm；柱温：20-30℃，进样量20 μL。采用梯度洗脱的方法进行高效液相色谱检测，流动相比例如表1。与野生型及突变体菌株相比，HSAF产量有部分恢复的菌株为pilR基因回补成功的菌株（图10）。

表1 HSAF检测条件

实施例5：（回补部分重组载体检测对比试验）

将重组载体pBBR-pilR、pUFR047-pilR、pLAFR6TET-pilR、pSEVA321- pilR分别电转化进入pilR突变体中，分别在LA平板（Gm 25 μg/mL，Gm 25 μg/mL，Tet 50 μg/mL，Cm 34 μg/mL）筛选转化子，利用表型测定筛选互补菌株，只有重组载体pSEVA321- pilR电转化进入pilR突变体获得的转化子能使表型得到回补。而重组载体pLAFR6TET-pilR无法进入pilR突变体中（图11），空载体pBBR和pUFR047电转化入pilR突变体后影响其表型回补，故无法使用（图12）。

实施例6：（抗生素浓度测试试验）

遗传操作体系的建立需要适当的筛选标记，检测了胶状溶杆菌OH17的抗生素耐受水平，使用实验室7种常用的抗生素：Str、Km、Tet、Amp、Cm、Gm和Rif，分别配成2-3个浓度梯度的抗性平板，即5 μg/mL、20 μg/mL、50 μg/mL。将OH17菌液摇至OD_{600 nm}≈1.0，取100 μL菌液涂布于各个抗性平板，另设一个空白对照。28℃培养，12-24 h后观察结果。结果发现，OH17对Amp、Gm、Cm和Rif较敏感，对Tet有较小的耐药性，对Str和Km不敏感（图13）。