产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法与流程

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、食品工程及畜牧养殖等领域，具体涉及一种产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法。本发明生产的α-淀粉酶主要应用于食品加工、饲料添加剂及纺织等行业。

背景技术：

α-淀粉酶又称液化酶(1,4-α-D一葡萄糖苷水解酶，EC3.2.1.1)以淀粉为底物，水解淀粉内部1,4-α-D-葡萄糖苷键，致使糖苷键随机断裂，生成短链糊精和小分子糖类，从而使粘度迅速下降，达到淀粉液化的作用。α-淀粉酶广泛应用于传统酿造、食品加工、纺织退浆等行业，是最重要的的工业应用酶制剂之一。

目前现有的α-淀粉酶在较低温度下催化能力较差，催化效率较低。

技术实现要素：

针对现有技术的不足，本发明的目的在于，提出一种产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法，该菌株产生的α-淀粉酶催化能力强，能在较低温度快速催化。

产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法分为3项发明创造，每一项发明创造都具有相同的特定技术特征：产适冷α-淀粉酶，解决了在低温下催化能力受限的问题，属于一个总的发明构思，可以作为一件申请提出。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：

(1)取海泥，构建宏基因组文库；

(2)进行α-淀粉酶基因的筛选，得到含有α-淀粉酶基因的阳性克隆；

(3)α-淀粉酶基因的克隆：

a.基于筛选得到的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物A2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，以含有α-淀粉酶基因的阳性克隆提取的质粒为模板，进行PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化， 插入载体并转化到感受态细胞中，筛选阳性克隆；提取阳性克隆的质粒，测序，确定重组质粒的插入片段序列，确定PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；

b.测序正确后，将步骤a的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；

c.pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；

(3)对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。

通过构建宏基因组文库，通过α-淀粉酶筛选得到新的酶。所述的筛选的基因插入α-淀粉酶基因的表达载体。

产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法，包括如下步骤：

(a)取海泥1g,利用试剂盒MO BIO的强力土壤DNA提取试剂盒( DNA Isolation Kit)提取宏基因组。通过物理和化学协同破碎细胞的方法，将释放出来。通过过柱纯化以获得高质量。宏基因组文库构建过程中使用EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid Library Production Kits提供的质粒pCC2FOS^TM Vector及宿主菌Escherichia coli EPI300，构建宏基因组文库。

(b)取10uL文库菌液用液体培养基稀释到100uL，均匀涂布于α-淀粉酶筛选平板，37°培养3天，然后转入4°保存，观察菌落周围出现明显透明圈的即为α-淀粉酶阳性克隆。将筛选出来的阳性克隆挑出，液体培养，划线于α-淀粉酶筛选平板上重复验证。

(c)基于找出的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列，设计扩增引物A1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和下游引物A2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，PCR扩增；凝胶回收PCR产物，纯化，连接到载体上；(b)热激法转化到感受态细胞中，卡那霉素抗性筛选阳性克隆。采用质粒抽提试剂盒提取阳性克隆的质粒，送至上海公司测序，确定重组质粒的插入片段序列，PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；

(d)测序正确后，将步骤(c)的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；

(e)pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；

(f)对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。

所述液体种子培养基的组成为：淀粉，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水1000mL。

上述步骤(c)中，PCR反应体系为50μl，包括1μl DNA模板、5μl 10×PCR buffer、3μl 25mM MgCl₂、4μl dNTP mixture、1μl 20μM引物A1、1μl 20μM引物A2、0.25μl、5U/μl Taq酶和34.75μl灭菌ddH₂O；PCR反应条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s，共28个循环；72℃5min。

产适冷α-淀粉酶菌株生产α-淀粉酶的方法，其特征是，所述方法包括以下步骤：

(1)产酶培养

目标基因α-淀粉酶的转化株生长在含有表达质粒对应抗生素的发酵产酶培养基中，37℃恒温培养，直到吸光值OD600达到0.6—0.8，然后用IPTG进行诱导表达，环境温度仍然控制在37℃；经过一定时间后,诱导细胞离心，上清液用于蛋白分离；

(2)硫酸铵沉淀

分别取50mL上述粗酶液，按终浓度分别为40％，50％，60％，70％W/V要求，分别加入不同质量的硫酸铵，冰浴中持续搅拌充分沉淀后，低温离心，弃去上清，沉淀物用10mmol/L,pH 5.5的醋酸缓冲液复溶，上清为所得粗酶液，测得上清液酶活；将粗酶液用20mmol/L,pH5.5的醋酸缓冲透析，除去残留的硫酸铵；

(3)Sephadex G-100凝胶过滤层析

将上一步透析样品上样到含有10mmol/L,pH 5.5的醋酸缓冲液的sephadex G-100凝胶柱中，进行sephadex G-100凝胶过滤层析分离，用含0.2mo1/L NaCI的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为1mL/min；将收集的样品进行活性测定，收集活性部分，透析脱盐后，冻干浓缩，即为纯化后的α-淀粉酶。

上述步骤(1)中，所述发酵产酶培养基的组成为：可溶性淀粉，20g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH 6.0～6.5；IPTG添加终浓度1mM。

相对于现有技术，本发明的有益效果是：

(1)本发明所构建的的适冷α-淀粉酶菌株酶高产菌株，与当前工业用酶的细菌菌株相比，发酵产酶周期短，酶活力高，产酶温度低，因此该菌适用于大规模的发酵生产的特点；

(2)从本发明提取的α-淀粉酶的活力比活达101U/mL,与现有菌株相比，具有更高的催化能力；该酶最适反应pH为6.0；该酶在的缓冲液中保存2h酶活力可保持最高酶活的90％以上，体现了较好的pH稳定性；最适反应温度为15-20℃；有耐Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺、Fe³⁺等金属离子的良好特性，EDTA对酶活性影响甚微，该酶为非金属离子纤维素酶，显示了良好的特性，在纺织、食品加工和饲料等工业领域具有良好的应用前景。

附图说明

图1为构建产α-淀粉酶菌株产α-淀粉酶SDS-PAGE图；

图2为本发明纯化的α-淀粉酶聚丙烯酰胺凝胶电泳图(M为标准蛋白分子量，1-6为酶蛋白分子量为85Kdα-淀粉酶)；

图3为pH对α-淀粉酶活的影响示意图；

图4为温度对α-淀粉酶活的影响示意图；

序列表为序列1为α-淀粉酶序列，序列2和3分别为引物A1和A2，序列4和5分别为引物F1和R1。

产适冷α-淀粉酶菌株已在中国典型培养物保藏中心申请保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2016786，保藏日期为2016.12.26，分类命名为Escherichia coli BL21a/pET-20b(+)-α-amyZ1，保藏地址为中国武汉武汉大学。

具体实施方式

为进一步揭示本发明的技术方案，下面结合附图详细说明本发明的实施方式：

本发明中所用培养基为：

液体种子培养基：淀粉，10g；KH₂PO₄，4.0g；MgSO₄，0.03g；蒸馏水1000mL。

发酵产酶培养基的组成为：可溶性淀粉，20g；MgSO₄·7H₂O，0.5g；NaCl，0.5g；FeSO₄·7H₂O，0.01g；琼脂，20g；蒸馏水，1000mL，pH 6.0～6.5。IPTG至终浓度1mM。温度15℃。

实施例1

(a)取海泥1g,利用试剂盒MO BIO的强力土壤DNA提取试剂盒( DNA Isolation Kit)提取宏基因组。通过物理和化学协同破碎细胞的方法，将环境环境微生物DNA释放出来，通过过柱纯化以获得高纯度微生物DNA。宏基因组文库构建过程中使用EPICENTRE公司的CopyControl Fosmid Library Production Kits提供的质粒pCC2FOS^TMVector及宿主菌Escherichia coli EPI300，构建宏基因组文库。该部分为常规技术，故不作更详细说明。

(b)取10uL文库菌液用液体培养基稀释到100uL，均匀涂布于α-淀粉酶筛选平板，37°培养3天，然后转入4°保存，观察菌落周围出现明显透明圈的即为α-淀粉酶阳性克隆。将筛选出来的阳性克隆挑出，液体培养，划线于α-淀粉酶筛选平板上重复验证。该部分为常规技术，故不作更详细说明。

(c)以步骤(b)重复验证的阳性克隆(经过测序，验证序列)提取的质粒为模板，进行PCR，PCR反应体系为50μl，包括1μl DNA模板、5μl 10×PCR buffer、3μl MgCl₂(25mM)、4μl dNTP mixture(各2.5mM)、1μl A1(20μM)、1μl A2(20μM)、0.25μl Takara Taq酶(5U/μl)和34.75μl灭菌ddH₂O。引物为上游引物A1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和下游引物A2 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)。PCR反应条件顺序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃30s(共28个循环)；72℃5min。50μl PCR产物加6×上样缓冲液8.3μl，1％琼脂糖电泳。采用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒进行。将洗脱下的DNA-20℃保存，送去测序。

(d)α-淀粉酶基因由金斯瑞生物技术公司(中国，南京)测序。之后，α-淀粉酶基因(即PCR产物)插入载体pET-20b(Novagen)中，并转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，接种大肠杆菌BL21(DE3)于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，37℃摇床培养。提取阳性克隆的质粒，测序，确定重组质粒的插入片段序列，确定PCR纯化产物为α-淀粉酶基因；

(e)测序正确后，将步骤c的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板，使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'，扩增产物为α-淀粉酶基因，测序；

(f)pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和HindIII进行双酶切并连接，扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21，再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中，筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21；

(g)对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取，测序验证。

重组质粒的构建按照试剂盒说明书进行操作。质粒提取试剂盒和PCR产物纯化试剂盒(BIOMIGA，上海)用于质粒和PCR产物的纯化。DNA限制和修饰酶购自Takara公司(中国，大连)。DNA转化通过GenePulser(Bio-Rad,USA)来实现。把克隆基因α-淀粉酶基因连接到pET-28(+)的表达载体上。然后，使用以下两种引物对原始克隆进行扩充：F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3'。采用BamHI和HindIII实现双酶切，扩增子是插入到pET-28(+)向量转换为大肠杆菌Origami(DE3)，然后淀粉酶基因的序列得到验证。

实施例2

从构建菌种中提取适冷α-淀粉酶的方法：

1.产酶培养

目标基因的转化株生长在含有表达质粒对应抗生素的发酵培养基中，37℃恒温培养，直到吸光值OD600达到0.6—0.8，然后用1mM浓度的IPTG进行诱导表达，环境温度仍然控制在37℃。经过6h后,诱导细胞用5000*g的离心机，进行5min的离心分离。经过离心后，上清液用于蛋白分离。

2.硫酸铵沉淀 分别取50mL上述粗酶液，按终浓度分别为40％，50％，60％，70％(W/V)要求，分别加入不同质量的硫酸铵，冰浴中持续搅拌30min，充分沉淀后，8 000r/min低温离心20min，弃去上清，沉淀物用适量的10mmol/L,pH 5.5的醋酸缓冲液复溶，上清为所得粗酶液。测得上清液酶活。在4℃层析柜中，将粗酶液用20mmol/L,pH5.5的醋酸缓冲透析12h，除去残留的硫酸铵，中间更换两次透析缓冲。

3.Sephadex G-100凝胶过滤层析

将上一步将透析样品上样到10mmol/L,pH 5.5的醋酸缓冲液平衡好的sephadex G-100凝胶柱中，进行sephadex G-100凝胶过滤层析分离(1.6cm X60cm)，用含0.2mo1/L NaCI的醋酸缓冲液A进行洗脱，流速为1mL/min，1min收集1管。将收集的样品进行活性测定，收集活性部分，透析脱盐后，冻干浓缩。即为纯化后的α-淀粉酶。

酶活测定方法：

取10mL 1％的马铃薯淀粉溶液(pH 4.0)放入一支试管内，于40℃预热10min后，加入1mL的发酵酶液，摇匀，精确保温10min。用移液管吸取1mL反应液置于盛有10mL,0.1mol/L HCl的试管中，再取0.5mL混合液体于盛有10mL碘液的试管中，摇匀，并立即用分光光度计于660nm处测定吸光度。用同样方法测定空白值，但不加发酵液，加1.0mL的蒸馏水。以蒸馏水作为参比液。

酶活定义：1个酸性α-淀粉酶单位相当于在pH 4.0，温度40℃，1min将浓度为1％的马铃薯淀粉溶液的显蓝强度降低1％时所需酶量。

酶活＝[(D0一D)×100/D0×10]×稀释倍数

D0为空白吸光度，D为样品吸光度，100为系数(％)，10为反应时间(min)。

取粗酶液测定酶的活力，经测定α-淀粉酶分别22.6U/mL。

分别对粗酶液、样品前处理液和经Sephadex G-100柱层析后的样品进行总酶活力的测定，如表1所示，结果表明α-淀粉酶纯化后得率，得率较高，且酶活在纯化过程中较为稳定。

表1α-淀粉酶活力测定

实施例3

构建α-淀粉酶菌株中提取的α-淀粉酶的相关性质：

1.酶蛋白分子量的测定

用SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳按常规方法进行。分离胶、浓缩胶浓度分别为12％和5％，电极缓冲液为pH8.3Tris-Gly缓冲，考马斯亮蓝染色，结果如图3所示。电泳后用GEL-DOC2000(Bio-Rad)进行凝胶扫描。运用扫描系统自带软件Quantity One进行分子量测定，测得α-淀粉酶蛋白分子量为85Kd。

2.酶的最适pH

利用上述酶活测定方法测定α-淀粉酶活力，如表1所示。作用的最适温度为10-20℃(图4),酶活性分别保留85％以上。可见该酶有潜力应用于中温条件下淀粉液化加工行业。

3.酶的pH稳定性

提取后的α-淀粉酶溶解于不同pH缓冲液中，15℃条件下放置2h后，测定α-淀粉酶相对活力，如附图3所示。结果表明该α-淀粉酶在较宽的pH范围内显示了高度的稳定性，在的缓冲液中能保持其最高酶活85％以上，显示了良好的pH稳定性，在纺织、造纸以及食品加工行业有良好的应用潜力。

4.酶的最适反应温度

纯酶分别放置于不同温度下反应30min，测定其酶活如图4所示。该酶作用的最适温度为10-20℃(图4),酶活性分别保留85％以上。可见该酶有潜力应用于中温条件下淀粉液化加工行业。

5.金属离子对α-淀粉酶活力的影响

在三个浓度水平lmmol/L、5mmol/L、10mmol/L探讨Na⁺、K⁺、Li⁺—价金属离子；Ca²⁺、Ni²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Cu²⁺、Fe²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Ba²⁺、Pb²⁺二价金属离子；Fe³⁺三价金属离子以及EDTA对α-淀粉酶活力的影响。4℃下放置30min，65℃条件下反应30min，并检测α-淀粉酶活力。以不加金属离子的酶活为对照测定酶的相对活力。结果低浓度(lmmol/L)的金属离子存在条件下，大部分金属离子可明显促进α-淀粉酶活力，中等浓度(5mmol/L)的金属离子存在条件下,大部分金属离子可提高α-淀粉酶活力。此外实验发现不同浓度的EDTA对酶活力影响不大。表明该酶符合纺织、造纸以及食品加工行业应用的基本要求。上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化、均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围内。

序列表

<110> 南京晓庄学院

<120> 产适冷α-淀粉酶菌株、构建方法和生产α-淀粉酶的方法

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 2082

<212> DNA

<213> 海泥α-淀粉酶基因

<400> 1

atgtatgaactgctgccgggtaaaacccacccgattggcgctacggtggaagatggcggtgttaatttttgcctgtactgtgacgaacgtagtacctccgttgaactgctgctgtttgaacagcataacgcgctggaaccgtatgaaattatccgcttcgatccgctgatccatcgtagcttttacttctggcacatttttgtcaaaggtctgccggagaaaacccactatgcctaccgtgtgggcggtccgtttcagccggaaaatggcctggttttcgatccgcagaaagtcctgattgacccgtatagcaaaggtatcaattgctctctgtggcagcgcaacgatgcatgtaaagctggcgacaacctgcacacctctatgcgtagctgcgtgctgaaactgacggattatgactggcagggtgattctccgccgaaccatcacctgaacgaaagtatcatctacgaaatgaacgtgggcggttttaccaaaagtccgacgtccggtgttaaacatccgggcacctatgcgggcattatcgagaaaattccgtacctgaccgcactgggcatcacggctgttgaactgctgccgatttttgaatttgaagatagcgaagtccgttacttcaacggtaacaaactggtgaactattggggctactccaccattaactttttcgccccgcattcaggttactgtgtgaatccgcaggaaggcaaccacctggatgaatttcgcgacctggttaaagcgctgcatcaagccgatattagcgtcatcctggacgtggtttttaaccataccgatgaaagtgaccaccgtggtccggtttattcctttaaaggcttcgccaacaactcatactactttctgatggataaacacaagaacttctactgcaactactctggctgtggtaatacgtttaaatgcaaccatccgattggcgagaaattcatcgtggattgtctggaatactgggtccgcgatatgcatgtggacggttttcgtttcgatgaaggcaccatcctggcccgtggcgacaatggtaacctgatcgcgaatccgccggtcgtgtgggccattgaactgtctgaacagctggccgatacgaaagttattgcagaagcgtgggacgcagaaggcggttatctggtcggtagttttccgggccaccgctgggcagaatggaacggtctgtaccgtgatgacctgcgcgattttgtgcgtggcaaagcaggtatgctgggcaccttcgctcgtcgcattacgggcagcgcggatatttatgaatcccagtacgaactgccgggtaattcaatcaacttcatcaactcgcatgatggcttcaccctgaatgacctggtcagctataaccataaacacaaccaggcaaatggtgaaaacaattcggatggcattgacaacaatcgtagctggaattgcggtgtggaaggcattacggataacccgcagatcaatatgctgcgtaaacgccaaattaagaactttgcggccatcctgatgctgagtaaaggtgttccgatgttcgtcgcgggtgatgaaatctgccgcacccagcagggtaacaataacgcatattgtcaggacaatgaactgtcgtggttcaactggcaagatgtggacacgaataaaagcatgttacagttttggcaacgcctgattgcattccgtaaagttcacccgcgtctgtttcgcaacaaatactacaactccgaaatcaacaaatcaggtctgtcggatattctgtggcatggctgcgaactgggtaaaccgggttggtatgatccgtcaggcctggcgctggccatgaccctgggtgaacgtgcggatggcgaagacattcatatcatgttcaacatgtactgggaaggcctggaatttgaactgccggatattgaaggcgagaaatggtatcgtgctattgatacctttctgagcagcccgctggatattgcgaaaacgggtgaagaaatcgtgcattcaggctcgcactataaagttaacgcgcgcagcgttgtcgtgctgattagcaagaaagatccgatttgctaa 2082

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tccgtaggtg aacctgcgg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

<210> 4

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cgcggatcca atgaacaata tccggtac 28

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcgaagctta gcatgtttgg cgaaaaat 28