产适冷α‑淀粉酶菌株、构建方法和生产α‑淀粉酶的方法与流程

文档序号:12412107阅读:来源:国知局

技术特征:

1.产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法,包括如下步骤:

(1)取海泥,构建宏基因组文库;

(2)进行α-淀粉酶基因的筛选,得到含有α-淀粉酶基因的阳性克隆;

(3)α-淀粉酶基因的克隆:

a.基于筛选得到的α-淀粉酶基因的开放阅读框序列,设计扩增引物A1 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’和引物A2 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’,以含有α-淀粉酶基因的阳性克隆提取的质粒为模板,进行PCR扩增;凝胶回收PCR产物,纯化,插入载体并转化到感受态细胞中,筛选阳性克隆;提取阳性克隆的质粒,测序,确定重组质粒的插入片段序列,确定PCR纯化产物为α-淀粉酶基因;

b.测序正确后,将步骤a的PCR纯化产物连接到pET-28(+)载体上得到二次扩增模板,使用以下两种引物对二次扩增模板进行扩增:F1 5’-CGCGGATCCAATGAACAATATCCGGTAC-3’和R1 5’-GCGAAGCTTAGCATGTTTGGCGAAAAAT-3',扩增产物为α-淀粉酶基因,测序;

c.pET-20b载体和扩增产物分别用BamHI和 HindIII进行双酶切并连接,扩增产物α-淀粉酶基因插入载体pET-20b后得到带有α-淀粉酶基因的表达载体并转化大肠杆菌BL21,再接种带有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21于含有一定浓度氨苄青霉素的LB培养基中,筛选得到含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21;

d.对筛选得到的含有α-淀粉酶基因的大肠杆菌BL21进行质粒提取,测序验证。

2.根据权利要求1所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法,其特征在于:步骤(1)具体为:取海泥1g, 利用DNA提取试剂盒提取宏基因组,通过物理和化学协同破碎细胞的方法,将DNA释放出来;采用质粒pCC2FOS™ Vector及宿主菌Escherichia coli EPI300构建宏基因组文库。

3.根据权利要求1所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法,其特征在于:步骤(2)具体为:取10uL宏基因组文库菌液用液体种子培养基稀释到100uL,均匀涂布于α-淀粉酶筛选平板,37°培养3天,然后转入4°保存,观察到菌落周围出现明显透明圈的即为α-淀粉酶阳性克隆;将筛选出来的阳性克隆挑出,用液体种子培养基富集培养,划线于α-淀粉酶筛选平板上重复验证。

4.根据权利要求3所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法,其特征是,所述液体种子培养基的组成为:淀粉,10 g;KH2PO4,4.0 g;MgSO4,0.03 g;蒸馏水1000 mL。

5.根据权利要求3所述的产适冷α-淀粉酶菌株的构建方法,其特征是,上述步骤(a)中,PCR反应体系为50 μl,包括1 μl DNA模板、5 μl 10×PCR buffer、3 μl 25 mM MgCl2、4 μl dNTP mixture、1 μl 20 μM引物A1、1 μl 20 μM 引物A2、0.25 μl、5 U/μl Taq 酶和 34.75 μl 灭菌ddH2O;PCR反应条件:94℃ 5 min;94℃ 30 s,55℃ 30 s,72℃ 30 s ,共28个循环;72℃ 5 min。

6.一种产适冷α-淀粉酶菌株生产α-淀粉酶的方法,其特征是,所述方法包括以下步骤:

(1)产酶培养

目标基因α-淀粉酶的转化株生长在含有表达质粒对应抗生素的发酵产酶培养基中,37℃恒温培养,直到吸光值OD600达到0.6—0.8,然后用IPTG进行诱导表达,环境温度仍然控制在37℃;经过一定时间后,诱导细胞离心,上清液用于蛋白分离;

(2)硫酸铵沉淀

分别取50mL上述粗酶液,按终浓度分别为40%,50%,60%,70% W/V要求,分别加入不同质量的硫酸铵,冰浴中持续搅拌充分沉淀后,低温离心,弃去上清,沉淀物用10 mmol/L, pH 5.5的醋酸缓冲液复溶,上清为所得粗酶液,测得上清液酶活;将粗酶液用20 mmol/L, pH5.5的醋酸缓冲透析,除去残留的硫酸铵;

(3)Sephadex G-100凝胶过滤层析

将上一步透析样品上样到含有10 mmol/L, pH 5.5的醋酸缓冲液的sephadex G-100凝胶柱中,进行sephadex G-100凝胶过滤层析分离,用含0.2mo1/L NaCI的醋酸缓冲液A进行洗脱,流速为1mL/min;将收集的样品进行活性测定,收集活性部分,透析脱盐后,冻干浓缩,即为纯化后的α-淀粉酶。

7.根据权利要求6所述的一种利用权利要求1所述的产适冷α-淀粉酶菌株生产α-淀粉酶的方法,其特征是,上述步骤(1)中,所述发酵产酶培养基的组成为:可溶性淀粉,20 g;MgSO4·7H2O,0.5 g;NaCl,0.5 g;FeSO4·7H2O,0.01 g;琼脂,20 g;蒸馏水,1000 mL,pH 6.0~6.5;IPTG添加终浓度1 mM。

8. 产适冷α-淀粉酶菌株,保藏编号为CCTCC M 2016786,保藏日期为2016.12.26。

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