一种提高细菌转化效率的方法与流程

本发明涉及分子生物学与基因工程技术领域，具体是涉及一种提高细菌转化效率的方法。

背景技术：

细菌转化指某一受体细菌通过直接吸收来自另一供体细菌的含有特定基因的脱氧核糖核酸(DNA)片段，从而获得了供体细菌的相应遗传性状，这种现象称为细菌转化。自然界的转化现象，一般发生在同一物种或近缘物种中。细菌转化方法已被引入其他生物，例如采用原生质体转化法，可将外源DNA注入到不具摄取DNA能力的生物中，使其获得某些新的特性。细菌转化现象最初由英国细菌学家格里菲斯(F.Griffith)于1928年发现，直至1944年美国科学家埃弗里(O.T.Avery)等人才证实了转化因子是脱氧核糖核酸，从而为遗传学的发展作出了重大贡献。

细菌转化是现代基因工程与分子生物学最重要的操作技术之一。转化效率的高低决定后续工作的开展，而细菌的状态是影响转化效率最关键的因素之一。已发现在许多细菌中均能发生转化现象。转化成功率与某些因子密切相关，例如受体菌处于感受态阶段可产生感受态因子，是接受外来DNA片段的最佳时期，而钙离子、环腺苷酸(cAMP)等物质亦可大大提高转化率。然而目前对于提高细菌转化效率的研究还有待进一步提升。

其中，EPS广泛存在于微生物细胞外和微生物聚集体内部。将存在于各种微生物聚集体内部的生物大分子(如多糖、蛋白质、核酸、磷脂等)统称为胞外聚合物。EPS包括所有微生物分泌的大分子物质，以及细胞溶和大分子水解的产物。

根据EPS在细胞外存在的位置，可将其分为结合态EPS(包括荚膜聚合物、松散结合聚合物、鞘、凝聚凝胶和附着有机质)和游离态EPS(可溶态、胶体态、黏液态的大分子)。结合态EPS与细胞本身结合较为紧密，而游离态EPS与细胞微弱结合或存在于环境溶液中。一般地，结合态和游离态EPS可以通过离心的方法分离，残留在上清液中的为游离态EPS，随微生物细胞沉淀的为结合态EPS。普遍认为结合态EPS具有双层结构，内层为紧密结合态EPS有特定的形状并且紧密固定在微生物细胞表面，外层为松散结合态EPS并没有明显区分的疏松分散黏液层。虽然游离态EPS与细胞表面的相互作用非常微弱，但在的聚集过程中游离态EPS起到至关重要的作用，而结合态EPS几乎不影响这一过程。游离态EPS在微生物细胞聚集、固相表面吸附、矿物溶解和生物矿化、重金属固定等方面有重要影响。

由于细胞EPS的产生和分泌，进一步保护细胞膜并与外界环境隔离，导致外源质粒进入细胞内进行表达这一过程受到EPS的阻碍，使得转化效率低下。

技术实现要素：

本发明解决的技术问题是提供一种提高细菌转化效率的方法。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

一种提高细菌转化效率的方法，主要包括以下步骤：

1)受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于10ml LB液体培养基中，37℃下150rpm下振荡培养12h，直至对数生长后期；将该菌悬液以1％的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养4小时至OD600＝0.5左右，得到菌液备用；

2)细胞EPS的去除：将25ml步骤1)制备的菌液加入离心管内，4000g离心10min，去掉上清液，再向离心管内加入25ml步骤1)制备的菌液，4000g离心10min，去掉上清液；之后加入预冷的25ml UP水重悬，再次离心，去掉上清液；向离心管中加入预冷的10ml超纯水，重悬菌液，4℃40kHz超声10min，12000g离心20min，去掉上清液，保留菌体；

3)感受态细胞的制备：

a.将步骤2)所得菌体加预冷的超纯水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入两个灭菌的50ml离心管中，4℃5000rpm离心10min，收集菌体，去掉上清液；

b.向离心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原体积1/5)，振荡悬浮菌体，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm离心10min，去掉上清，向离心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液25ml(原体积的一半)悬浮菌体沉淀；

d.4℃，5000rpm离心10min，去掉上清液，向离心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液或MnCl₂溶液悬浮菌体，得到感受态细胞悬液，每份100μl分装后保存于-80℃冰箱中备用；

4)转化：

a.从-80℃冰箱中取200μl步骤3)制备的感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；

b.加入质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后；

c.42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；

d.向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

e.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时；

f.根据生长情况对菌落数进行计数。

进一步地，在上述方案中，所述LB培养基的配制方法为：在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl 10g，摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至终总体积为1L，121℃湿热高温灭菌20min。

进一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液的配制方法为：取质量分数为30％的甘油溶液200ml，灭菌，取0.2M CaCl₂溶液200ml，灭菌，将二者混合均匀即成。

进一步地，在上述方案中，所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法为：取质量分数为30％的甘油溶液200ml，灭菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，灭菌，将二者混合均匀即成。

本发明的有益效果是：本发明的提高细菌转化效率的方法，具有转化效率高、操作步骤简单、温度和细菌生长条件要求低、革兰氏阴性菌和阳性菌通用的特点，对分子生物学与基因工程技术领域具有重要的意义。

附图说明

图1本发明细菌转化过程示意图；

图2是不同处理下细胞膜通透性改变情况；

图3是CaCl₂处理下的感受态细胞使用三种质粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)转化子统计结果；

图4是MnCl₂处理下的感受态细胞使用三种质粒(PUC19，PHSG298，PHSG396)转化子统计结果。

具体实施方式

下面结合具体实施方式来对本发明进行更进一步详细的说明：

一种提高细菌转化效率的方法，主要包括以下步骤：

1)受体菌的培养：从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落，接种于10ml LB液体培养基中，37℃下150rpm下振荡培养12h，直至对数生长后期；将该菌悬液以1％的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养4小时至OD600＝0.5左右，得到菌液备用；

2)细胞EPS的去除：将25ml步骤1)制备的菌液加入离心管内，4000g离心10min，去掉上清液，再向离心管内加入25ml步骤1)制备的菌液，4000g离心10min，去掉上清液；之后加入预冷的25ml UP水重悬，再次离心，去掉上清液；向离心管中加入预冷的10ml超纯水，重悬菌液，4℃40kHz超声10min，12000g离心20min，去掉上清液，保留菌体；

3)感受态细胞的制备：

a.将步骤2)所得菌体加预冷的超纯水至100ml，得到菌液，冰浴10min，倒入两个灭菌的50ml离心管中，4℃5000rpm离心10min，收集菌体，去掉上清液；

b.向离心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl₂溶液或MnCl₂溶液(原体积1/5)，振荡悬浮菌体，在冰上放置20min；

c.4℃，5000rpm离心10min，去掉上清，向离心管中加入0.1mol/L CaCl₂溶液(原体积的一半)悬浮菌体沉淀；

d.4℃，5000rpm离心10min，去掉上清液，向离心管中加入2ml含20％甘油的冷的0.1mol/L CaCl₂溶液悬浮菌体，得到感受态细胞悬液，每份100μl分装后保存于-80℃冰箱中备用；

4)转化：

a.从-80℃冰箱中取200μl步骤3)制备的感受态细胞悬液，室温下使其解冻，解冻后立即置冰上；

b.加入PUC19质粒DNA溶液(含量不超过50ng，体积不超过10μl)，轻轻摇匀，冰上放置30分钟后；

c.42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟，热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟；

d.向管中加入1ml LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态，并表达质粒编码的抗生素抗性基因；

e.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含抗生素的筛选平板上，正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿，37℃培养16-24小时；

f.根据生长情况对菌落数进行计数。

其中，所述LB培养基的配制方法为：在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨(bacto-typtone)10g，酵母提取物(bacto-yeast extract)5g，NaCl10g，摇动容器直至溶质完全溶解，用NaOH调节pH至7.0，加入去离子水至终总体积为1L，121℃湿热高温灭菌20min。所述20％甘油的冷的0.1mol/LCaCl₂溶液的配制方法为：取质量分数为30％的甘油溶液200ml，灭菌，取0.2MCaCl₂溶液200ml，灭菌，将二者混合均匀即成。所述20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液的配制方法为：取质量分数为30％的甘油溶液200ml，灭菌，取0.2M MnCl₂溶液200ml，灭菌，将二者混合均匀即成。

实施例2

与实施例1不同的是，将所述步骤4)b中的PUC19质粒换成PHSG298质粒。

实施例3

与实施例1不同的是，将所述步骤4)b中的PUC19质粒换成PHSG396质粒。

实施例4

与实施例1不同的是，将所述步骤3)c中的CaCl₂溶液换成MnCl₂溶液；将所述步骤3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液换成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液。

实施例5

与实施例1不同的是，将所述步骤3)c中的CaCl₂溶液换成MnCl₂溶液；将所述步骤3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液换成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；将所述步骤4)b中的PUC19质粒换成PHSG396质粒。

实施例6

与实施例1不同的是，将所述步骤3)c中的CaCl₂溶液换成MnCl₂溶液；将所述步骤3)d中的含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液换成含20％甘油的冷的0.1mol/L MnCl₂溶液；将所述步骤4)b中的PUC19质粒换成PHSG396质粒。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。