一种提高细菌转化效率的方法与流程

文档序号:12412105阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种提高细菌转化效率的方法,其特征在于,主要包括以下步骤:

1)受体菌的培养:从LB平板上挑取新活化的E.coli DH5α单菌落,接种于10ml LB液体培养基中,37℃下150rpm下振荡培养12h,直至对数生长后期;将该菌悬液以1%的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养4小时至OD600=0.5左右,得到菌液备用;

2)细胞EPS的去除:将25ml步骤1)制备的菌液加入离心管内,4000g离心10min,去掉上清液,再向离心管内加入25ml步骤1)制备的菌液,4000g离心10min,去掉上清液;之后加25ml水重悬,再次离心,去掉上清液;再向离心管中加入10ml超纯水,重悬菌液,超声处理后,12000g离心20min,去掉上清液,保留菌体;

3)感受态细胞的制备:

a.将步骤2)所得菌体加预冷的超纯水至100ml,得到菌液,冰浴10min,倒入两个灭菌的50ml离心管中,4℃5000rpm离心10min,收集菌体,去掉上清液;

b.向离心管中加入10ml冰冷的0.1mol/L的CaCl2溶液或MnCl2溶液,振荡悬浮菌体,在冰上放置20min;

c.4℃,5000rpm离心10min,去掉上清,向离心管中加入0.1mol/L CaCl2溶液或MnCl2溶液25ml悬浮菌体沉淀;

d.4℃,5000rpm离心10min,去掉上清液,向离心管中加入2ml含20%甘油的冷的0.1mol/L CaCl2溶液或MnCl2溶液悬浮菌体,得到感受态细胞悬液,每份100μl分装后保存于-80℃冰箱中备用;

4)转化:

a.从-80℃冰箱中取200μl步骤3)制备的感受态细胞悬液,室温下使其解冻,解冻后立即置冰上;

b.加入质粒DNA溶液,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后;

c.42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3-5分钟;

d.向管中加入1ml LB液体培养基,混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因;

e.将上述菌液摇匀后取100μl涂布于含抗生素的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。

f.根据生长情况对菌落数进行计数。

2.如权利要求1所述的一种提高细菌转化效率的方法,其特征在于,步骤1)所述LB培养基的配制方法为:在950mL去离子水中加入:胰蛋白胨(bacto-typtone)10g,酵母提取物(bacto-yeast extract)5g,NaCl 10g,摇动容器直至溶质完全溶解,用NaOH调节pH至7.0,加入去离子水至终总体积为1L,121℃湿热高温灭灭菌20min。

3.如权利要求1所述的一种提高细菌转化效率的方法,其特征在于,步骤3)所述20%甘油的0.1mol/L CaCl2溶液的配制方法为:取质量分数为30%的甘油溶液200ml,灭菌,取0.2M CaCl2溶液200ml,灭菌,将二者混合合均匀即成。

4.如权利要求3所述的一种提高细菌转化效率的方法,其特征在于,步骤3)所述20%甘油的0.1mol/L MnCl2溶液的配制方法为:取质量分数为30%的甘油溶液200ml,灭菌,取0.2M MnCl2溶液200ml,灭菌,将二者混合均匀即成。

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