一种低温型细菌DNA连接酶的制备方法及其应用与流程

文档序号：12412109阅读：594来源：国知局

本发明属于基因工程技术领域，尤其是涉及一种低温型细菌DNA连接酶的制备方法及其应用。

背景技术：

限制性内切核酸酶和DNA连接酶的出现促生了DNA的体外重组技术，即基因克隆克隆技术。基因克隆技术是现代分子生物学与基因工程的基础，极大的促进了蛋白质重组表达、工程菌株改造等应用。目前基因克隆中用的DNA连接酶为T4噬菌体DNA连接酶。基因克隆的DNA连接反应温度在4-16度范围内进行。而T4噬菌体DNA连接酶的最适温度在30-40度，与基因克隆的DNA连接反应温度不匹配，导致DNA连接效率低，需要长时间反应，连接时间长达12小时，大大的限制了基因克隆的速度。

为了提高基因克隆中的低温连接效率，缩短连接反应所需的时间，本发明旨在研发一种DNA连接酶，其活性最优温度范围为4-20度；用于基因克隆的DNA连接反应。

本发明的有益效果在于：本发明的DNA连接酶在低温下的催化活性最高，用于基因克隆时将DNA连接反应所需的时间从16小时缩短到了5分钟，极大地加速了基因克隆速度。

技术实现要素：

为了解决基因克隆中遇到的连接效率低这一技术瓶颈，本发明的目的在于提供一种低温型DNA连接酶、制备方法及其在基因克隆中的应用。本发明的低温型细菌DNA连接酶在4-20度的温度范围内酶活性最高；在该温度范围内反应5分钟的连接产物大于90%，非常适合于基因克隆中的低温DNA连接反应。本发明的低温型DNA连接酶用于基因克隆，将DNA连接反应所需的时间从16小时缩短到了5分钟，极大地加速了基因克隆速度。

本发明的技术方案具体如下。

本发明提供一种低温型DNA连接酶的制备方法及其在基因克隆中的应用，具体步骤如下：

（1）构建DNA连接酶的重组表达质粒

基于嗜冷微生物基因组信息，设计其编码的DNA连接酶基因，在此基础上，修改优化DNA连接酶编码基因的稀有密码子，采用全基因合成或PCR技术获得嗜冷菌株的DNA连接酶基因，并将该基因克隆到原核表达载体pET28等，构建DNA连接酶重组表达质粒；

（2）重组表达DNA连接酶

将构建的DNA连接酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3）等，得到DNA连接酶重组表达菌株；再将其用诱导剂IPTG进行DNA连接酶诱导表达；

（3）亲和纯化表达的DNA连接酶

离心收集诱导表达DNA连接酶后的大肠杆菌，将菌体重悬于非变性蛋白裂解液，超声波破碎菌体，离心收集含有DNA连接酶的大肠杆菌裂解上清液；再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化DNA连接酶；

（4）检测纯化的DNA连接酶的酶活性，尤其是低温下的酶活性，获得低温型DNA连接酶。

将纯化后DNA连接酶进行酶活性检测，从中筛选出低温下具有良好活性的DNA连接酶；低温型DNA连接酶的技术参数为：在4-20度范围内， 5分钟内DNA连接酶能够连接90%的DNA分子。

（5）低温型DNA连接酶用于基因克隆。

本发明还进一步提供基于低温型DNA连接酶的基因克隆应用。具体方法如下：在基因克隆的DNA连接操作中将T4噬菌体DNA连接酶替换成本发明的DNA连接酶，反应5分钟，进行基因克隆。

本发明中，步骤（1）中，所述嗜冷微生物包括Colwellia psychrerythraea，Photobacterium profundum等。

本发明中，步骤（2）中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为：先将DNA连接酶重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0，再加入0.5mM 诱导剂IPTG在30-37℃温度下培养3小时或10-30℃温度下培养12小时进行诱导表达。

本发明中，步骤（3）中，所述非变性蛋白裂解液的组成如下：20 mM pH值为 8.0的Tris-HCl, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油。

本发明中，所述嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea，Photobacterium profundum的低温型DNA连接酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。

与现有技术相比，本发明具有显著进步，可以大大缩短基因克隆的时间，具体如下：

（1）基因克隆时间极短。DNA连接反应时间由16小时缩短至5分钟，所需时间比基于T4噬菌体DNA连接酶的基因克隆的缩短200倍。

（2）基因克隆效率高。由于低温型DNA连接酶能够将90%的DNA分子连接在一起，因此克隆效率比基于T4噬菌体DNA连接酶的基因克隆的增高20倍。

附图说明

图1为是嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea的DNA连接酶催化活性的温度依赖性。

图2为是基于嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea，Photobacterium profundum与T4噬菌体DNA连接酶的基因克隆效率比较。

图3为是嗜冷细菌Photobacterium profundum的DNA连接酶催化活性的温度依赖性。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，而不能以此来限制本发明的保护范围。

实施例1 嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶的制备

第一步，设计合成嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒。重组嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。

第二步，重组表达嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶。将嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM 诱导剂IPTG，在16℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Colwellia psychrerythraeaDNA连接酶表达。

嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ IDNO:1所示。

第三步，嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油）。超声波破碎菌体，离心收集含有嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶。

第四步，检测嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶的酶活性和酶活温度依赖性。利用配对区为4个碱基对的带缺口的750bp双链DNA作为底物，加入嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶，测定DNA连接酶的酶活性与温度依赖性。具体酶活性温度依赖性结果见图1。结果表明嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶在5-20度范围内具有最高酶活性，而在30度下活性非常低。

第五步，嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶的基因克隆效率。在此基础上，利用嗜冷细菌Colwellia psychrerythraea DNA连接酶代替T4噬菌体DNA连接酶进行基因克隆，将载体片段与待插入基因片段在4，8，12，16，20度保温5分钟进行连接反应，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆数，相比T4噬菌体DNA连接酶，Colwellia psychrerythraea DNA连接酶的克隆数提高尽20倍（图2，CpsDNA连接酶）。

实施例2 嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶的制备

第一步，设计合成嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶基因，并插入pET28表达载体，构建DNA连接酶的重组表达质粒。重组嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶N端带有来源于pET28载体的6个连续组氨酸亲和纯化标签，用于固定化镍离子亲和层析纯化。

第二步，重组表达嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶。将嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21（DE3），得到嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶重组表达菌株。将表达菌株培养至OD600=0.6，加入0.5mM 诱导剂IPTG，在16℃温度下培养12小时，诱导嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶表达。

嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶重组蛋白的氨基酸序列（氮端→碳端）如SEQ IDNO:2所示。

第三步，嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶亲和纯化。将步骤二诱导后的大肠杆菌离心收集后，菌体重新悬浮于蛋白裂解液（20 mM Tris-HCl, pH 8.0, 300 mM NaCl, 0.5mM DTT，10vol% 甘油）。超声波破碎菌体，离心收集含有嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶的菌体裂解上清液。利用固定化镍离子亲和纯化树脂纯化嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶。

第四步，检测嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶的酶活性和酶活温度依赖性。利用配对区为10个碱基对的带缺口的双链DNA作为底物，加入嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶，测定DNA连接酶的酶活性与温度依赖性。具体酶活性温度依赖性结果见图3。结果表明嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶在4-28度范围内具有最高酶活性，而在30，36度活性很低。

第五步，嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶的基因克隆效率。利用嗜冷细菌Photobacterium profundum DNA连接酶代替T4噬菌体DNA连接酶进行基因克隆，将载体片段与待插入基因片段在4，8，12，16，20度保温5分钟进行连接反应，最后将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，鉴定阳性克隆数，相比T4噬菌体DNA连接酶，Photobacterium profundum DNA连接酶的克隆数提高尽20倍（图2，Pfr DNA连接酶）。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

核苷酸和氨基酸序列表

SEQ ID NO:1

1 MSNVEKKISQ LQQQLNQYNH EYYVLDQPSV PDAEYDRLMT ALIDLEKTNP ELKTIDSPSQ

61 KVGGQALKSF TQVTHQLPML SLDNVFSLDD FHAFVKRVKD RLNDNQAIVF CAEPKLDGLA

121 VSLRYEHGQL IQAATRGDGS VGENITTNIR TIKSIPLKLM GTPGKDFPDI VEVRGEVFMP

181 KASFDALNTL AKKRGEKGFA NPRNAAAGSL RQLDSKITAK RNLAFYAYSL GFVGKLSDGG

241 AESTDLTNDF FANSHHERLC QLKRLGLPMC PEVRLLESEQ ACDAFYQDIL AKRSALSYEI

301 DGTVLKVDEI SLQKRLGFVA RAPRWAIAYK FPAEEELTCV EDVEFQVGRT GAITPVARLK

361 PVFVGGVTVS NATLHNQDEI TRLGLKVNDF VVIRRAGDVI PQIVSVVLDK RPDNAVDIVF

421 PTSCPVCDSA VAKPEGEAVL RCTAGLFCAA QRKEAIKHFA SRKAHDVDGL GDKLVEQLVD

481 EKLINTPADL FKLTEIQVST IDRMGKKSAT NLINGLEQAK STTLAKFIYG LGIREVGEAT

541 AANLANHFYT LAAIESASLE DLQNVSDVGE VVAKNIINFF KEEHNLAIVS GLSEVMHWPT

601 IEIKSAEELP LAEQIFVLTG TLTQMGRTEA KTALQSLGAK VSGSVSKNTH FVVAGDKAGS

661 KLTKAQDLGI SVLTEDGLVA LLAEHGITI

SEQ ID NO:2

1 MIGSEMSTDI QQQLDTLREQ LAYHGHRYYV EDNPEIPDAE YDRMMQQLLA LEAEHPELMS

61 VDSPSQRVGG TPLDSFTQVK HELPMLSLDN AFNDEELNAF EKRLLDRLIT AGHVSYCCEP

121 KLDGLAVSLM YENGVLVQAA SRGDGATGEN ITTNVRTIRS IPLKLQGEGW PVRLEVRGEV

181 FMPKKGFDEL NARALKKGDK AFANPRNAAA GSLRQLDSKI AATRPLSFYA YSVGVVEGMD

241 LAESQYERLV QLKGWGIPMC PEIRQLKTIN DVIAYYQDIG ERRQSLAYEI DGVVIKVDDV

301 ETQEQLGFVA RAPRWAIAYK FPAQEEMTLL NNVEFQVGRT GAITPVAKLE PIFVGGVTVS

361 NATLHNADEV ARLGVMIGDT VIIRRAGDVI PQIVSVVESR RPDNAQAITF PITCPVCESN

421 VERVEGEAVA RCTGGLFCQA QRKEALKHFV SRKALDVDGC GEKVIEQLVD REMVTTPAGL

481 FKLSAGIVTV LDRMGPKSAQ KLVDSLANSK ETTLPRFIYS LGIREVGEAT AANLANHFET

541 LEAITAASKE QLLVVPDVGE VVANNLLNFF REAHNMDVVE DLIAVGIHWP AIDKPEEGVE

601 LPLDGKVVVL TGSLSQLTRS DAKAALQALG AKVTGSVSSK TDLLVAGEAA GSKLTKAQEL

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