1.一种低温型细菌DNA连接酶的制备方法,其特征在于,具体步骤如下:
(1)构建低温型DNA连接酶的重组表达质粒
基于嗜冷微生物基因组信息,设计合成其编码的DNA连接酶基因,在此基础上,优化DNA连接酶基因的稀有密码子,并将优化的DNA连接酶基因克隆到原核表达载体pET28等,构建DNA连接酶重组表达质粒;
(2)重组表达DNA连接酶
将构建的DNA连接酶重组表达质粒转化大肠杆菌表达宿主BL21(DE3),得到DNA连接酶重组表达菌株;再将其用诱导剂IPTG进行低温型DNA连接酶诱导表达;
(3)亲和纯化表达的DNA连接酶
离心收集诱导表达DNA连接酶后的大肠杆菌,将菌体重悬于非变性蛋白裂解液,超声波破碎菌体,离心收集大肠杆菌裂解上清液;再利用固定化镍离子亲和纯化树脂从上清液中纯化低温型DNA连接酶;
(4)检测DNA连接酶的酶活性和最优反应温度,获得高活性的低温型DNA连接酶
将纯化的DNA连接酶进行酶活性和最优反应温度测定,鉴定其酶活性与酶活性温度依赖性;确保其能够在低温下具有最高酶活性,即在4-20度范围内的酶活性最高。
2.根据权利要求1所述的一种低温型细菌DNA连接酶的制备方法,其特征在于:步骤(1)中,所述嗜冷微生物包括Colwellia psychrerythraea,Photobacterium profundum等。
3.根据权利要求1所述的一种低温型细菌DNA连接酶的制备方法,其特征在于:步骤(2)中用诱导剂IPTG进行诱导培养的具体条件为:先将低温型DNA连接酶重组表达菌株培养至OD600=0.4-1.0,再加入0.5mM 诱导剂IPTG在25-37℃温度下培养3小时或10-25℃温度下培养12小时进行诱导表达。
4.如权利要求1~3之一所述的制备方法得到的低温型DNA连接酶。
5.如权利要求4所述的低温型DNA连接酶,其中:DNA连接酶的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1-2所示。
6.如权利要求1~3之一所述的制备方法得到的DNA连接酶用于基因克隆,提高基因克隆的DNA连接反应效率,缩短反应时间,加速基因克隆。