一种提高植物赤霉病抗性的小麦基因及其应用的制作方法

本发明属于生物基因工程技术领域，特别是一种小麦木聚糖-阿拉伯糖基转移酶基因taxat的克隆与在提高植物赤霉病抗性中的应用。

背景技术：

赤霉病(fusariumheadblight)是由禾谷镰刀菌引起的，危害小麦、大麦、燕麦、玉米、水稻、黑麦等禾谷类作物的重要病害之一，严重影响我国粮食生产的产量和品质。赤霉病在我国长江中下游和东北地区大面积发生，在大流行年产量减少20-40%。近年来随着耕作模式改变和气候变化，赤霉病已经向我国其他的主产区蔓延。此外，病麦粒携带的真菌毒素影响种子质量，危害人和动物的健康，成为威胁粮食安全的隐患之一。耕作模式和栽培技术的改变难以解决病害的侵染和蔓延，使用药剂防治对控制赤霉病大发生和大流行取得了一定的效果，但同时增加了生产成本，化学药剂的使用也不可避免的导致环境污染。利用赤霉病抗性基因进行品种改良是减轻赤霉病危害的有效途径。

研究表明，小麦赤霉病的抗性是由少数主效基因加众多微效基因控制的复杂数量性状，已从普通小麦或近缘种中定位了超过100与赤霉病相关的抗性位点，这些抗性位点分布在除7d以外的所有20条染色体上。通过基因组、转录组和蛋白组等分析方法表明赤霉病候选基因分布在小麦应答禾谷镰刀菌的各个生物学过程中，如次级代谢生物合成、细胞壁防御、降低胞内过氧化物和转化毒素等。

tafrog基因(alexandraetal,2015)位于a基因组第4号染色体上，克隆自抗性种质“cm82036”，编码一个未知功能的蛋白，与tasnrk1α互作后能一定程度上减缓赤霉病的发生。

taabcc3基因(stephanieetal,2015)在a、b、d基因组第3号染色体上各有一个拷贝，基因全长为4503bp,编码的蛋白含有一个abc转运酶c家族结构域，利用病毒诱导的基因沉默证实taact基因参与taabcc3基因参与毒素的降解，能增强植物对毒素的耐受能力。

taact基因(kageetal,2016)位于d基因组第2号染色体长臂上，cdna全长为1326bp,编码的蛋白含有一个转移酶结构域，利用病毒诱导的基因沉默证实taact基因参与防御赤霉病菌。

pft基因(rawatetal,2016)位于b基因组第3号染色体短臂，克隆自中国赤霉病抗性品种“苏麦3号”。pft基因全长3427bp,它含有1个5’非翻译区，2个外显子、1个内含子和1个3’非翻译区，编码的蛋白含有2个植物凝集素结构域和1个etx/mtx2结构域。在基因区域发生单核苷酸突变后引起的移码突变可使抗性植株抗性降低。

赤霉病菌在花期时侵染小麦小穗，产生大量的细胞壁降解酶类，如：果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶等来降解细胞壁多聚糖，从而达到在宿主上侵染和扩展的目的。降解酶类对细胞壁的降解程度受细胞壁的成分及其相对含量的影响，在宿主-病原菌互作中发挥重要的作用，但在禾谷类作物中这方面的研究还比较少。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种编码细胞壁木聚糖-阿拉伯糖基转移酶taxat基因属于糖基转移酶家族61,其参与木聚糖的阿拉伯糖修饰反应而影响细胞壁的成分及其含量，在细胞壁防御禾谷镰刀菌的过程中提高植物赤霉病抗性，本发明是这样实现的：

一种提高植物赤霉病抗性的小麦基因，其核苷酸序列如seqidn0.1所示。

一种由seqidn0.1所示基因编码的蛋白质，其氨基酸序列如seqidn0.2所示，即seqidno.1序列中264位到1844位基因编码的序列。

一种含有seqidn0.1所示基因的植物表达载体pcambia2301-camv35s-taxat。

如seqidn0.1所示提高植物赤霉病抗性的小麦基因在增强植物赤霉病抗性中的应用，其具体为，将seqidn0.1所示提高植物赤霉病抗性的小麦基因通过表达载体转入目的植物内，以提高植物的赤霉病抗病性。

本发明提供的提高植物赤霉病抗性的小麦基因taxat在增强植物赤霉病抗性中具有重要的应用价值，可以通过酶切连接方法将如seqidn0.1所示的基因编码区序列连接到植物表达载体上，用农杆菌介导的转化方法导入拟南芥、小麦、玉米或其他植物细胞，可获得表达所述基因的转基因抗病材料，从而应用于生产。本发明所述的基因构建到植物转化载体上，可以对所述基因或其调控序列适当修饰，也可以用其它启动子取代所述基因原有的启动子，从而拓宽抗病谱或增强对病原菌的抗性。

本发明的有益效果：将克隆的抗病基因转入感病的植物中，有助于获得新的抗病植物。克隆的抗病基因能在不同的物种间转移并利用，从而能够克服传统抗病育种中远缘杂交的困难。此外，可以用杂交和转化方法在植物中累加多个抗病基因，而不会产生传统育种技术中伴随出现的基因组中连锁累赘问题，并且可以缩短育种时间，提高品种选育效率。

附图说明

图1为利用race技术扩增taxat基因的5’和3’片段的检测电泳图，泳道1和2分别为taxat基因的5’和3’片段。

图2为植物表达载体pcambia2301-camv35s-taxat构建的检测电泳图；

其中，图2a为重组质粒pcr检测的电泳图，泳道1为重组质粒的pcr检测电泳图，泳道2为未重组质粒的pcr检测电泳图；

图2b为重组质粒pcambia2301-camv35s-taxat的酶切鉴定电泳图，泳道1为重组质粒的酶切后电泳图，泳道2为重组质粒的未酶切的电泳图。

图3为转基因植株的taxat基因的pcr鉴定电泳图。

其中，泳道1-3为转基因组植株叶片的pcr扩增产物，泳道4为对照野生组植株叶片的pcr产物，泳道5为重组质粒pcambia2301-camv35s-taxat的pcr产物，泳道6为双蒸水的pcr产物。

图4为三株转基因株系表达结果示意图；

图5为转基因植株花序对病原菌的抗性鉴定结果示意图；

其中，图5a为转基因植株花序对病原菌的抗性鉴定图；

图5b为对照野生型植株花序对病原菌的抗性鉴定图。

图6为转基因植株角果对病原菌的抗性鉴定结果示意图；

其中，图6a为转基因植株角果对病原菌的抗性鉴定图；

图6b为对照野生型植株角果对病原菌的抗性鉴定图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例涉及的核苷酸、氨基酸序列如序列表seqidno.1-seqidno.10所示。

实施例涉及的材料来源：

苏麦3号：由江苏省农业科学院农业生物技术研究所小麦研究室保藏；

拟南芥植物：由江苏省农业科学院农业生物技术研究所小麦研究室保藏；

赤霉菌：由江苏省农业科学院农业生物技术研究所小麦研究室保藏；

pt19-t载体：购自宝生物工程(大连)有限公司

pcambia2301-camv35s：由江苏省农业科学院农业生物技术研究所小麦研究室保藏；

实施例1taxat基因的获得及分析

根据所得目的基因的est序列，使用primerpremier5.0设计用于5’和3’race巢式扩增的引物：5’-primer（其序列如seqidno.3所示）和3’-prime（其序列如seqidno.4所示）；

以接种赤霉菌处理8小时的苏麦3号穗部cdna为模板，利用cdnaamplification试剂盒分别进行3’和5’race扩增：

pcr反应体系：2×seqampbuffer25.0μl，seqampdnapolymerase1.0μl，cdna模板2.5μl，10×universalprimeramix5μl，5’或3’-primer(10μm)1μl,ddh2o15.5μl。

pcr反应程序：94˚c3分钟；94˚c30秒，55˚c30秒，72˚c2分钟延伸，30个循环；72˚c延伸5分钟；

将pcr产物于1%琼脂糖胶进行凝胶电泳，电泳结果如图1所示，图1中，泳道1和2分别为taxat基因的5’和3’片段，m为dnamarker。

对目的条带进行切胶回收，克隆至pt19-t载体中，送南京金斯瑞生物科技有限公司测序。经过序列拼接得到完整的基因，申请人自命名为taxat，其核苷酸序列如seqidno.1所示，基因序列全长为2030bp。

用软件orffinder（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）预测完整开放阅读框，全长为1581bp（即seqidno.1序列中264位到1844位的序列），其编码的氨基酸序列如seqidno.2所示。

实施例2植物表达载体的构建

以苏麦3号穗部cdna为模板，利用引物taxatfxba（seqidno.5所示）和taxatrsac（seqidno.6所示）扩增taxat完整的开放阅读框，并引入限制性酶切位点xbai和saci，回收目的片段。

pcr反应体系：10×exbuffer5µl，mgcl2(25mm)4µl,dntp（2.5mm）1.6µl，taxatfxba引物（10um）1µl，taxatrsac引物（10um）1µl，extaq0.25µl，ddh2o13.7µl。

pcr反应程序：94˚c3分钟；94˚c15秒，55˚c30秒，72˚c2分钟延伸，30个循环；72˚c延伸5分钟；

使用限制性内切酶xbai和saci分别对pcambia2301-camv35s和目的基因片段进行酶切，37℃酶切15min，再次回收。

酶切体系：目的片段200ng或载体1000ng,10×buffer2μl,xbai1μl,saci1μl,ddh2o补充至20μl；

用连接酶solutioni连接回收片段：

连接体系：solutioni5μl，pcambia2301酶切后产物1μl，目的基因酶切后产物4μl。

连接产物后转化大肠杆菌感受态细胞，在37˚c培养箱中，平板正向放置至液体完全被固体培养基吸收，然后避光倒置，37˚c培养12~14h。

通过电泳鉴定重组质粒，电泳结果如图2a所示，其中泳道1为重组质粒的pcr检测电泳图，泳道2为未重组质粒的pcr检测电泳图。

采用基因特异性引物taxatfxba和taxatrsac对重组转化子进行菌液pcr筛选。

pcr反应体系：10×buffer（含mg²⁺）2.0µl，dntp（2.5mm）1.6µl，菌液2.0µl（od600在0.4-0.6之间），引物taxatfxba（10um）0.1µl，引物taxatrsac（10um）0.1µl，rtaq，0.5µl，ddh2o补足至20µl。

pcr反应条件为：94˚c5分钟；94˚c30秒，55˚c30秒，72˚c2分钟，30个循环；72˚c延伸5分钟。

扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶成像系统记录结果。

阳性重组质粒按照质粒小提试剂盒提取质粒，使用限制性内切酶xbai和saci酶切鉴定重组子pcambia2301-camv35s-taxat，如图2b所示，图2b为重组质粒pcambia2301-camv35s-taxat的酶切鉴定电泳图，其中，泳道1为重组质粒的酶切后电泳图，泳道2为重组质粒的未酶切的电泳图。

以上结果表明植物表达载体pcambia2301-camv35s-taxat构建成功，可以应用于植物遗传转化。

实施例3拟南芥遗传转化及基因功能验证

实验分为转基因组与对照野生组：

转基因组：采用浸花法进行拟南芥的遗传转化（参见cloughsj,bentaf(1998)floraldip:asimplifiedmethodforagrobacterium-mediatedtransformationofarabidopsisthaliana.plantj16:735–743.），将实施例2获得的植物表达载体pcambia2301-camv35s-taxat转入拟南芥植物内，经过含卡那霉素(终浓度50mg/l)的ms培养基筛选后，将长出真叶并呈绿色的拟南芥植株移栽到土质基质上，置于培养箱中正常培养6-8周。培养条件为：相对湿度80%，恒温20-24℃，光照强度80-200umol/m²/s，光照周期为8h黑暗﹑16h光照培养。

对照野生组：野生型种子在无抗生素平板萌发，长出真叶后移栽到土质基质上，置于培养箱中正常培养6-8周，培养条件与转基因组一致。

1、植株叶片验证

采集叶片，提取基因组dna，使用基因特异性引物taxatfxba（seqidno.5）和taxatrsac（seqidno.6）进行pcr验证，

pcr反应体系：10×buffer（含mg²⁺）2.0µl，dntp（2.5mm）1.6µl，菌液2.0µl（od600在0.4-0.6之间），taxatfxba（10um）0.1µl，taxatrsac（10um）0.1µl，rtaq0.5µl，ddh2o补足至20µl；

pcr反应条件为：94˚c5分钟；94˚c30秒，55˚c30秒，72˚c2分钟，30个循环；72˚c延伸5分钟。

电泳结果如图3所示，泳道1-3为转化植株的pcr扩增产物，泳道4为对照野生组的pcr产物，泳道5为重组质粒pcambia2301-camv35s-taxat的pcr产物，泳道6为双蒸水的pcr产物。

2、转基因表达验证

分别以t1代拟南芥转基因与野生型花序的cdna为模板,利用rochelightcycler96实时荧光定量pcr仪检测目的基因的相对表达量。基因特异性引物为rtf（seqidno.7）和rtr（seqidno.8）,内参基因为tubulin，其扩增引物为tubf（seqidno.9）和tubr（seqidno.10）。

qpcr反应体系为：sybrpremixextaq（2×）10μl，引物1(10μm)0.4μl，引物2(10μm)0.4μl，cdna2.0μl,ddh2o7.2μl。

pcr程序：采用两步法pcr扩增标准程序：95℃30秒；95℃5秒，60℃30秒，共40个循环。每个样品三次重复，反应结束后获得ct值，采用2^-δδct法对目的基因进行相对定量表达分析。

结果如图4所示，图4中，（1）为野生型，（2）-（4）为选取的三株转基因株系表达结果，可见，目的基因在转基因株系体内能稳定表达，表达量比野生型提高9-18倍。

3、种子染病验证

选取t1代拟南芥转基因与野生型种子，播种后移栽到土质基质上，生长至花期且有2-3个角果时即可接种赤霉病菌。

接种方法如下：调整病原菌孢子数浓度为1×10⁵个/l，采用喷雾法对花序进行接种，每株喷洒0.5ml分生孢子液，接种2天后对染病植株进行观察。

角果柱头端2毫米处用无菌剪刀切断，接种孢子液滴5μl在伤口处，接种7天后观察发病情况。接种后用塑料薄膜覆盖保湿，22˚c下黑暗培养2天然后移至25˚c、相对湿度为80%温箱中，光暗比16h:8h培养。

图5为两组植株花序对病原菌的抗性鉴定结果图片，其中，图5a为转基因组植株花序对病原菌的抗性鉴定图，图5b为对照组野生型植株花序对病原菌的抗性鉴定图，由图5可见，对于花序组织，对照组和转基因植株中均能明显看到菌丝在花序组织间扩展，但转基因植株发病程度小于对照组。

图6为两组植株角果对病原菌的抗性鉴定图片，其中，图6a为转基因组植株角果对病原菌的抗性鉴定图，图6b为对照组野生型植株角果对病原菌的抗性鉴定图，由图6可见，枯萎的种子周围都有一定程度的布满菌丝，野生型拟南芥角果整体枯萎呈现褐色，转基因角果呈现褐绿色，说明转基因植株对病原菌的抗性增强。

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<110>江苏省农业科学院

<120>一种提高植物赤霉病抗性的小麦基因及其应用

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