专利名称：与小麦赤霉病抗性主效qtl紧密连锁的分子标记及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及小麦育种和分子生物学领域，尤其是选择利用小麦抗赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记进行辅助育种，以提高小麦抗赤霉病育种的效率。
近几年发展起来的分子标记辅助育种技术，有效地解决了这一问题，通过构建重要抗源的遗传图谱和数量性状位点(Quantitative Trait Loci，QTL)分析，可以找到与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁(或共分离)的分子标记。使用与某一特定抗源抗赤性主效QTL紧密连锁的分子标记，可以对该特定抗源的后代及其衍生品种(系)在苗期进行早世代筛选，淘汰不抗病的植株，节约生产成本，提高育种和选择效率。
通过这一方法，与重要抗源苏麦3号及其衍生品种(系)的赤霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记，已有多篇文章报导，正在用于生产实际。而江苏溧阳望水白(小麦赤霉病研究，陆维忠等主编，科学出版社，北京，2001)为我国特有的地方品种，具有较高和稳定的赤霉病抗性，也是到现在为止发现的对小麦赤霉病抗性最强的小麦品种，目前尚未有与其主效QTL相连锁的分子标记报道。
本发明提供的与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法获得的a)小麦赤霉病抗病品种望水白(♀)和小麦赤霉病感病品种(♂)杂交，得到杂种F1；b)由杂种F1自花授粉获得子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得F7代的重组自交系；c)分离每个重组自交系家系小麦叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物或扩增片断长度多态性标记(AFLP)引物进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记资料；d)基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建小麦遗传连锁图；e)接种赤霉病病原菌，测定重组自交系每个家系的赤霉病抗性，病小穗率10％以下为“抗”，病小穗率10.1-25％为“中抗”，病小穗率25.1％以上为“感”。
f)将重组自交系每个家系的赤霉病抗性与小麦遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点，确定与抗源望水白赤霉病抗性主效QTL连锁的分子标记，最终获得3个与抗源望水白赤霉病抗性主效QTL连锁的分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493，它们的大小分别为171bp、107bp和210bp。
与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记应用包括将分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493用于小麦品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有赤霉病抗性a)以望水白及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上；b)对通过步骤a)获得的小麦单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在与赤霉病主效QTL相连锁的分子标记；如有2-3个分子标记出现，预测该小麦的赤霉病的抗性达到“抗”的水平。
所用望水白衍生品种或品系，是指以望水白为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系。
本发明能克服常规育种中小麦赤霉病抗性鉴定易受环境影响，并且只能在开花期鉴定筛选的缺点，在苗期就可通过检测分子标记对小麦植株的赤霉病抗性进行预测和筛选，淘汰感病植株，减少人力物力的浪费，提高育种效率。
赤霉病抗性接种鉴定分别在温室或田间进行，选取麦穗中部刚开花的小穗，接种禾谷镰刀菌菌株F34的分生孢子悬浮液10微升(50000个孢子/毫升)，弥雾保湿3天，21天后调查病小穗率。
病小穗率＝(发病小穗数/总小穗数)×100％。(2)分子标记分析，遗传图谱构建及QTL分析
选取在两亲本间具有扩增多态性的SSR引物和AFLP引物组合对104个家系根据已有方法(Marion S.Rder Genetics1492007-2023，1998；Guihua Bai，Phytopathology 89343-348，1999)进行分析，分离每个重组自交系家系小麦叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物或扩增片断长度多态性标记(AFLP)引物进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记多态性数据，将获得的多态性数据采用JoinMap3.0软件，LOD值在3.0-7.0进行连锁群分组，Kosambi方法将重组值换算成遗传图距，构建望水白的遗传连锁图谱，综合遗传连锁图数据和抗性鉴定资料，QTL分析采用MapQTL4.0进行，先进行Kruskal-Wallis(K-W)测验，P＜0.005表明该标记与赤霉病抗性紧密连锁，可能存在QTL。然后对可能存在QTL的区间进行区间作图(Interval Mapping)和多QTL作图(MQM Mapping)分析，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点。
Kruskal-Wallis测验表明位于3B染色体短臂的Xgwm161、BARC147和Xgwm493和BARC102a与抗赤性紧密连锁(见附表1)；区间作图分析(IntervalMapping)发现在BARC147和BAR102a之间确有一抗赤QTL位点，其LOD值为2.93，可解释14.5％的抗赤性变异，多QTL作图(MQM Mapping)发现此QTL位点在BARC147与Xgwm493的14.2cM的区间内(见附表2，附
图1)，表明Xgwm161、BARC147和Xgwm493标记与望水白的主效赤霉病抗性QTL相连锁，可用于以望水白为赤霉病抗源的品种或品系的赤霉病抗性预测。附表1Kruskal-Wallis测验结果
K值Kruskal-Wallis测验分析值，值越大表明与赤霉病抗性越相关。P值表示与赤霉病抗性相关的显著程度，P＜0.005表明该标记与赤霉病抗性紧密连锁。附表2望水白/Alondra抗赤QTL分析
LOD＝对数几率值(反映QTL的几率)VE＝％由QTL所造成的表型变化与抗源望水白赤霉病抗性主效QTL连锁的分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493是用小麦叶片分离的DNA采用引物5’GATCGAGTGATGGCAGATGG3’和5’TGTGAATTACTTGGACGTGG3’；5’GCGCCATTTATTCATGTTCCTCAT3’和5’CCGCTTCACATGCAATCCGTTGAT3’；5’TTCCCATAACTAAAACCGCG3’和5’GGAACATCATTTCTGGACTTTG3’进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后获得，它们的大小分别为171bp、107bp和210bp。区施例2与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记在高代遗传群体中验证获得的与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，也在望水白与Alondra杂交的F9后代的部分植株进行了赤霉病抗性预测，先从它们的叶片中分离DNA，然后用SSR标记Xgwm493、BARC147和Xgwm161的引物对这些DNA进行聚合酶链式反应(PCR)，并通过评判图谱来确定是否存在相应的标记，存在2-3个标记，说明该品种或品系赤霉病抗性达到“抗”的水平，不存在则是感病的。然后基于这些判定准则对每个小麦植株的赤霉病抗性进行预测。随后利用接种赤霉病病原菌的方法测定受测样品的赤霉病实际抗性并与预测结果进行对比。结果见附表3，预测结果与实测结果非常吻合。附表3用与望水白主效QTL紧密连锁分子标记预测望水白/Alondra的杂交后代(F9)的赤霉病抗性
+表示有SSR标记(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的条带；-表示没有SSR标记(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的条带。实施例3与望水白抗赤性主效QTL相连锁的分子标记对育种高代材料抗性预测利用筛选到的与望水白赤霉病抗性主效QTL相连锁的分子标记对育种高代材料进行初步试验，以显示该方法在快速评判小麦赤霉病抗性中的实用价值。选取8个以望水白及其衍生品种(系)为亲本的高代育种材料或小麦品种，先从它们的叶片中分离DNA，然后用SSR标记Xgwm493、BARC147和Xgwm161的引物进行分析，并通过评判图谱来确定是否存在相应的标记，存在2-3个标记，说明该品种或品系赤霉病抗性达到“抗”的水平，不存在则是感病的。随后利用接种赤霉病病原菌的方法测定受测样品的赤霉病实际抗性并与预测结果进行对比。
附表4给出的是高代品系或品种的DNA测试的预测结果以及经接种病原菌后的实际检测结果，可以看出，采用与主效QTL紧密连锁的分子标记预测以望水白及其衍生品种(系)为抗源的小麦的赤霉病抗性是非常准确的。附表4用与望水白主效QTL紧密连锁分子标记预测以望水白及其衍生品种(系)为抗源的小麦品系的赤霉病抗性
+表示有SSR标记(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的条带；-表示没有SSR标记(Xgwm493、Xgwm161和BARC147)的条带。
权利要求
1.一种与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，是通过以下方法获得的a)小麦赤霉病抗病品种望水白(♀)和小麦赤霉病感病品种(♂)杂交，得到杂种F1；b)由杂种F1自花授粉获得子代，通过子代单粒传(SSD)方法获得F7代的重组自交系；c)分离每个重组自交系家系小麦叶片的DNA，采用简单重复序列标记(SSR)引物或扩增片断长度多态性标记(AFLP)引物进行PCR扩增，扩增产物在6g/100ml聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，获得分子标记资料；d)基于遗传连锁交换定律，对分子标记分析资料构建小麦遗传连锁图；e)接种赤霉病病原菌，测定重组自交系每个家系的赤霉病抗性，病小穗率10％以下为“抗”，病小穗率10.1-25％为“中抗”，病小穗率25.1％以上为“感”；f)将重组自交系每个家系的赤霉病抗性与小麦遗传连锁图中的分子标记进行连锁和QTL分析，以2.5为LOD阈值，大于2.5说明存在一个QTL位点，确定与抗源望水白赤霉病抗性主效QTL连锁的分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493。
2.根据权利要求1所述的与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记，其特征在于，用小麦叶片分离的DNA，采用引物5’GATCGAGTGATGGCAGATGG3’和5’TGTGAATTACTTGGACGTGG3’；5’GCGCCATTTATTCATGTTCCTCAT3’和5’CCGCTTCACATGCAATCCGTTGAT3’；5’TTCCCATAACTAAAACCGCG3’和5’GGAACATCATTTCTGGACTTTG3’进行PCR扩增，扩增产物在6％(100ml聚丙烯酰胺胶溶液中含有5.7克丙烯酰胺和0.3克甲叉双丙烯酰胺)聚丙烯酰胺凝胶上电泳分离后，分别获得分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493它们的大小分别为171bp、107bp和210bp。
3.一种如权利要求1或2所述的分子标记的应用，其特征在于a)以望水白及其衍生品种或品系为父本或母本与其他小麦杂交并繁衍至F2代以上；b)对通过步骤a)获得的小麦单个植株，分离叶片DNA，检测分离的DNA中是否存在与赤霉病主效QTL相连锁的分子标记；如有2-3个分子标记出现，预测该小麦的赤霉病的抗性达到“抗”的水平。
4.根据权利要求3所述的分子标记的应用，其特征在于将分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493用于小麦品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有赤霉病抗性。
5.根据权利要求3或4所述的分子标记的应用，其特征在于所用望水白衍生品种或品系，是指以望水白为亲本，通过常规杂交、或采用组织培养、或采用花药培养、或采用玉米与小麦杂交诱导单倍体，再用秋水仙素加倍获得双单倍体或采用遗传转化方法获得的小麦品种或品系。
全文摘要
本发明与小麦赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记及其应用，属于小麦育种和分子生物学领域。对抗病品种望水白(♀)和感病品种(♂)杂交获得的重组自交系的每个家系的基因型和每个家系的赤霉病抗性表型数据进行QTL和遗传连锁分析，获得与望水白赤霉病抗性主效QTL紧密连锁的分子标记Xgwm161、BARC147和Xgwm493。通过检测望水白及其衍生品种(系)的DNA中是否有分子标记，可预测其赤霉病抗性水平，从而可加快抗赤霉病小麦的选择进度。
文档编号C12P19/00GK1442039SQ03112778
公开日2003年9月17日 申请日期2003年1月28日 优先权日2003年1月28日
发明者周淼平, 陆维忠, 张旭, 任丽娟, 马鸿翔 申请人:江苏省农业科学院