专利名称：一种β－琼胶酶基因agaB及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种β-琼胶酶基因agaB，特别涉及一种来源于假别单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)CY24的β-琼胶酶基因agaB及其克隆、表达、表达产物的制备与应用。
一种β-琼胶酶基因agaB，其特征在于它是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因agaB。
一种β-琼胶酶基因agaB的制备方法，其特征在于以鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因agaB。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌克隆载体pBS-agaB。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌重组株DH5α-pBS-agaB。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌表达载体pET24-agaB。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24-agaB。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于制备重组β-琼胶酶。
将本发明的β-琼胶酶基因agaB用于降解琼胶制备琼胶寡糖。
本发明的β-琼胶酶基因agaB编码的β-琼胶酶能够特异性地降解琼胶产生聚合度为8-14的新琼寡糖，每种主要新琼寡糖在降解产物中的含量大于20％，因此为聚合度是八、十、十二及十四的新琼寡糖的大量制备提供了一种有力的工具，而且弥补了以往β-琼胶酶降解终产物聚合度低(一般为2-6糖)的缺点。本发明的大肠杆菌重组株BL21-pET24-agaB所表达的重组β-琼胶酶占总蛋白的25％，表达水平高，易于纯化，所以通过本发明可以大量生产重组β-琼胶酶，成本较低。
及
具体实施例方式
附图1为β-琼胶酶agaB基因的核苷酸序列。
附图2为根据β-琼胶酶agaB基因的核苷酸序列推测的氨基酸序列。
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。实施例1β-琼胶酶基因agaB的制备采用鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶基因agaB，具体操作是从本实验室已经构建的假别单胞菌基因组文库中利用琼胶为唯一碳源的平板筛选出有降解琼胶活性的克隆并测序。利用生物学软件Primer5.0分析读码框架和合适的酶切位点，将读码框架分别进行酶切亚克隆进一步用琼胶平板筛选有活性的目的克隆。根据测序结果设计上游引物(5’-CATATGTTAAAGCGCCACCAAGC-3’)和下游引物(5’-CTCGAGTTGGCAAGTATAACCT-3’)，以基因组DNA为模板，进行PCR反应，PCR反应组成如下(10μl反应体系)0.8μl dNTP、1μl 10×PCR缓冲液、0.05μl(5U/μl)Taq酶、1μl DNA模板、各0.1μl的上游和下游引物。反应条件为94℃预变性2min，然后94℃ 30s、56.7℃30s、72℃90s，共30个循环，反应结束时72℃继续延伸15min，然后将PCR产物回收得到β-琼胶酶基因agaB，其具体核苷酸序列见附图1。实施例2大肠杆菌克隆载体pBS-agaB的构建β-琼胶酶agaB基因与载体pBS-T的连接，20μl反应体系pBS-T 0.5μl，实施例1得到的PCR产物10μl，T4DNA连接酶1.0μl，10×T4DNA连接酶缓冲液2.0μl，ddH2O 6.5μl 16℃连接过夜所得到连接液即可获得大肠杆菌克隆载体pBS-agaB，用于转化大肠杆菌DH5α。实施例3大肠杆菌重组株DH5α-pBS-agaB的构建加入100μl解冻的感受态E.coli DH5α和10μl实施例2得到的连接液至1.5mlEppendorf管中，冰浴30min，42℃ 90s，冰浴3min，加入LB培养基900μl，37℃振荡培养1小时。菌液与4μl IPTG及40μl X-gal混合后涂布于含有50μg/ml氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取白色单菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.4kb特异带者为阳性转化菌落，即含有pBS-agaB的大肠杆菌DH5α-pBS-agaB。利用碱裂解法从DH5α-pBS-agaB中提取质粒，以pBluescript II KS(+)的测序通用引物测定外源插入序列agaB的核苷酸序列。实施例4大肠杆菌表达载体pET24-agaB的构建克隆载体pBS-agaB和表达载体PET-24a分别用NdeI和XhoI酶切，酶切条件如下反应体系1ddH2O 67μl、10×H Buffer 10μl、pBS-agaB质粒DNA20μl、NdeI 1.5μl、XhoI 1.5μl反应体系2ddH2O 66μl、10×H Buffer 10μl、PET-24a质粒DNA 20μl、NdeI 2μl、XhoI 2μl37℃下酶切3小时，电泳后分别回收两个目的片段1.4kb和5.3kb，二者分别与β-琼胶酶agaB基因全长片段与表达载体pET-24a(+)片段大小相同，用T4DNA连接酶连接，连接条件如下ddH2O 11μl、10×T4DNA连接酶缓冲液2.0μl、5.3kb片段4μl、1.4kb片段2μl、T4DNA连接酶1.0μl，16℃连接过夜即可获得大肠杆菌表达载体pET24-agaB，用于转化大肠杆菌BL21(DE3)。实施例5大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24-agaB的构建加入100μl解冻的感受态BL21(DE3)和10μl实施例4得到的连接液至1.5mlEppendorf管中，冰浴30min，42℃90s，冰浴3min，加入LB培养基900μl，37℃振荡培养1小时，将菌液涂布于含有30μg/ml卡那霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取白色单菌落做PCR检测，琼脂糖凝胶电泳中呈现1.4kb特异带者为阳性转化菌落，即含有pET24-agaB的大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24-agaB。实施例6重组β-琼胶酶的制备挑取大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24-agaB单克隆于含有浓度为30μg/ml卡那霉素LB的液体培养基中，37℃振荡培养过夜。按1∶50接种至1L含有浓度为30μg/ml卡那霉素的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养至OD600为0.6，加入终浓度为1m M IPTG和0.01％(重量比)脱氧胆酸钠，25℃诱导表达5h。诱导菌液4℃10000g离心10min，收集上清液，上清液先后经过超滤和包埋进行浓缩，浓缩液上至用结合缓冲液(Native Binding Buffer pH7.8)平衡好的PreBondTMResin column(Invitrogen)，依次用结合缓冲液和pH值分别为6.0和5.5的洗涤缓冲液(Native Wash Buffer)洗涤亲和柱至洗出液OD280＜0.01，最后用pH为4.0的洗脱液(Native Elution Buffer)洗脱亲和柱，收集洗脱液。SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的带的洗脱液即可得到重组β-琼胶酶，其推测氨基酸序列见附图2。用Lowry法测定目的蛋白浓度，分装后将蛋白冻存于-80℃以备用。实施例7表达产物用于制备新琼寡糖制备新琼寡糖时，将琼脂糖溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，配成重量百分比浓度为0.1％～1.0％的溶液，按重量比0.1-1∶100加入实施例6中所得的重组β-琼胶酶，混合均匀后，30℃温浴5-24h，80-90％为聚合度为8-14的新琼寡糖。
权利要求
1.一种β-琼胶酶基因agaB，其特征在于它是编码假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因。
2.一种β-琼胶酶基因agaB的制备方法，其特征在于以鸟枪法克隆假别单胞菌CY24的β-琼胶酶的基因agaB。
3.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌克隆载体pBS-agaB。
4.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌重组株DH5α-pBS-agaB。
5.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌表达载体pET24-agaB。
6.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于制备大肠杆菌重组株BL21(DE3)-pET24-agaB。
7.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于制备重组β-琼胶酶。
8.将权利要求1所述的β-琼胶酶基因agaB用于降解琼胶制备琼胶寡糖。
全文摘要
一种β－琼胶酶基因agaB，其特征在于它是编码假别单胞菌CY24的β－琼胶酶的基因。本发明的β－琼胶酶基因agaB编码的β－琼胶酶能够特异性地降解琼胶产生聚合度为8－14的新琼寡糖，每种主要新琼寡糖在降解产物中的含量大于20％，因此为聚合度是八、十、十二及十四的新琼寡糖的大量制备提供了一种有力的工具，而且弥补了以往β－琼胶酶降解终产物聚合度低(一般为2－6糖)的缺点。本发明的大肠杆菌重组株BL21－pET24－agaB所表达的重组β－琼胶酶占总蛋白的25％，表达水平高，易于纯化，所以通过本发明可以大量生产重组β－琼胶酶，成本较低。
文档编号C12N9/00GK1460717SQ03112518
公开日2003年12月10日 申请日期2003年6月6日 优先权日2003年6月6日
发明者于文功, 马翠萍, 路新枝, 韩峰, 褚艳, 石超 申请人:中国海洋大学