专利名称：一种褐藻胶裂合酶基因及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种来源于海洋弧菌QY101的褐藻胶裂合酶基因。本发明还公开了含有该基因的载体和大肠杆菌菌株及其表达产物的生产和应用。
背景技术：
褐藻胶是由β-D-甘露糖醛酸(M)和α-L-古罗糖醛酸(G)通过β-1，4糖苷键连接形成的线形阴离子多糖。两种糖醛酸可以是均一或交替排列的，从而形成均聚甘露糖醛酸段(polyM)、均聚古罗糖醛酸段(polyG)和MG交替嵌段。褐藻和某些细菌均能产生褐藻胶，其中来源于褐藻的褐藻胶已广泛应用于食品、医药、纺织、石油等工业。近来的研究表明，褐藻寡糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老等多种生物活性，因此逐渐引起人们的注意。目前褐藻寡糖的制备多采用酸水解法，该方法难以控制降解程度，产物不均一，且对设备要求高，对环境污染严重。近来人们尝试用褐藻胶裂合酶降解褐藻胶生产寡糖，该方法易于控制，产物特异性高，且不污染环境。另外，褐藻胶裂合酶与抗生素合用可以有效治疗肺囊性纤维化。因此对褐藻胶裂合酶的需求越来越大。但现有的褐藻胶裂合酶生产菌株均存在酶产量低、难以分离纯化的困难，导致生产成本居高不下，因此严重阻碍了褐藻寡糖的开发与应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻胶裂合酶基因alyVI及其制备方法和应用，它能弥补现有技术的上述不足。
一种褐藻胶裂合酶基因alyVI，其特征在于它是编码弧菌(Vibriosp.)QY101的褐藻胶裂合酶的基因。
一种褐藻胶裂合酶基因alyVI的制备方法，其特征在于以弧菌(Vibrio sp.)QY101的总DNA为模板，经简并PCR和反向PCR的方法得到褐藻胶裂合酶基因alyVI的全序列，再通过PCR的方法得到该褐藻胶裂合酶基因alyVI。
将本发明的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备大肠杆菌表达载体pET24-alyVI。
将本发明的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI。
将本发明的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备重组褐藻胶裂合酶。
将本发明的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于降解褐藻胶制备褐藻寡糖。
本发明的褐藻胶裂合酶基因alyVI是编码弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻胶裂合酶的基因，用其生产的重组褐藻胶裂合酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解褐藻胶、聚甘露糖醛酸段和聚古罗糖醛酸段，降解产物主要为聚合度4-16的褐藻寡糖，因此可以用于褐藻寡糖的制备。本发明的大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI所表达的重组褐藻胶裂合酶占总蛋白的35％，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组褐藻胶裂合酶，成本较低。
附图1为褐藻胶裂合酶基因aly的核苷酸序列附图2为根据褐藻胶裂合酶基因aly的核苷酸序列推测的氨基酸序列具体实施方式
以下实施例将有助于本领域的普通技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。
实施例1 褐藻胶裂合酶基因alyVI的克隆及大肠杆菌表达载体pET24-alyVI的构建在含3％(重量百分浓度)NaCl的Luria-Bertani(LB)培养基中培养弧菌QY101至对数末期，提取细菌总DNA。通过对已知褐藻胶裂合酶氨基酸序列的分析表明，褐藻胶裂合酶的N端和C端分别有一段保守区域。根据这两段保守区域设计两条简并引物Paly1(5′-CGBTCDGARCTBCGBGMRATG-3′)和Paly2(5′-RTARTTRCCBGCYTTRAARTA-3′)，以弧菌QY101的总DNA为模板，利用PCR扩增得到褐藻胶裂合酶部分基因片段。该PCR的条件为94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、56℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖电泳显示，0.51kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下回收后克隆、测序并进行分析。
根据已获得的褐藻胶裂合酶基因部分序列设计反向引物Paly3(5’-TATTTTCACCATCCCACTGC-3’)和Paly4(5’-AGCCATTCAGTGTCAACCTA-3’)。将弧菌QY101的总DNA用Bgl II完全酶切后进行自连接，以所得的连接产物作为模板进行反向PCR扩增，得到褐藻胶裂合酶基因已知序列两侧未知序列。PCR条件为94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、58℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖电泳显示4.5kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下回收后克隆、测序并进行分析，从而得到褐藻胶裂合酶基因aly全序列(附图1)。其中编码区为197-1211bp，编码一个338个氨基酸的蛋白质(附图2)。
根据褐藻胶裂合酶基因aly全序列设计引物Paly7(5’-GGAATTCCATATGAAAACCTCATGGTTTATC-3’)和Paly8(5’-CCGCTCGAGTCTATGATCAATATTGATCTTC-3’)，以弧菌QY101的总DNA为模板，利用PCR扩增得到褐藻胶裂合酶基因全序列。该PCR的条件为94℃预变性3min，随后以94℃ 30s、60℃ 30s、72℃ 60s进行30个循环，最后在72℃延伸10min。琼脂糖电泳显示1.0kb处有一特异条带，将其从琼脂糖凝胶上切下回收后，用NdeI和XhoI酶切，再经琼脂糖电泳分离，回收1.0kb的DNA片段。将大肠杆菌表达载体pET-24a(+)同样用NdeI和XhoI酶切，琼脂糖电泳分离，回收5.3kb的DNA片段，将其与上述所得1.0kb的DNA片段连接后，按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌E.coli DH5α中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NdeI和XhoI酶切得到1.0kb和5.3kb两个片段，分别与褐藻胶裂合酶基因aly全长片段与表达载体pET-24a(+)大小相同，证明褐藻胶裂合酶全长序列已克隆到表达载体pET-24a(+)中，将此重组质粒命名为pET24-alyVI。
实施例2 能高效表达褐藻胶裂合酶的大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI的构建将实施例1中所得的表达载体pET24-alyVI按照标准的氯化钙法转入大肠杆菌BL21(DE3)中，筛选具有氨苄青霉素抗性的转化子。用标准的碱裂解法提取质粒，经NdeI和XhoI酶切得到1.0kb和5.3kb两个片段，分别与褐藻胶裂合酶基因aly全长片段与表达载体pET-24a(+)大小相同，证明获得了能高效表达褐藻胶裂合酶的大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI。
实施例3 利用大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI生产重组褐藻胶裂合酶将实施例2中所得的大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI的单克隆接种在3ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃200r/min振荡培养过夜。按1∶50接种至100ml含有50μg/ml氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃ 200r/min振荡培养至OD600为0.5，加入IPTG至终浓度1mM，继续培养3h，4℃ 5000×g离心30min收集菌体，重悬于结合缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH7.8/0.5M NaCl)，加入溶菌酶至终浓度0.5mg/ml，室温作用30min。将菌悬液于冰上超声破碎细胞30min，每作用10s暂停10s。4℃ 12000×g离心30min去除细胞碎片，上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，滤出液上至用结合缓冲液平衡好的PreBondTMcolumn(Invitrogen)。依次用结合缓冲液和冲洗缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH6.0/0.5M NaCl)冲洗柱子至洗出液OD280＜0.01，最后依次用5ml含不同浓度咪唑的洗脱缓冲液(20mM磷酸盐缓冲液，pH6.0/0.5M NaCl)(咪唑浓度依次为50mM、200mM、350mM、500mM)洗涤柱子，收集洗脱液。SDS-PAGE检测洗脱液中蛋白分布，合并含单一目的条带洗脱液，对20mM磷酸盐缓冲液(pH7.8)透析除去咪唑，用Lowry法测定目的蛋白浓度，分装后冻存于-80℃。
实施例4 利用重组褐藻胶裂合酶制备褐藻寡糖重组褐藻胶裂合酶能降解袂藻胶、聚甘露糖醛酸段、聚古罗糖醛酸段。制备褐藻寡糖时，将褐藻胶(平均分子量20KDa)溶于0.1M磷酸盐缓冲液(pH7.5)，配成重量百分比浓度为0.1％～1.0％的溶液，按重量比0.1-1∶100加入实施例3中所得的重组褐藻胶裂合酶，混合均匀后在30℃温浴1～24h，60％-80％的产物为聚合度4-16的褐藻寡糖。
权利要求
1.一种褐藻胶裂合酶基因alyVI，其特征在于它是编码弧菌(Vibriosp.)QY101褐藻胶裂合酶的基因。
2.一种褐藻胶裂合酶基因alyVI的制备方法，其特征在于以弧菌(Vibrio sp.)QY101的总DNA为模板，经简并PCR和反向PCR的方法得到褐藻胶裂合酶基因alyVI的全序列，再通过PCR的方法得到该褐藻胶裂合酶基因alyVI。
3.将权利要求1所述的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备大肠杆菌表达载体pET24-alyVI。
4.将权利要求1所述的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备大肠杆菌重组株BL21-pET24-alyVI。
5.将权利要求1所述的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于制备重组褐藻胶裂合酶。
6.将权利要求1所述的褐藻胶裂合酶基因alyVI用于降解褐藻胶制备褐藻寡糖。
全文摘要
一种褐藻胶裂合酶基因alyVI，其特征在于它是编码弧菌(Vibrio sp.)QY101褐藻胶裂合酶的基因。用其生产的重组褐藻胶裂合酶温度和pH稳定性好，活性高，能降解褐藻胶、聚甘露糖醛酸段和聚古罗糖醛酸段，降解产物主要为聚合度4－16的褐藻寡糖，因此可以用于褐藻寡糖的制备。本发明的大肠杆菌重组株BL21－pET24－alyVI所表达的重组褐藻胶裂合酶占总蛋白的35％，表达水平高，易于纯化，且连续传代20代后表达量未有降低，所以通过本发明可以大量生产重组褐藻胶裂合酶，成本较低。
文档编号C12P19/34GK1513998SQ0311241
公开日2004年7月21日 申请日期2003年5月29日 优先权日2003年5月29日
发明者于文功, 韩峰, 宫倩红, 路新枝, 李京宝 申请人:中国海洋大学