专利名称：一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组dna的试剂盒及方法
技术领域：
本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种利用磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒及其提取方法。
背景技术：
核酸的分子生物学技术是进行病原微生物检测，转基因检测，物种鉴定，物种起源、多样性评估及其亲缘关系、系统进化等常用研究手段之一。纯化的DNA是用来进行PCR检测最基本材料，尽管在不同样品(原材料、食品成分、加工产品)中，DNA是一个相对稳定的分子，但是对于深加工产品来说，DNA提取技术仍然是基于DNA扩增的检测技术的瓶颈，能否提取出高质量的DNA分子是判断随后采用的分析技术是否合理的关键，提取方法的灵敏度、特异性也将直接关系到后续试验的成败。对于一般的分析来说，好的制备技术应 该是简便、安全、廉价，并且能保证DNA质量和数量。用于检测分析的DNA应具备一定的浓度、纯度、完整性。材料和提取技术都可能对这些参数受到影响，反过来，这些参数也可能影响分析技术是否合理。传统的核酸分离方法主要有CTAB法、SDS法、PVP法和和硅胶吸附，提取的步骤主要包含细胞裂解、有机溶剂萃取、沉淀，高速离心等过程，裂解步骤中，蛋白质和多糖结合CTAB和/或PVP从溶解DNA的液相中分离出来，硅胶吸附也可用来协助DNA的提取和纯化，裂解后，用酚和/或氯仿去除液相中的有活性的核酸酶和PCR抑制因子，如亲脂类分子、多糖、蛋白质。DNA结合盐酸胍一氢氧化物离液剂中的硅胶颗粒而沉淀，沉淀用异丙醇洗涤。最后，沉淀用低浓度盐溶液溶解。相关试剂盒包括Wizard试剂盒(Promega Corp. , Madison,WI)、Dneasy (Qiagen, Crawley, UK)等。这些纯化方法的步骤繁杂、费时长、回收率低,且提取过程中使用酚、氯仿、异丙醇等有毒有害物质，影响人体健康。磁株分离纯化技术是一种简单有效的核酸提纯方法，主要在磁珠上连接能特异性吸附核酸的功能基团，在样本的裂解溶液中特异性地吸附目标核酸，随后通过磁分离技术将核酸从裂解溶液中提取出来。磁珠法能够很好地克服传统核酸方法的缺点，具简便、快捷、高效等特点，符合核酸自动化提取要求，因此，该方法已广泛应用于细菌、动物血液、唾液等组织的DNA的提取中，也相应出现了各种各样的试剂盒。但是，与动物细胞相比，植物细胞除了有细胞壁外，还含有大量的多糖、脂质、色素和酚类物质，利用现有的磁珠法提取DNA试剂盒对植物组织的基因组DNA进行提取，所得产物的回收率和纯度都比较低，尤其是对于深加工后的植物产品，由于其经过高温处理后，基因组DNA的断裂降解程度高，利用现有的磁珠法提取DNA试剂盒对其基因组DNA进行提取，产物回收率和纯度都极低，不能满足进一步实验的需求。
发明内容
针对现有技术所存在的不足，本发明的一个目的是提供一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒。本发明的另一个目的是提供一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的方法。本发明所采用的技术方案是
一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中，
A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化钠，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ; B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化钠，pH =7. 5 8. 5 ;
磁珠悬液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的体积比组成。优选的，所述A 液含有 3 wt %CTAB,1. 4mol/L 氯化钠，20mmol/L EDTA，100 mmol/LTris-HCL, 20 mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH =8.0。优选的，所述B 液含有 O. 5 Wt %CTAB，O. 04mol/L 氯化钠，pH =8. O。优选的，所述磁珠的直径为3 7 μ m。一种粮食深加工产品基因组DNA的提取方法，包括如下步骤
1)将预处理后的粮食深加工产品加入到A液中，60 70°C温浴40 80min；
2)取上清液，加入B液和磁珠悬液，混合均匀；
3)将磁珠转移到75%的乙醇溶液中清洗；
4)清洗后的磁珠用TE缓冲液进行洗脱，得到纯化的DNA。样品与A液的质量体积比为Ig :4 6ml。上清液与B液的体积比为1:1 3。上清液与磁珠悬液的体积比为10 20 :1。所述粮食深加工产品包括米制品、饲料、食用油等。本发明的有益效果在于
I)利用本发明试剂盒提取的基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质，使用本试剂提取Ig深加工产品米粉、饲料以及1000 mL花生油，分别纯化得到了约640μ g、520 μ g、和12 μ g的高纯度基因组DNA，纯度Α260/280 =1. 75-2. 06之间。2)本发明的DNA提取方法仅需4个步骤，分别是裂解、沉淀、清洗、洗脱，全自动操作，可以由仪器完成从裂解、纯化、收集产物的全过程，实验过程中完全无需人工干预和检测，且提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。
图1是不同方法提取米粉、饲料基因组DNA的实时荧光PCR检测结果图(1:本发明试剂盒提取米粉DNA，2:本发明试剂盒提取饲料DNA，3:商品试剂盒I提取米粉DNA，4 :商品试剂盒I提取饲料DNA，5 :商品试剂盒2提取米粉DNA，6 :商品试剂盒2提取饲料DNA，7 :商品试剂盒3提取米粉DNA，8 :商品试剂盒3提取饲料DNA)；
图2是花生油提取的基因组DNA荧光PCR扩增结果图。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例1
磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中，
A 液的组成为3wt%CTAB，1. 4mol/L 氯化钠，20mmol/L EDTA，100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL蛋白酶K，2wt%i3-巯基乙醇，pH =8.0，溶剂为水；
B液的组成为0. 5wt%CTAB,O. 04mol/L氯化钠，pH =8. 0，溶剂为水；
TE缓冲液的组成为10mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH=8. 0，溶剂为水；
磁珠缓冲液的组成为磁珠(直径是3 7 μ m) (OMEGA公司)与O. 02wt% NaN3水溶液按1:2的体积比混合。
利用上述试剂盒提取米粉或饲料基因组DNA，包括如下步骤1.取Ig粉碎过的米粉或饲料，加入到5ml A液中，65°C孵化60min。2.常温lOOOOrpm，离心lOmin，直至沉淀完全，吸取上清液备用。3.转移300 μ I上清液,加入到KingFisher mL 5联管第一、二孔,第一孔中加入600 μ I B液和20 μ I磁珠悬液；第二孔中加入600 μ I B液；第三和第四孔加900 μ I的75%乙醇溶液；第五孔加400 μ L TE缓冲液。4.将5联管放入全自动核酸提取仪Thermo Scientific KingFisher mL,转入磁套，运行程序，程序步骤如下
Cl)第一孔涡旋混匀60秒；
(2)吸附磁珠转移至第二孔，涡旋混匀60秒；
(3)吸附磁珠转移至第三孔75%乙醇中，涡旋混匀120秒；
(4)吸附磁珠转移至第四孔75%乙醇中，涡旋混匀120秒；
(5)转移至磁力架上吸附磁珠，室温干燥IOmin；
(6)释放磁珠至第五孔TE缓冲液中，涡旋重悬磁珠。5.吸取第五孔TE缓冲液，即提取的基因组DNA，置于冰箱中备用；
6.运用微量分光光度仪(Nanodrop-1000)测定DNA的浓度和纯度，以其它3种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，结果如表I所示。7.将提取的基因组DNA进行实时荧光PCR检测，米粉检测水稻内源基因G0S9，饲料检测大豆凝集素基因LECTIN，引物和探针序列见表2，以其它3种常规商品试剂盒的提取结果作为对照，实验结果见图1。实施例2
采用实施例1的试剂盒提取花生油中的基因组DNA，包括如下步骤1.取200 ml样品油，于500 mL烧杯中，加等体积的无菌水，20_25°C于磁力搅拌器上搅拌I小时以上；然后于12000r/min，离心15_20min，小心吸取下层水相；在水相中加入200 ml样品油，重复1-2步骤5次。2.小心将水相转移到培养皿中，将培养皿放于一 80°C冷冻过夜，然后将培养皿转至真空干燥机中至水分完全蒸发；加I mL A液至培养皿中，65°C温浴4小时。3.分别转移300 μ I上清液，加入到KingFisher mL 5联管第一、二孔，第一孔中加入600 μ I B液和20 μ I磁珠悬液；第二孔中加入600 μ I B液；第三和第四孔加900 μ I75%的乙醇溶液；第五孔加50 μ L TE缓冲液。
4.将5联管放入全自动核酸提取仪Thermo Scientific KingFisher mL,转入磁套，运行程序，程序步骤如下
(1)第一孔涡旋混匀60秒；
(2)吸附磁珠转移至第二孔，涡旋混匀60秒；
(3)吸附磁珠转移至第三孔75%乙醇中，涡旋混匀120秒；
(4)吸附磁珠转移至第四孔75%乙醇中，涡旋混匀120秒；
(5)转移至磁力架上吸附磁珠，室温干燥IOmin； (6)释放磁珠至第五孔TE缓冲液中，涡旋重悬磁珠。5.吸取第五孔TE缓冲液，即提取的基因组DNA，置于冰箱中备用。6.运用微量分光光度仪(Nanodrop-1000)测定DNA的浓度和纯度，结果如表2所
/Jn ο7.将提取的基因组DNA进行实时荧光PCR检测花生几丁质酶基因chi2. 2，所用引物为HS-F和HS-R，探针为HS-P (见表2)。以本发明方法提取花生基因组DNA作为阳性对照，去离子水作为阴性对照，每组设两个平行。结果如图2所示。
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III
权利要求
1.一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中， A 液含有 2 4wt%CTAB, I 1. 5mol/L 氯化钠，18 22mmol/L EDTA，80 120 mmol/L Tris-HCL, 10 30 mg/mL 蛋白酶 K, I 3wt%i3 -疏基乙醇，pH =7. 5 8. 5 ;B 液含有 O. 4 O. 6 wt % CTAB, O. 03 O. 05 mol/L 氯化钠，pH =7. 5 8. 5 ; 磁珠悬液由磁珠和O. 01 O. 03wt%的NaN3水溶液按1:1. 5 2. 5的体积比组成。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述A液含有3wt%CTAB，1.4mol/L氯化钠，20mmol/L EDTA, 100 mmol/L Tris-HCL, 20mg/mL 蛋白酶 K, 2 wt %β-疏基乙醇，pH=8. O0
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述B液含有O.5%CTAB，O. 04mol/L氯化钠，pH =8. O。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠的直径为3 7μ m。
5.一种粮食深加工产品基因组DNA的提取方法，包括如下步骤 1)将预处理后的粮食深加工产品加入到权利要求1或2所述的A液中，60 70°C温浴40 80min ； 2)取上清液，加入权利要求1或3所述的B液和权利要求1所述的磁珠悬液，混合均匀； 3)将磁珠转移到75%的乙醇溶液中清洗； 4)清洗后的磁珠用TE缓冲液进行洗脱，得到纯化的DNA。
6.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤I)中，样品与A液的质量体积比为 Ig :4 6ml。
7.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中，上清液与B液的体积比为1:1 3。
8.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，步骤2)中，上清液与磁珠悬液的体积比为10 20 :1。
9.根据权利要求5所述的提取方法，其特征在于，所述粮食深加工产品包括米制品、饲料、食用油等。
全文摘要
本发明公开了一种磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒及提取方法。本发明的磁珠法提取粮食深加工产品基因组DNA的试剂盒，包括A液、B液、磁珠悬液、75%乙醇溶液和TE缓冲液，其中，A液含有2～4wt%CTAB，1～1.5mol/L氯化钠，18～22mmol/LEDTA，80～120mmol/LTris-HCL，10～30mg/mL蛋白酶K，1～3wt%β-巯基乙醇，pH=7.5～8.5；B液含有0.4～0.6wt%CTAB，0.03～0.05mol/L氯化钠，pH=7.5～8.5；磁珠悬液由磁珠和0.01～0.03wt%的NaN3水溶液按11.5～2.5的体积比组成。利用本发明试剂盒提取的基因组DNA回收率高、纯度高、片段完整、无PCR抑制物质。DNA提取过程可由仪器完成从裂解、纯化、收集产物的全过程，提取所使用的试剂高效安全，最大程度避免对人体的伤害。
文档编号C12N15/10GK103013981SQ20121051953
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月5日 优先权日2012年12月5日
发明者张卫东, 廖力, 王岚, 梁玉英, 徐淼锋, 迟远丽 申请人:张卫东