专利名称：一种新的褐藻胶裂合酶及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新的褐藻胶裂合酶及其制备方法和应用。
在一般的褐藻胶裂合酶的制备方法中，经常采用硫酸铵分级沉淀或凝胶色谱等方法，并且最后进行离心冷冻干燥，这些制造方法的缺点是试验步骤复杂，流程长，成本高。另外，在制备该类褐藻胶裂合酶的纯化过程中，原料褐藻胶与产物酶往往结合导致最终产物产率过低，这更是现有的制备方法急待解决的问题。
一种新的褐藻胶裂合酶，其特征是来源于海洋弧菌，分子量为28.5kD，该酶的最适反应温度为40℃，最适pH为7.1。
一种褐藻胶裂合酶的制备方法，包括配制培养基，灭菌后接入弧菌，然后在恒温摇床振荡发酵，其特征是将所得发酵液除菌后用微孔滤膜过滤，对上清液进行压滤浓缩至干，再用疏水层析除去与产品结合的褐藻胶。
用本发明的方法制得的褐藻胶裂合酶将褐藻胶酶解生产褐藻寡糖。
本发明的优点是1.本发明中的褐藻胶裂合酶活力高，生产褐藻寡糖需要的反应条件温和，作用时间短；2.本发明中的褐藻胶裂合酶温度稳定性好，-20℃时保存6个月仍能保证95％的活力，并在pH5-10的条件下均很稳定，适于长时间保藏和运输；3.本发明中的褐藻胶裂合酶具有底物和产物专一性，专一作用于多聚甘露糖醛酸(poly(M))，酶解产物集中在聚合度为3-15的褐藻寡糖；4.本发明中的褐藻胶裂合酶制备方法中培养基配制简单，发酵液中杂蛋白含量少，分离无需其它化学试剂，直接采用微孔滤膜过滤，简单快捷，成本低；5.本发明中的疏水层析有效地除去了产品中多余的褐藻胶，使最终酶产率得以大幅提高。
及
具体实施例方式附图1为本发明的褐藻胶裂合酶的SDS-PAGE图谱；附图2为本发明的褐藻胶裂合酶的相对活性与温度的关系图。
附图3为本发明的褐藻胶裂合酶的相对活性与pH的关系图。
按本发明的方法制备褐藻胶裂合酶时，先配制培养基，灭菌后接入弧菌，然后在恒温摇床振荡发酵，所述的培养基由褐藻酸钠、MgSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4·3H2O、NaCl，它们的重量比例为1∶0.01-0.04∶0.01-0.04∶0.1-0.4∶0.3-1.0∶0.5-2∶1-3。本实施例中各组份的重量仟克数依次为1、0.01、0.01、0.2、0.5、1、3。灭菌温度为115-121℃，时间为15-30min。所述的弧菌为Vibrio sp.QY102，它与培养基按5-10∶100重量比接种量接种，然后在25-37℃下以200r/min发酵培养15-20小时，再将所得发酵液在4℃10000g-12000g，离心10min除菌体。选用孔径为0.22μm或0.45μm的微孔滤膜，在室温或4℃的低温对上清液进行压滤浓缩至干，用1/10体积0.5-1.0mol/L的(NH4)2SO4水溶液溶解，离心除去沉淀后上疏水层析柱，用水洗脱即得褐藻胶裂合酶(凝胶色谱纯)。酶活约2000-3000单位/毫升。
本发明中的褐藻胶裂合酶以十二烷基磺酸钠—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测分子量，结果如图1，纯化后的酶在电泳凝胶上显示为单一条带，其分子量为28.5kD(千道尔顿)。在不同的温度及pH条件下测定其酶活力，结果如附图2和附图3，该褐藻胶裂合酶最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.1。分别用聚甘露糖醛酸(poly(M))和聚古罗糖醛酸(poly(G))为底物检测该褐藻胶裂合酶的活性，表明该酶具有专一作用于多聚甘露糖醛酸(poly(M))的活性。该褐藻胶裂合酶在-20℃下保藏半年，活性保持95％以上。
用本发明中的褐藻胶裂合酶由褐藻胶生产褐藻寡糖时，将褐藻胶(平均分子量20000)配成重量百分比浓度为0.3-1％的水溶液，按重量比1∶100的比例将褐藻胶裂合酶加入褐藻胶水溶液中，在40℃温度下培育6-12小时，60％-80％的产物为聚合度为3-15的褐藻寡糖。其中褐藻胶裂合酶的用量为褐藻胶水溶液的0.1-1∶100(重量比)，酶解温度为35-40℃，酶解反应时间为4-12小时。用本发明中的褐藻胶裂合酶制备褐藻寡糖，反应条件温和，易于控制，产物专一，明显优于化学和物理降解，适合于工业化生产褐藻寡糖。
权利要求
1.一种新的褐藻胶裂合酶，其特征是来源于海洋弧菌，分子量为28.5kD，该酶的最适反应温度为40℃，最适pH为7.1。
2.一种褐藻胶裂合酶的制备方法，包括配制培养基，灭菌后接入弧菌，然后在恒温摇床振荡发酵，其特征是将所得发酵液除菌后用微孔滤膜过滤，对上清液进行压滤浓缩至干，再用疏水层析除去与产品结合的褐藻胶。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的微孔滤膜孔径为0.22μm或0.45μm，所述的对上清液进行压滤浓缩的温度为室温或4℃的低温。
4.如权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的疏水层析柱使用0.5-1.0mol/L(NH4)2SO4水溶解上，并用水洗脱。
5.如权利要求2所述的制备方法，其特征是培养基含有褐藻酸钠、MgSO4、FeSO4、(NH4)2SO4、NaH2PO4、Na2HPO4·3H2O、NaCl，它们的重量比例为1∶0.01-0.04∶0.01-0.04∶0.1-0.4∶0.3-1.0∶0.5-2∶1-3。
6.如权利要求2所述的制备方法，其特征是所述的弧菌为Vibrio sp.QY102，它的接入量与培养基的重量比为1-10∶100。
7.如权利要求2所述的制备方法，其特征是灭菌温度为115-121℃，时间为15-30min。
8.用本发明中的褐藻胶裂合酶将褐藻胶酶解生产褐藻寡糖。
全文摘要
一种褐藻胶裂合酶的制备方法，包括配制培养基，灭菌后接入弧菌，然后在恒温摇床振荡发酵，其特征是将所得发酵液除菌后用微孔滤膜过滤，对上清液进行压滤浓缩至干，再用疏水层析除去与产品结合的褐藻胶。优点是本发明中的褐藻胶裂合酶活力高，用它生产褐藻寡糖需要的反应条件温和，作用时间短；温度稳定性好，并在pH5－10的条件下均很稳定；具有底物和产物专一性，专一作用于多聚甘露糖醛酸制备方法中培养基，配制简单，发酵液中杂蛋白含量少，分离无需其它化学试剂，直接采用微孔滤膜过滤，简单快捷，成本低。
文档编号C12N1/20GK1454992SQ0311227
公开日2003年11月12日 申请日期2003年5月16日 优先权日2003年5月16日
发明者于文功, 李京宝, 韩峰, 路新枝, 宫倩红 申请人:中国海洋大学