专利名称：自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及自主复制型表达载体PEV及其制备方法与应用，特别是一种适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用，属于海洋生物技术技术领域。
背景技术：
在生物技术与生物工程领域中，通过将外源基因克隆于表达载体上，转入到ー个合适的宿主细胞中，来达到表达和制备重组蛋白的目的。将这种表达系统应用到エ业生产中，可以用于大量制备重组蛋白，达到エ业化水平。地球上的低温生境非常广泛，包括深度超过1000米的海洋、极地和许多季节性的寒冷环境等等。这些低温生境中存在大量的微生物，其中大部分为适冷微生物。由于长期生 活在低温环境下，适冷微生物所产生的酶类等蛋白质往往具有适冷特性，即在低温下的高催化效率和高温下的低稳定性。有研究表明，低温环境有利于适冷蛋白的重组表达，可以更有效地得到有活性的适冷蛋白。虽然大肠杆菌表达系统是目前最成熟和常用的表达系统，但大肠杆菌为中温菌，最适生长温度为37°C。在这样高的温度下，适冷酶既不稳定，也难以进行活性表达，往往以包涵体的形式存在。而降低大肠杆菌的培养温度，会降低大肠杆菌的生长速率和表达效率。因此，大肠杆菌表达系统并不是适冷蛋白重组表达的最佳选择。由于适冷细菌能在低温下快速生长，所以建立适冷细菌为宿主的表达系统可以对适冷蛋白进行有效的活性重组表达。近些年，国外虽已有开发出适冷细菌表达系统的报道，但仍然没有商品化的低温表达系统。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供ー种利用适冷假交替单胞菌进行异源蛋白低温表达的方法。名词解释纤维素酶酶活単位(U)定义为35°C下毎分钟释放I U g葡萄糖所需酶量。接合转移频率定义为接合转移后每个受体菌所产生的接合转移子数目。本发明的技术方案如下适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。上述适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV的构建方法，步骤如下I)以质粒pKNGlOl为模板,利用EasyTaq DNA Polymerase进行PCR扩增，经回收，制得质粒pKNGlOl的DNA片段，PCR扩增引物序列如下OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’， SEQ ID NO. 3RK2 :5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’，SEQ ID NO. 42)将步骤I)制得的质粒pKNGlOl的DNA片段和载体pGEM-T Easy的混合液4yl、5 U I连接缓冲液、I U I连接酶混合后，16°C连接过夜，得质粒；3)以质粒pWD为模板，利用Pfu DNA Polymerase进行PCR扩增，PCR扩增引物序列如下ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’， SEQ ID NO. 5CMR :5，-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3，，SEQ ID NO. 6经纯化回收后，用限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理，回收酶切DNA片段，然后插入到同样经限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理后的步骤2)制得的质粒中，制得p0riT-4CM 质粒； 4)人工合成含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag及终止密码子的DNA片段，在片段的两端引入SphI和NotI识别位点；用限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理，经纯化回收后，插入到同样经限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理的步骤3)制得的p0riT-4CM质粒中，制得自主复制型表达载体pEV。所述步骤4)中含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag的DNA片段制备步骤如下选取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密码子前200bp的DNA序列其后紧跟4个限制性内切酶序列，His标签(CACCACCACCACCACCAC)和终止密码子(TAA)，人工合成这段DNA片段并在片段两端引入SphI和NotI识别位点。经检测，自主复制型表达载体pEV大小为7355bp (如SEQ ID NO.1所示)，包含有大肠杆菌复制元件复制起始位点来源于质粒pGEM-T Easy的复制起始位点,接合转移起始序列，来源于质粒pKNGlOl ;选择标记为抗氨卞青霉素基因,来源于质粒pGEM-T Easy和抗氯霉素基因，来源于PWD ;假交替单胞菌复制元件复制起始位点来源于质粒PSM429的复制起始位点，pSM429 (GenBank登录号EU627679)提取于菌株Pseudoalteromonassp.BSi20429，启动子为木聚糖酶启动子，多克隆位点为BglI1、Stu1、Ava1、XhoI。纯化标签为His标签,如附图1所示。上述适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV在表达适冷纤维素酶中的应用。适冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp. )SM20429,购自中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010239。有益效果本发明所述的适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV可用于各种适冷酶和蛋白的异源活性表达。适冷宿主菌菌株SM20429属于假交替单胞菌属，该属细菌是一类好氧、异养型革兰氏阴性细菌，广泛分布于海洋环境中。由于海洋环境中大部分为低温环境，因此目前分离到的假交替单胞菌多数具有适冷特征。适冷宿主菌菌株SM20429为BSi20429的质粒消除菌株，仍具有典型适冷特征，在15°C低温条件下可以快速率生长；自主复制型表达载体PEV含有较强的启动子，能够大量表达外源蛋白。因此，适冷宿主菌菌株SM20429和自主复制型表达载体pEV具有被发展成为大量表达外源蛋白的适冷表达系统的潜在价值，从而达到在低温条件下快速制备适冷蛋白的目的。
图1、构建的自主复制型载体pEV的结构示意图；图2、适冷纤维素酶基因在SM20429中的异源表达后细胞提取液检测酶活照片；其中1、空白对照；2、带有质粒pEV-cen的SM20429菌株；3、不带有质粒pEV-cen的SM20429菌株；图3、适冷纤维素酶基因在SM20429中的异源表达后培养物上清检测酶活照片；其中1、空白对照；2、带有质粒pEV-cen的SM20429菌株；3、不带有质粒pEV-cen的SM20429菌株；图4、利用His-tag纯化的适冷纤维素酶的电泳图； 其中泳道I 3为纯化的胞内表达的纤维素酶；泳道4、5为纯化的分泌到胞外纤
维素酶。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明的技术方案做进ー步阐述，但本发明所保护范围不限于此。生物材料来源质粒pGEM-T Easy购自Promega公司，质粒pKNGlOl和质粒pWD均为本实验室构建保存，纯化试剂盒购自OMEGA公司，限制性内切酶均购自MBI公司，连接缓冲液、连接酶均购自Promega公司。人工合成的DNA片段有上海捷瑞生物工程有限公司合成。适冷宿主菌菌株(Pseudoalteromonas sp. )SM20429,购自中国典型培养物保藏中心，菌种保藏编号为CCTCC M 2010239。培养基海水LB液体培养基，组分如下胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，人工海水1000毫升，pH7. 0-8. 0 ；LB液体培养基，组分如下胰蛋白胨10克，酵母提取物5克，蒸馏水1000毫升，pH7. 0-8. 0 ；Binding buffer,组分如下50Mm Tris-Cl PH 8. 0,200mM NaCl, 5mM 咪唑，1% 甘油，三蒸水定容至 IOOOml ；Washing buffer,组分如下终浓度20Mm的咪唑溶于Binding buffer ；Elution buffer,组分如下终浓度200 u M 咪唑溶于 Binding buffer ；实施例1 :自主复制型表达载体pEV的构建1.说明大小7355bp大肠杆菌复制元件复制起始位点来源于质粒pGEM-T Easy的复制起点。选择标记抗氨卞青霉素基因，来源于质粒pGEM-T Easy ；结合转移起始序列来源于质粒pKNGlOl ；
假交替单胞菌复制元件复制起始位点来源于质粒pSM429的复制起始位点，pSM429 (GenBank登录号EU627679)提取于菌株 Pseudoalteromonas sp. BSi20429。选择标记抗氯霉素基因，克隆于质粒pWD。启动子木聚糖酶启动子，来源于菌株Pseudoalteromonas sp.BSi20429。多克隆位点Bglll、Stu1、Aval、Xhol。如图1 所示。2.构建方法 (i ) PCR扩增质粒pKNGlOl上大小为0. 7kb的DNA片段。以质粒pKNGlOl 为模板，利用引物(OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，RK2 5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3，)，EasyTaq DNA Polymerase PCR 扩增质粒 pKNGlOl 的 DNA片段；PCR产物电泳检测后，用纯化试剂盒(购自OMEGA公司)按说明书纯化回收。(ii) DNA片段和质粒pGEM-T Easy的连接、转化和验证将步骤(i)制得的DNA片段和载体pGEM-T Easy(购自Promega公司)混合液4 ii1、5 U I连接缓冲液(购自Promega公司)、I U I连接酶(购自Promega公司)混合成反应体系，16°C连接过夜，将连接产物转化E. coli DH5a菌株的感受态细胞。将转化的感受态细胞涂布在氨苄青霉素LB平板。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验转化子中含有构建的质粒。(iii)PCR扩增质粒pWD上大小为3. 3kb的DNA片段以质粒pWD 为模板，利用引物(ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3’，CMR :5’ -GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3’)，Pfu DNA Polymerase PCR 扩增质粒 pWD 的 DNA 片段。其中引物的5’端分别加上SpeI和PstI识别位点。PCR产物电泳检测后，用限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理，37°C酶切30min后，用纯化试剂盒(购自OMEGA公司)按说明书纯化回收。(iv)以上两片段的连接、转化和验证将步骤(i i )的质粒用限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理，370C酶切30min后，用纯化试剂盒(购自OMEGA公司)按说明书纯化回收。酶切的质粒与步骤(iii)得到的片段的混合液1>5 u I连接缓冲液(购自Promega公司)、I U I连接酶(购自Promega公司)混合成10 的反应体系，16°C连接过夜，制得p0riT-4CM质粒，将连接产物转化E. coli DH5 a菌株的感受态细胞。将转化的感受态细胞涂布在氨苄青霉素和氯霉素LB平板。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验转化子中含有构建的p0riT-4CM质粒。(V)木聚糖酶启动子,多克隆位点和His-tag的插入选取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密码子前200bp的DNA序列其后紧跟4个限制性内切酶序列，His标签(CACCACCACCACCACCAC)和终止密码子(TAA)并在片段两端引入SphI和NotI识别位点，人工合成这段DNA片段(上海捷瑞)；用限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理，37°C酶切30min后，用纯化试剂盒(购自OMEGA公司)按说明书纯化回收；插入到经同样酶切处理的通过步骤(iv)构建的质粒p0riT-4CM中，构建成自主复制型表达载体pEV。将自主复制型表达载体pEV转化E. coli DH5a菌株的感受态细胞。将转化的感受态细胞涂布在氨苄青霉素和氯霉素LB平板。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验转化子中含有构建的自主复制型表达载体pEV。经测序，上述自主复制型表达载体pEV的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
实施例2 :适冷假交替单胞菌高效接合转移系统的建立采用接合转移的方法，以适冷宿主菌菌株SM20429为宿主菌，以自主复制型表达载体PEV为载体，以大肠杆菌E T12576为供体菌建立适冷假交替单胞菌高效接合转移系统，步骤如下I)将自主复制型表达载体pEV转化E. coli ET12567菌株的感受态细胞，将转化的感受态细胞涂布在氨苄青霉素、氯霉素和卡那霉素LB平板。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验转化子中含有构建的质粒；2)取菌种保藏编号为CCTCC M 2010239的适冷宿主菌菌株，接种到海水LB液体培养基中，20°C振荡培养过夜，得初级菌液；将含有自主复制型表达载体的E. coli ET12567菌株接种到LB液体培养基中，37°C振荡培养过夜，得到初级菌液；3)按体积百分比1%的接种量将步骤2)制得的两种初级菌液分别接种到海水LB 液体培养基和LB液体培养基中，20°C和37°C培养到OD6qq为0. 6 1. 0，8000rpm离心lmin，弃去上清，得菌体；4)用Iml海水LB液体培养基和LB液体培养基分别洗涤步骤3)制得的菌体8000rpm离心Imin收集菌体,弃上清，并重复2 3次,分别将菌体悬浮于Iml海水LB液体培养基和LB液体培养基中，得菌液；5)将步骤4)得到的两种菌液以供体宿主=100 1的体积比混合，取200 U I涂布到含氯霉素和氨苄青霉素的筛选平板，20°C静置培养。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验接合转移子中含有构建的质粒，构建制得了适冷假交替单胞菌高效的接合转移系统。用此方法转化的接合转移效率达到1. 8X 10_3。实施例3 :利用构建的适冷表达系统表达纯化适冷纤维素酶(I)以来源于假交替单胞菌属适冷菌株的适冷纤维素酶基因cen为模板，核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示，利用引物(引物序列F: 5 ’ -GGAAGATCTATGGATAACAGTTTAATTAATCAC-3，，R:5，-CCGCTCGAGGCCACCCCAACCTTGAATG-3，)，Pfu DNA Polymerase PCR 扩增 cen片段，其中在引物两端分别设计了 BglII和XhoI识别位点。PCR产物电泳检测后，用限制性内切酶BglII和XhoI双酶切处理，37°C酶切30min后，用纯化试剂盒(购自OMEGA公司)按说明书纯化回收。(2)将经过酶切纯化的纤维素酶基因cen片段克隆到经相同酶切处理的自主复制型表达载体PEV中，构建纤维素酶基因cen的质粒pEV-cen。(3)利用接合转移的方法将质粒pEV-cen转入适冷宿主菌株SM20429。通过提取质粒和琼脂糖电泳来检验转化子中含有构建的质粒，制得带有质粒pEV-cen的SM20429菌株。(4)将带有质粒pEV-cen的SM20429菌株在10°C下扩大培养，检测菌株细胞内和细胞外的纤维素酶活性。纤维素酶活性检测方法a)菌体超声破碎取5ml菌液离心收集菌体，用磷酸缓冲液(PBS)洗涤菌体两次，最后加入5ml PBS使菌体重悬，用超声波破碎细菌，4°C离心lmin，取上清测胞内酶活。b)培养物上清液的收集取Iml菌液4°C离心分离菌体与上清。取上清测胞外酶活。c)取0.1ml细胞提取液或培养物上清，加入15ml比色管中，加入预热的Iml 1%的CMC-Na溶液，35 °C水浴反应30min，立即加入1. 5ml 3，5-ニ硝基水杨酸(DNS)终止反应，再置沸水中煮沸5min，流水冷却，加蒸馏水至15ml摇匀。同时进行空白对照測定，于15ml比色管中加入0.1ml酶液，1. 5mlDNS试剂，后加入Iml预热的1%的CMC-Na溶液，摇匀。置沸水中煮沸5min,流水冷却,加蒸懼水至15ml,摇勻。于550nm波长处测吸光值测还原糖的含量。如图2和图3所示。由图2可以看出带有质粒pEV-cen的SM20429菌株胞内检测到纤维素酶酶活，说明适冷纤维素酶基因在SM20429中进行了异源表达；由图3可以看出带有质粒pEV-cen的SM20429菌株胞外检测到纤维素酶酶活，说明适冷纤维素酶基因在SM20429中进行了异源表达，并分泌至胞外。
实施例4 :利用His-tag纯化纤维素酶将带有质粒pEV-cen的SM20429菌株在10°C下扩大培养，纯化胞内和胞外的纤维素酶。利用His-tag纯化纤维素酶的方法a)胞内蛋白收集取IOOml菌液4°C离心收集菌体,用20ml Binding buffer使菌体重悬，用超声波破碎细菌，4°C离心lOmin，收集上清。b)胞外蛋白收集取IOOml菌液4°C离心分离菌体与上清，取上清后，将IOOml上清液加入透析袋中，用PEG 2000浓缩菌液。浓缩后用Binding buffer过夜透析菌液。4°C离心IOmin,收集上清。c)将步骤a)与b)得到的胞内和胞外的蛋白液分别加到镍柱上，待液体流尽后，加入8-10倍柱体积的Binding buffer。待Binding buffer流尽,加入8_10倍柱体积的Washing buffer,流尽后，加入 IOml Elution buffer 并用1. 5ml 离心管收集。d)将步骤c)收集到的蛋白测纤维素酶活，并通过SDS-PAGE检测纯化的纤维素酶。如图4所示。
SEQUENCE LISTING
<110〉山东大学
く 120〉自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用<160〉 6
<170 PatentIn version 3. 5
く210> I<211> 7355<212> DNAく 213〉人工合成
<400> I
gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgcgca tgcggcgaaa aatgcgctaa ttaacagaag60
CCgttttatt gttatttttt tcatgtgtat ccttgctaat tttgttgcta gtaaagtgtg120
tgattaagga atgtgtactg tgttattttt gttcagtcta ttttaatgaa acgttgttgt180
caaaaagact atatggtgtt aagtttacat tgcacactaa aaaacacaca acaggagatc240
taggcctccc gggctcgagc accaccacca ccaccactaa tgagatccgg ctgctaacaa^OO
agcccgaaag gaagctgagt tggctgctgc caccgctgag caataactag cataacccct360
tggggcctct aaacgggtct tgaggggttt tttggcggcc gcgcggccgc gggaattcga420
tgccagctcg tcggtgtagc tctttggcat cgtctctcgc ctgtcccctc agttcagtaa480
tttcctgcat ttgcctgttt ccagtcggta gatattccac aaaacagcag ggaagcagcg540
cttttccgct gcataaccct gcttcggggt cattatagcg attttttcgg tatatccatc600
ctttttcgca cgatatacag gattttgcca aagggttcgt gtagactttc cttggtgtat680
ccaacggcgt cagccgggca ggataggtga agtaggccca cccgcgagcg ggtgttcctt^20
cttcactgtc ccttattcgc acctggcggt gctcaacggg aatcctgctc tgcgaggctg,80
gccggctacc gccggcgtaa cagatgaggg caagcggatg gctgatgaaa ccaagccaac840
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cgacctgggc cgcctgggcg gcctgctgaa actctggctc accgacgacc cgcgcacggc1080
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aactttgact ttatccatta aattattttt aaagtgttct aattcagtgt ttatttttat4140
权利要求
1.适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV，核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
2.权利要求1所述适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV的构建方法，其特征在于，步骤如下 1)以质粒pKNGlOl为模板,利用EasyTaqDNA Polymerase进行PCR扩增,经回收,制得质粒pKNGlOl的DNA片段，PCR扩增引物序列如下OriTl :5’ -GCCAGCTCGTCGGTGTAGCT-3’，RK2 :5’ -CAACAACGTTGCCCGGATCG-3’， 2)将步骤I)制得的质粒pKNGlOl的DNA片段和载体pGEM_TEasy的混合液4 μ 1、5 μ I连接缓冲液、I μ I连接酶混合后，16°C连接过夜，得质粒； 3)以质粒pWD为模板，利用PfuDNA Polymerase进行PCR扩增，PCR扩增引物序列如下ZF :5’ -AACTGCAGCAAGACACTGTGAAGG-3'CMR :5，-GGACTAGTGAAGCACACGGTCACACTG-3，， 经纯化回收后，用限制性内切酶ApeI和PstI双酶切处理，回收酶切DNA片段，然后插入到同样经限制性内切酶SpeI和PstI双酶切处理后的步骤2)制得的质粒中，制得p0riT-4CM 质粒； 4)人工合成含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag及终止密码子的DNA片段，在片段的两端引入SphI和NotI识别位点；用限制性内切酶SphI和NtI双酶切处理，经纯化回收后，插入到同样经限制性内切酶SphI和NotI双酶切处理的步骤3)制得的p0riT-4CM质粒中，制得自主复制型表达载体PEV。
3.如权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述步骤4)中含有木聚糖酶启动子、多克隆位点和His-tag的DNA片段制备步骤如下 选取Pseudoalteromonas sp. BSi20429的木聚糖酶基因起始密码子前200bp的DNA序列其后紧跟4个限制性内切酶序列，His标签和终止密码子，人工合成这段DNA片段并在片段两端引入SphI和NotI识别位点。
4.权利要求1所述适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV在表达适冷纤维素酶中的应用。
全文摘要
本发明涉及自主复制型表达载体pEV及其制备方法与应用。适冷宿主菌菌株SM20429的自主复制型表达载体pEV，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；本发明还公开了上述自主复制型表达载体pEV的制备方法与应用。适冷宿主菌菌株SM20429和自主复制型表达载体pEV具有被发展成为大量表达外源蛋白的适冷表达系统的潜在价值，从而达到在低温条件下快速制备适冷蛋白的目的。
文档编号C12N15/74GK103014052SQ20121051975
公开日2013年4月3日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者张玉忠, 于子超, 赵殿丽, 陈秀兰, 解彬彬, 张熙颖, 周百成 申请人:山东大学