本发明涉及一种胶原蛋白肽的制备，尤其涉及一种微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法。
背景技术：
胶原多肽是胶原或明胶经蛋白酶等降解处理后制得的介于蛋白质和氨基酸之间的产物，一般将由2到10个氨基酸通过肽键形成的直链肽称为寡肽或小肽；由肽键结合起来的多于10个氨基酸的聚合体则称为多肽。近年来，很多学者对肽的消化吸收机制进行了研究，认为肽甚至相当量的蛋白质在动物体内可以被完整吸收并被机体利用，如口服疫苗和酶法治疗疾病。肽的转运系统和游离氨基酸相比转运速度更快。许多试验表明，肽的添加还可以提高氨基酸的吸收速度。此外肽还能促进蛋白质沉积率，因为肽能直接用于人体蛋白质的合成。长期食用经过添加胶原蛋白肽的食品有助于改善皮肤弹性，延缓衰老，增强免疫力，同时食用方便，适合于大众人群。
我国对东海乌参的利用研究始于上世纪八十年代初，虽然在上海、温州等地有东海乌参的产品(东海香参)出现，但是至今一直未能实现产业化。近年来，随着海参养殖热在渤海湾的兴起，产生了一个年产值100多亿的海参产业，由此引发了众多科研院校对海参(包括东海乌参)营养和药用成分的研究。据中国科学院海洋研究所廖玉麟、清华大学博士后流动站杜力军和上海二军大海洋药物研究所易杨华等专家研究，东海乌参具有丰富的营养成分和药用价值，其中氨基酸总量、海参皂甙和海参多糖的含量都高于黄玉海参。但是，也提出了东海乌参体表污垢层含大量的铅、镉、汞等有害重金属。东海乌参常年生活在海底淤泥中，体表会分泌一种富含氨基酸和胶原蛋白的粘液，这种粘液与海底淤泥中的有害重金属牢固的结合，形成了东海乌参的体表污垢层。这层污垢的清除非常困难，靠目前常用的常规清洗和添加氢氧化钠、过氧化氢清洗等处理的东海乌参产品很难达到国家强制性标准GB2762-2012《食品安全国家标准/食品中污染物限量》、GB2733-2005《鲜、冻动物性水产品卫生标准》和农业部NY/T1514-2007《绿色食品海参及制品》标准的要求。从市场收集到的东海乌参产品检测结果看，有害重金属超过国家标准几十到几百倍，这也是东海乌参丰富资源未能得到有效利用和产业化的根本原因所在。
技术实现要素：
本发明提供了一种提高纯度与提取率，去除苦腥味、提高口感、利于人体吸收的微生物发酵法制备的微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法。
本发明通过以下技术方案：
一种微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，包括如下工艺步骤：
a.选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后浸入浸泡液50-60min，捞出沥干水分，使用打浆机进行打浆处理，加入35-40倍体积的纯净水后采用胶体磨进行研磨细化处理，得浆状物；
b.将步骤a得到的浆状物加热至中心温度达到130-145℃，保持10min，冷却到20-25℃，加入蛋白酶进行酶解，打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41℃条件下处理15分钟后，继续酶解，灭酶；过120目滤网，得到胶原蛋白滤液；
c.在步骤b得到的胶原蛋白滤液中，按重量百分数0.5-3％加入葡萄糖或蔗糖，调节pH到6-7，得初始发酵液；
d.将步骤c得到的初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入发酵种子，接种量是初始发酵液体积百分数的2-4.5％，接种混合液在37℃和100-300rpm搅拌转速的条件下密封发酵2-5天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；
e.在步骤d得到的发酵滤液中加入15-20％海藻糖、0.3-0.8％麦芽糊精与3-5％甘油，-50℃预冻2-6h，然后在-70℃冷阱温度和＜150Pa真空度的条件下冷冻干燥12-20h，直接得到海参胶原蛋白肽；或者，步骤d得到的发酵滤液采用孔径为0.1-0.5μm的管式膜脱除大分子，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜截留分级，截留液采用纳滤膜浓缩脱盐，然后在175-185℃进风温度、75-85℃出风温度和0.35-0.45MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得到海参胶原蛋白肽。
作为优选，步骤a中浸泡液由以下重量份的原料组成：山楂20-25份、野菊花1-5份、广藿香30-40份、壳聚糖15-18份、海藻酸钠12-15份与水200-350份，东海乌参与浸泡液的质量比为1:10。
作为优选，步骤d中发酵种子为就地堆肥地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌。
作为优选，发酵种子培养基的原料按以下重量份数计：3％大豆蛋白胨、5％富硒酵母、6％天冬酰胺、5.5％蛋氨酸、0.5％牛肉粉、0.5％葡萄糖、0.1％氯化钠、0.01％磷酸二氢钾，其余为蒸馏水，121℃高温灭菌20min，冷却后备用。
作为优选，将就地堆肥地芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌或巨大芽孢杆菌接种于发酵种子培养基中，摇床180r/min，培养48h，发酵液中芽孢杆菌＞108cfu/mL。
本发明的有益效果是：本发明的制备方法生产周期短，得率高，产品纯度高，具有显著的抗氧化性，可溶性好，吸收性高，无异味和苦味；使海参得到充分的高值化加工利用。
具体实施方式
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，但这些阐述并不对本发明做任何形式上的限定。除另有说明，否则本发明所用的所有科学和技术术语具有本发明所属和相关领域的一般技术人员通常所理解的含义。
下面结合具体实施例对本发明做出进一步详细的阐述，但应当明白，实施例不应理解为对本发明保护范围的限制。
实施例1
一种微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，包括如下工艺步骤：
a.选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后浸入浸泡液50min，捞出沥干水分，使用打浆机进行打浆处理，加入35倍体积的纯净水后采用胶体磨进行研磨细化处理，得浆状物；浸泡液由以下重量份的原料组成：山楂20份、野菊花1份、广藿香30份、壳聚糖15份、海藻酸钠12份与水200份，东海乌参与浸泡液的质量比为1:10；
b.将步骤a得到的浆状物加热至中心温度达到130℃，保持10min，冷却到20℃，加入蛋白酶进行酶解，打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41℃条件下处理15分钟后，继续酶解，灭酶；过120目滤网，得到胶原蛋白滤液；
c.在步骤b得到的胶原蛋白滤液中，按重量百分数0.5％加入葡萄糖，调节pH到6，得初始发酵液；
d.将步骤c得到的初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入发酵种子，接种量是初始发酵液体积百分数的2％，接种混合液在37℃和100rpm搅拌转速的条件下密封发酵2天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；发酵种子为就地堆肥地芽孢杆菌；发酵种子培养基的原料按以下重量份数计：3％大豆蛋白胨、5％富硒酵母、6％天冬酰胺、5.5％蛋氨酸、0.5％牛肉粉、0.5％葡萄糖、0.1％氯化钠、0.01％磷酸二氢钾，其余为蒸馏水，121℃高温灭菌20min，冷却后备用；
将就地堆肥地芽孢杆菌接种于发酵种子培养基中，摇床180r/min，培养48h，发酵液中芽孢杆菌＞108cfu/mL；
e.在步骤d得到的发酵滤液中加入15％海藻糖、0.3％麦芽糊精与3％甘油，-50℃预冻2h，然后在-70℃冷阱温度和＜150Pa真空度的条件下冷冻干燥12h，直接得到海参胶原蛋白肽。
实施例2
一种微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，包括如下工艺步骤：
a.选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后浸入浸泡液55min，捞出沥干水分，使用打浆机进行打浆处理，加入38倍体积的纯净水后采用胶体磨进行研磨细化处理，得浆状物；浸泡液由以下重量份的原料组成：山楂22份、野菊花3份、广藿香36份、壳聚糖17份、海藻酸钠13份与水250份，东海乌参与浸泡液的质量比为1:10；
b.将步骤a得到的浆状物加热至中心温度达到135℃，保持10min，冷却到23℃，加入蛋白酶进行酶解，打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41℃条件下处理15分钟后，继续酶解，灭酶；过120目滤网，得到胶原蛋白滤液；
c.在步骤b得到的胶原蛋白滤液中，按重量百分数2％加入蔗糖，调节pH到6.5，得初始发酵液；
d.将步骤c得到的初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入发酵种子，接种量是初始发酵液体积百分数的3.2％，接种混合液在37℃和200rpm搅拌转速的条件下密封发酵3天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；发酵种子为地衣芽孢杆菌；发酵种子培养基的原料按以下重量份数计：3％大豆蛋白胨、5％富硒酵母、6％天冬酰胺、5.5％蛋氨酸、0.5％牛肉粉、0.5％葡萄糖、0.1％氯化钠、0.01％磷酸二氢钾，其余为蒸馏水，121℃高温灭菌20min，冷却后备用；
将地衣芽孢杆菌于发酵种子培养基中，摇床180r/min，培养48h，发酵液中芽孢杆菌＞108cfu/mL；
e.步骤d得到的发酵滤液采用孔径为0.1-0.5μm的管式膜脱除大分子，然后采用截留分子量为3kDa的超滤膜截留分级，截留液采用纳滤膜浓缩脱盐，然后在175℃进风温度、75℃出风温度和0.35MPa喷雾压力的条件下喷雾干燥，得到海参胶原蛋白肽。
实施例3
一种微波/超声波辅助、微生物蛋白酶水解制备乌参胶原蛋白低聚肽的方法，包括如下工艺步骤：
a.选取富含胶原蛋白的东海乌参为原料，清水浸泡脱除盐分，洗净后浸入浸泡液60min，捞出沥干水分，使用打浆机进行打浆处理，加入40倍体积的纯净水后采用胶体磨进行研磨细化处理，得浆状物；浸泡液由以下重量份的原料组成：山楂25份、野菊花5份、广藿香40份、壳聚糖18份、海藻酸钠15份与水350份，东海乌参与浸泡液的质量比为1:10；
b.将步骤a得到的浆状物加热至中心温度达到145℃，保持10min，冷却到25℃，加入蛋白酶进行酶解，打开电脑微波-超声波组合催化合成仪对酶解物进行超声波-微波辅助酶解，其中超声波的探头插入深度固定不变，微波功率500W、超声功率100W、超声-微波处理温度为41℃条件下处理15分钟后，继续酶解，灭酶；过120目滤网，得到胶原蛋白滤液；
c.在步骤b得到的胶原蛋白滤液中，按重量百分数3％加入葡萄糖，调节pH到7，得初始发酵液；
d.将步骤c得到的初始发酵液放入空消发酵罐进行实消，空消和实消的条件均为121℃、20min，待罐温降至37℃，接入发酵种子，接种量是初始发酵液体积百分数的4.5％，接种混合液在37℃和300rpm搅拌转速的条件下密封发酵5天，发酵液滤去残渣，得发酵滤液；发酵种子为巨大芽孢杆菌；发酵种子培养基的原料按以下重量份数计：3％大豆蛋白胨、5％富硒酵母、6％天冬酰胺、5.5％蛋氨酸、0.5％牛肉粉、0.5％葡萄糖、0.1％氯化钠、0.01％磷酸二氢钾，其余为蒸馏水，121℃高温灭菌20min，冷却后备用；
将巨大芽孢杆菌接种于发酵种子培养基中，摇床180r/min，培养48h，发酵液中芽孢杆菌＞108cfu/mL；
e.在步骤d得到的发酵滤液中加入20％海藻糖、0.8％麦芽糊精与5％甘油，-50℃预冻6h，然后在-70℃冷阱温度和＜150Pa真空度的条件下冷冻干燥20h，直接得到海参胶原蛋白肽。
本发明中所用原料、设备，若无特别说明，均为本领域的常用原料、设备；本发明中所用方法，若无特别说明，均为本领域的常规方法。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例，并非对本发明作任何限制，凡是根据本发明技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、变更以及等效变换，均仍属于本发明技术方案的保护范围。