一种绿茶降血糖肽的制备方法及其应用与流程

本发明属于茶叶多肽
技术领域：
。更具体地，涉及一种绿茶降血糖肽的制备方法及其应用。
背景技术：
：我国是世界上最大的茶叶生产国，随着茶叶深加工技术及企业迅速发展，茶饮料等深加工产品大量生产同时产生了大量茶渣。茶叶蛋白来自经过提取后的茶叶废渣中，其氨基酸比例平衡，氨基酸评分高于大豆，接近母乳和牛奶，是一种优质的蛋白质资源，占茶叶干重的20～30％，其中80％以上是非水溶性蛋白，具有抗氧化、降低血脂等功效，其酶解为小分子多肽后活性更高。目前，以茶叶为原料实施规模化开发的功能成分主要有茶多酚、儿茶素、茶色素、生物碱、茶皂素、花青素等，而对于茶渣中茶叶蛋白的开发利用甚少。降血糖肽具有降血糖效果好且对正常血糖无影响、无副作用等优点，以蚕蛹、杏仁、苦瓜、啤酒糟等动植物为原料制备的降血糖肽相继问世，截止到目前，以茶叶为原料制备降血糖肽的研究尚未见报道。技术实现要素：本发明要解决的技术问题是克服上述现有技术的缺陷和不足，提供一种绿茶降血糖肽的制备方法和应用。本发明的目的是提供所述一种绿茶降血糖肽的制备方法。本发明另一目的是提供所述一种绿茶降血糖肽的应用。本发明上述目的通过以下技术方案实现：一种绿茶降血糖肽的制备方法，采用蛋白酶催化水解绿茶蛋白生成具有降血糖活性的多肽片段，具体步骤如下：S1.破壁：采用酶解技术，利用复合植物水解酶对绿茶茶渣进行酶解破壁处理；S2.碱提：步骤S1酶解后的绿茶茶渣继续采用碱法提取茶蛋白，得到绿茶茶蛋白提取液；S3.酸沉：对S2所得绿茶茶蛋白提取液进行酸沉，得沉淀物；S4.脱盐：对S3所得沉淀物进行脱盐；S5.脱色：取S4脱盐后的绿茶蛋白，利用85％丙酮进行脱色，冷冻干燥得到绿茶蛋白；S6.酶解：取S5所得的绿茶蛋白加入酸性蛋白酶进行酶解，得到具有降血糖活性的绿茶多肽。优选地，所述绿茶茶渣为绿茶茶叶、绿茶茶渣、浸提后的废弃绿茶茶渣中的一种。优选地，所述酸性蛋白酶为和氏璧酸性蛋白酶(Acidprotease)。优选地，所述复合植物水解酶为诺维信复合植物水解酶ViscozymeL。优选地，步骤S1所述酶解的参数为：酶浓度为2.0～3.0％，固液比为1:30～1:40，酶解pH为2.0～3.0，酶解温度为40～50℃，酶解时间为2.5～3h。优选地，步骤S2所述碱提的参数为：碱液浓度为0.10～0.20mol/L，固液比为1:20～1:40，提取温度为85～95℃，提取时间为1～3h；离心得到绿茶蛋白提取液。优选地，步骤S3所述酸沉是取绿茶蛋白碱提液，用稀盐酸调节pH为2.5～3.5，静置30～60min后离心，得到沉淀物。优选地，步骤S4所述脱盐是在沉淀物中加入水混匀，注入透析袋中，置于纯水中透析24～48h，期间更换纯水4～6次，直至透析袋外水无色且电导率接近纯水，然后3500～4000r/min离心10～15min得到脱盐后的绿茶蛋白。优选地，步骤S5所述脱盐后的绿茶蛋白和85％丙酮的用量比为：固液比1:4～1:6。优选地，步骤S5所述脱色的方法是：取S4脱盐后的绿茶蛋白，加入85％丙酮，震荡15～20min，离心弃上清，重复数次，用纯水洗涤并离心，重复数次以洗净丙酮，得到绿茶蛋白。优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.5～3.5％，酶解pH为2.0～5.0，酶解温度为40～58℃，酶解时间为2.5～3h。更优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.5～3.5％，酶解pH为3.0～4.0，酶解温度为45～50℃，酶解时间为2.5～3h。更优选地，步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.5％，酶解pH为4.0，酶解温度为45℃，酶解时间为3h。另外，由上述制备方法制备得到的具有降血糖活性的绿茶多肽，以及所述绿茶多肽在制备降血糖药物或具有降血糖功能的茶叶功能性食品方面的应用，也都应在本发明的保护范围之内。本发明具有以下有益效果：本发明提供了一种酶法提取具有降血糖活性绿茶多肽的方法，在温和的条件下采用蛋白酶催化水解绿茶蛋白生成具有降血糖活性的多肽片段，具有原料来源广泛、反应条件温和、易控制、专一性强、不使用有毒有害试剂等优点，既不会导致营养成分的损失，也不会产生毒性方面的问题。本发明提供的具有降血糖活性绿茶多肽在研究开发具有降血糖功能的茶叶功能性食品以辅助或代替药物治疗方面具有很好的应用前景，对糖尿病的防治以及茶叶资源的创新利用都具有重要意义。附图说明图1为高降血糖活性绿茶多肽提取工艺流程图。图2为酸性蛋白酶酶解温度对绿茶多肽α-淀粉酶抑制率的影响图。图3为酸性蛋白酶酶解时间对绿茶多肽α-淀粉酶抑制率的影响图。图4为酸性蛋白酶酶浓度对绿茶多肽α-淀粉酶抑制率的影响图。图5为酸性蛋白酶酶解pH值对绿茶多肽α-淀粉酶抑制率的影响图。图6为高降血糖活性绿茶多肽体内降血糖活性作用图。具体实施方式以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本
技术领域：
常规试剂、方法和设备。除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。实施例1具有降血糖活性的绿茶多肽的制备1、制备方法流程图如附图1所示，包括如下步骤：S1.破壁：采用酶解技术对绿茶茶渣进行酶解破壁处理；S2.碱提：步骤S1酶解后的绿茶茶渣继续采用碱法提取绿茶蛋白，离心得到绿茶蛋白提取液；S3.酸沉：对S2所得绿茶蛋白提取液进行酸沉，得沉淀物；S4.脱盐：对S3所得沉淀物进行脱盐；S5.脱色：取S4脱盐后的绿茶蛋白，利用85％丙酮进行脱色，冷冻干燥得到绿茶蛋白；S6.酶解：取S5所得的绿茶蛋白加入食物蛋白酶进行酶解，得到具有降血糖活性的绿茶多肽。其中，所述绿茶茶渣为浸提后的废弃绿茶茶渣。步骤S6所述酶解的参数为：酶浓度为2.5～3.5％，酶解pH为2.0～5.0，酶解温度为40～60℃，酶解时间为2～3h。步骤S1所述酶解破壁所使用的酶为诺维信复合植物水解酶ViscozymeL。步骤S1所述酶解的参数为：酶浓度为2.0～3.0％％，固液比为1:30～1:40，酶解pH为2.0～3.0，酶解温度为40～50℃，酶解时间为2～3h。步骤S2所述碱提的参数为：碱液浓度为0.10～0.20mol/L，固液比为1:20～1:40，提取温度为85～95℃，提取时间为1～3h；离心得到绿茶蛋白提取液。步骤S3所述酸沉是取绿茶蛋白提取液，用稀盐酸调节pH为2.5～3.5，静置30～60min后离心，得到沉淀物。步骤S4所述脱盐是在沉淀物中加入水混匀，注入透析袋中，置于纯水中透析24～48h，期间更换纯水4～6次，直至透析袋外水无色且电导率接近纯水，然后3500～4000r/min离心10～15min得到脱盐后的绿茶蛋白。步骤S5所述脱盐后的绿茶蛋白和85％丙酮的用量比为：固液比1:4～1:6。步骤S5所述脱色的方法是：取S4脱盐后的绿茶蛋白，加入85％丙酮，震荡15～20min，离心弃上清，重复数次，用纯水洗涤并离心，重复数次以洗净丙酮，得到绿茶蛋白。实施例2绿茶降血糖肽制备过程中酸性蛋白酶酶解温度的优化1、在固定酸性蛋白酶用量为3.0％，pH值为4.0，在反应时间为3h的条件下，分别选择40、45、50、55、60℃作为步骤S6的酶解条件进行试验，测定所得酶解产物的对α-淀粉酶的抑制率。2、结果如图2所示，不同温度条件下酶解得到的绿茶多肽的α-淀粉酶抑制率呈现先升高后降低的趋势，在50℃时抑制率达到最大；但当温度升高到55℃时，α-淀粉酶抑制率下降速度较快，可能是高温条件下部分酶失活所致，60℃时，α-淀粉酶抑制率继续下降。综合考虑，选取50℃作为最佳酶解温度进行后续正交实验设计。实施例3绿茶降血糖肽制备过程中酸性蛋白酶酶解时间的优化在固定酸性蛋白酶用量为3.0％，pH值为4.0，在反应温度为50℃的条件下，分别选择酶解时间为1、2、3、4、5h作为酶解条件进行试验，测定内反应体系所得酶解产物的α-淀粉酶抑制率。结果如图3所示，不同酶解时间条件下酶解得到的绿茶多肽的α-淀粉酶抑制率随着酶解时间的增加呈现出升高的趋势，在酶解3h时达到抑制率达到最大值71.30％，随着酶解时间继续增加，抑制率变化不大。由于α-淀粉酶抑制率为主要考察指标，考虑酶解时间延长对多肽的生产周期、成本都不利，因此选择3h作为最佳酶解时间进行后续正交实验设计。实施例4绿茶降血糖肽制备过程中酸性蛋白酶的酶浓度的优化在固定酸性蛋白酶酶解反应pH值为4.0，温度为50℃，时间为3h的条件下，分别选择酶浓度为1％、2％、3％、4％、5％作为酶解条件进行试验，测定所得酶解产物的α-淀粉酶抑制率。结果如图4所示，当酸性蛋白酶浓度为1％～3％时，绿茶多肽对α-淀粉酶抑制率随着酶浓度的增加呈现升高的趋势，随着酶浓度的进一步增加，绿茶多肽对α-淀粉酶抑制率变化不大。这可能是因为底物浓度一定情况下，随着酶添加量的增加，大量蛋白质分子被水解为小分子多肽，反应体系的初速度随酶用量的增大逐渐增大，酶加量越大对蛋白质的酶解作用越强，生成的活性短肽越多，其抑制α-淀粉酶的活性越高。当加酶量增加到一定值时，由于可供酶切的底物位点有限，体系中的酶全部将底物酶解后，即使再增加蛋白酶的用量，生成的活性短肽也不会增多，因此其对α-淀粉酶的抑制活性也不会明显增加。因为在3％酶浓度下酶解所得到的活性多肽α-淀粉酶抑制率最高，并考虑到酶解用酶的成本问题，因此选择3％为酶解最佳酶浓度进行下一步实验。实施例5绿茶降血糖肽制备过程中酸性蛋白酶的酶解pH值的优化在固定酸性蛋白酶用量为3％，酶解反应温度为50℃，反应时间为3h的条件下，分别选择酶解pH值为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0作为酶解条件进行试验，测定内反应体系的水解度和所得酶解产物的α-淀粉酶抑制率。结果如图5所示，在酶解反应pH值为4.0时，α-淀粉酶抑制率达到最大，α-淀粉酶抑制率为73.74％，因此选择pH4.0作为其最佳的酶解pH值。实施例6酸性蛋白酶酶解制备高降血糖活性绿茶多肽的工艺优化根据上述实施例的酶解条件优化的结果，设计四因素三水平正交实验(见表1)，用自变量A、B、C、D分别表示酶解温度(℃)、酶解时间(h)、酶浓度(％)、pH值4个因素，以α-淀粉酶抑制率为考察指标。表1L9(34)正交试验的因素水平设计结果如表2～表4所示。表2正交试验结果表3模型直观分析表4模型方差分析数据来源自由度SeqSSAdjSSAdjMSFPSeqSS温度2605.67605.67302.849.850.092605.67酶浓度2116.93116.9358.471.900.345116.93pH值2145.40145.4072.702.360.297145.40误差261.5261.5230.7661.52合计8929.52929.52本试验以绿茶多肽对α-淀粉酶的抑制率为主要考察指标，α-淀粉酶抑制率越高，绿茶多肽的体外降血糖活性越好。由表3的直观分析结果可知，通过比较表3中3个因素的极差R值，酶解制备高降血糖活性绿茶多肽的过程中酶解温度是影响其抑制α-淀粉酶活性最主要因素，影响绿茶多肽抑制α-淀粉酶活性的主次因素从大到小顺序依次为：浸提温度(A)＞pH值(D)＞酶浓度(C)＞酶解时间(B)。从方差分析结果来看，三个因素对α-淀粉酶活性的影响虽然不显著，只有温度显著性达到了0.092。综合以上结果，可以得到高降血糖活性绿茶多肽提取的最佳工艺为A1B1C2D3。因此，酶解最佳工艺条件为：20g/L的绿茶蛋白在酸性蛋白酶用量2％，反应体系pH5.0，酶解温度为45℃的条件下水解2h。对优化的实验结果进行α-淀粉酶的抑制率测定，优水平组合实测值为77.90％，表明该方法下酶解绿茶蛋白得到的绿茶多肽活性较高，从而证明了优化设计与分析方法较为准确。实施例8体内降血糖实验1、实验方法(1)实验分组：采用50只6周龄的雄性ICR小鼠，随机分成两组，第一组(N＝10，正常对照组，10只/笼)，第二组(N＝40，造模组，10只/笼)，正常对照组喂养普通饲料，造模组喂养高脂饲料，喂养4周后，空腹12h进行腹腔注射130mg/kg·BWSTZ(溶解在0.1M柠檬酸缓冲液中，pH4.5)，继续喂养高脂饲料，注射3d和7d后测定血糖值，空腹血糖值≥11.10mmol/L的小鼠选为造模成功的2型糖尿病动物模型，再重新分组，具体分组如下表5所示：表5实验分组与剂量：(2)实验步骤实验开始前1天测定各组小鼠空腹血糖水平，连续灌胃6周，每周采用快速血糖测定仪测定各组小鼠的空腹血糖水平，观察各个实验组随时间变化的空腹血糖水平，每只小鼠每次测定血糖3次，取平均值。(3)实验结果从图6结果可以，实验开始前(0周)，正常组小鼠的空腹血糖水平最低，为6.2mmol/L，处于正常水平。模型组和绿茶多肽组的小鼠血糖水平明显高于正常组，分别是23.5mmol/L和22.6mmol/L，且两组之间没有显著差异。灌胃5周后，绿茶多肽组的空腹血糖水平明显下降(13.2mmol/L)，显著低于模型组的空腹血糖水平(23.7mmol/L)。可见，绿茶多肽在动物体内具有良好的降血糖活性。当前第1页1 2 3