本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种用于dna片段的非特异性复制的方法及试剂盒。
背景技术：
dna扩增的方法有很多，常规的扩增方法主要有两种。一是利用随机引物与dna的任意位置相结合并扩增，从而获得大量的随机长度的dna片段。二是将dna分子加人工接头连接，然后以加接头的dna片段为模板进行dna扩增。前种方法的缺点是，扩增产物dna分子长度小于原来的dna分子，dna分子的完整性遭到破坏，不能将模板分子的全长扩增，小片段产物过多，导致用于常规检测的有效dna模板量不足。对于由小片段dna分子构成的样本如游离dna样本，此方法将难以获得扩增产物。第二种方法虽然能够较为完整的获得微量dna分子的复制扩增产物，但是产物分子两端引入了较长的人工序列，改变了原始dna分子的序列信息，对于基于dna序列信息的检测及研究极易造成非特异性的干扰或信息的丢失，尤其是对于ngs等第二代测序类检测手段，原始dna分子本身带有部分外源dna序列信息将造成极大的干扰。
技术实现要素：
鉴于上述现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种dna片段的非特异性复制的方法及试剂盒，通过对希望进行复制的dna片段的非特异性扩增，得到大量与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段。
本发明为解决上述问题进行了深入研究，结果发现：使用引物对加接头的dna片段进行pcr扩增，利用酶切试剂对pcr扩增产物进行切割，获得大量与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段。
即，本发明包括：
1.一种dna片段的非特异性复制的方法，包括：
步骤b：将经过处理的希望进行复制的dna片段加接头，得到加接头的dna片段；
步骤c：使用与所述接头的核苷酸序列相结合的引物对所述加接头的dna片段进行pcr扩增，得到pcr产物；
步骤d：采用切割的试剂将pcr产物进行切割，得到大量与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段。
2.根据项1所述的方法，其中，所述接头为具有切割信息的接头。
3.根据项2所述的方法，其中，所述切割信息位于所述接头的靠近用于与所述经过处理的希望进行复制的dna片段相连接的一端。
4.根据项3所述的方法，其中，所述切割信息为切割位点。
5.根据项4所述的方法，其中，所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列。
6.根据项4所述的方法，其中，所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个t碱基的碱基序列。
7.根据项2所述的方法，其中，所述具有切割信息的接头是由核苷酸序列如seqidno：1和seqidno：2经退火反应形成的产物。
seqidno：1序列：5'-at(n)a(n)b-3'，
seqidno：2序列：5'-(n)c(n)'at-3'，
其中，n选自a、t、c、g四种碱基中的任意一种，(n)a与(n)'a核苷酸序列反向互补，t为0或1，a、b和c分别为5以上的自然数，优选地a为5～30，更优选地a为10～20，优选地b为5～20，更优选地b为10～20，优选地c为10～20。
8根据项1所述的方法，其中，所述引物为具有切割信息的引物。
9.根据项8所述的方法，其中，所述切割信息位于所述引物的3'端区域。
10.根据项8所述的方法，其中，所述切割信息为切割位点。
11.根据项10所述的方法，其中，所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列。
12.根据项10所述的方法，其中，所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个t碱基的碱基序列。
13.根据项8所述的方法，其中，所述的具有切割信息的引物是如seqidno：3所示核苷酸序列和seqidno：4所示核苷酸序列。
seqidno：3序列：5'-(n)e(n)'b(n)'au(m)k-3'，
seqidno：4序列：5'-(n)f(n)c(n)'au(m)g-3'，
其中，n选自a、t、c、g四种碱基中的任意一种，m为随机碱基，(n)a与(n)'a核苷酸序列反向互补，(n)'b与(n)b核苷酸序列反向互补，e、f、g、k为自然数，a、b和c分别为5以上的自然数，优选地a为5～30，更优选地a为10～20，优选地b为5～20，更优选地b为10～20，优选地c为10～20，优选地e为0～20，f为0～20，更优选e为0，f为0，优选地g、k为0～5，更优选地g、k为0～3。
14.根据项1所述的方法，其中，所述切割方式为试剂切割。
15.根据项14所述的方法，其中，所述试剂切割是采用切割试剂进行至少一次切割。
16.根据项15所述的方法，其中，所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶。
17.根据项16所述的方法，其中，所述具有切割功能的酶为下组中至少一种：限制性内切酶、外切酶、具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶.
18.根据项17所述的方法，其中，所述具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶为udg或endonucleaseviii和udg的混合物，所述具有单链特异性切割功能的酶选自绿豆核酸酶和/或s1核酸酶。
19.根据项1所述的方法，其中，步骤b中所述希望进行复制的dna片段的量为0.1～100ng。
20.根据项1所述的方法，其中，步骤b中所述希望进行复制的dna片段的大小为80～1000bp，优选地片段大小为100～250bp。
21.根据项1所述的方法，其中，包括在步骤b之前进行的步骤a-2：将希望进行复制的dna片段进行末端修复，得到经过处理的希望进行复制的dna片段；或者将希望进行复制的dna片段进行末端修复，再进行或同时进行3'端加a，得到经过处理的希望进行复制的dna片段。
22.根据项21所述的方法，其中，包括在步骤a-2之前进行的步骤a-1：将样本dna进行打断，得到希望进行复制的dna片段。
23.一种可利用dna片段，其是通过项1～22中任一项所述的dna片段的非特异性复制的方法得到的。
24.一种dna文库的构建方法，其是采用项23所述的可利用dna片段进行的文库构建。
25.根据项24所述的dna文库的构建方法，还包括：
步骤e：将可利用dna片段进行末端修复，得到平末端dna片段；
步骤f：将平末端dna片段进行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步骤j：将3'端加a的dna片段进行加接头，得到加接头dna片段；
步骤h：将加接头dna片段进行pcr，得到pcr扩增产物，完成文库构建。
25.一种dna片段的非特异性复制的试剂盒，其用于实施项1～22中任一项所述的方法，包括：用于加接头的试剂，所述试剂包括接头，用于pcr扩增的试剂，所述pcr扩增的试剂包括引物，和/或用于切割的试剂所述切割的试剂包括具有切割功能的酶。
26.根据项25所述的试剂盒，其中，所述接头为具有切割信息的接头，所述引物为具有切割信息的引物，所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶。
27.根据项26所述的试剂盒，在所述具有切割信息的接头中，所述切割信息位于所述接头的靠近用于与所述经过处理的希望进行复制的dna片段相连接的一端；在所述具有切割信息的引物中，所述切割信息位于所述引物的3'端区域。
28.根据项26所述的试剂盒，其中，所述切割信息为切割位点。优选地所述切割位点为至少1bp的核苷酸序列；更优选地所述切割位点为至少一个酶切位点或含有至少一个t碱基的碱基序列。
29.根据项26所述的试剂盒，其中，所述具有切割信息的接头是由核苷酸序列如seqidno：1和seqidno：2经退火反应形成的产物。
30.根据项26所述的试剂盒，其中，所述的具有切割信息的引物是如seqidno：3所示核苷酸序列和seqidno：4所示核苷酸序列。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：本发明对希望进行复制的dna片段有效复制，获得大量的可利用dna片段，其与希望进行复制的dna片段大小、序列基本相同。
附图说明
图1是本发明的安捷伦2100检测1号样本dna片段结果的示意图；
图2是本发明的安捷伦2100检测1号样本dna扩增结果的示意图；
图3是本发明的安捷伦2100检测1号样本dna扩增后酶切结果的示意图；
图4是1-10号样本及1-10号复制产物测序数据的重复率分析结果示意图；
图5是1-10号样本及1-10号样本复制产物测序数据的比对率分析结果示意图；
图6是1-10号样本及1-10号样本复制产物测序数据的覆盖度分析结果示意图；
图7是5号原始样本及酶切样本在各染色体信号分布结果示意图；
图8是5号原始样本与酶切样本分窗口计算深度值
图9是本发明的安捷伦2100检测a1号样本dna片段结果的示意图；
图10是本发明的安捷伦2100检测a1号样本dna扩增结果的示意图；
图11是本发明的安捷伦2100检测a1号样本扩增后酶切结果的示意图。
具体实施方式
以下结合附图和实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
在一方面中，本发明提供一种dna片段的非特异性复制的方法，包括：
步骤b：将经过处理的希望进行复制的dna片段加接头，得到加接头的dna片段；
步骤c：使用与所述接头的核苷酸序列相结合的引物对所述加接头的dna片段进行pcr扩增，得到pcr产物；
步骤d：采用切割方式将pcr产物进行切割，得到与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段。
“非特异性复制”是指没有或几乎没有引入外源序列和丢失模板信息的扩增，获得大量与原始模板序列基本相同的产物。在这里，“基本相同”是产物与原始模板核苷酸序列相比，本领域技术人员已知情况下，引入的外源序列比例极低，大小可达0bp，至多5bp核苷酸序列。
所述步骤b中的希望进行复制的dna片段的来源没有特殊的限制，其可以是例如基因组dna的大量样本，也可以是微量dna样本(如ffpe样本、血液/体液中的游离dna等)。对希望进行复制的dna片段的大小没有特殊限制，可以是本领域技术人员任何已知的可以作为扩增模板的大小，优选地希望进行复制的dna片段大小为80～1000bp，更优选地希望进行复制的dna片段大小为100～250bp，
在得到所述步骤b中经过处理的希望进行复制的dna片段前可以进行步骤a-2：将希望进行复制的dna片段进行末端修复，得到经过处理的希望进行复制的dna片段；或者将希望进行复制的dna片段进行末端修复，再进行或同时进行3'端加a，得到经过处理的希望进行复制的dna片段，可以在步骤a-2之前进行片段化。所述经过处理的希望进行复制的dna片段中的“经过处理的”可以是例如末端修复的步骤，或者末端修复和加a碱基的步骤等本领域技术人员通常知晓的用于获得可以进行加接头的dna片段的方法。
根据本发明，“切割信息”是指可以被任何一种切割方式识别的标识，例如切割位点等任何本领域技术人员了解的标记方法都可以用来获得切割信息。所述切割信息位于所述接头的靠近与希望进行富集的dna片段连接的一端，。“切割位点”是指一段核苷酸序列，可以设计为允许对两条链进行序列选择性切割的位点，例如酶切位点和/或脱氧尿嘧啶(又称尿嘧啶脱氧核苷酸、脱氧尿嘧啶核苷酸、deoxy-uracil或du)。在这里，“酶切位点”(restrictionenzymecuttingsite)是指dna上一段碱基的特定序列，限制性内切酶能够识别出这个序列并在此将dna序列切成两段。在适当时也可以设计为进允许对对一条链进行选择性切割的位点。所述“核苷酸”是指脱氧核糖核苷酸，在有些特殊情况下也可以是核糖核苷酸。对所述切割位点的长度和确切序列没有特别的限制，其可以是任何所需的序列，例如可以设计为可被任意选定的酶切割。
随后的段落更详细的描述了本发明的不同方面。除非有相反地明确指出，否则本发明的每一个方面可以和本发明的其它任何一个或多个方面结合。特别是，任何被指为特别的、优选地或有利的特征也可以和其他任何一个或多个被指为特别的、优选地或有利的特征相结合。
在一个特定的实施方案中，步骤b中所述的接头是由核苷酸序列如seqidno：1和核苷酸序列如seqidno：2经退火反应形成的产物。通常的，通过使用1×退火缓冲液稀释合成的接头引物干粉至浓度为100μm，然后等体积进行退火，即接头引物各取50μl，在85℃保持2分钟，每分钟1℃进行梯度降温，降温至15℃，4℃保温，得到接头，或使用本技术领域已知的方法和试剂盒均可以用于制备接头。
seqidno：1序列：5'-at(n)a(n)b-3'，
seqidno：2序列：5'-(n)c(n)'at-3'。
所述具有切割位点的引物为具有一个脱氧尿嘧啶的引物，如seqidno：3所示核苷酸序列和seqidno：4所示核苷酸序列，
seqidno：3序列：5'-(n)e(n)'b(n)'au(m)k-3'，
seqidno：4序列：5'-(n)f(n)c(n)'au(m)g-3'，
其中，n选自a、t、c、g四种碱基中的任意一种，m为随机碱基，(n)a、(n)b、(n)c、(n)e、(n)f、(n)'a、(n)'b为7段分别为含有a、b、c、e、f、a、b个n彼此独立地选自a、t、c、g的序列。(n)a与(n)'a为反向互补序列，(n)b与(n)'b为反向互补序列。t为0或1，t为0时表示有0个a，t为1时，表示有1个a。a、b和c分别为5以上的自然数，优选地a为5～30，更优选地a为10～20，优选地b为5～20，更优选地b为10～20，优选地c为10～20。e、f为自然数，优选地e为0～20，f为0～20，更优选e为0，f为0，优选地g、k为0～5，更优选地g、k为0～3。
优选地，在经过处理的希望进行复制的dna片段的步骤前包括步骤a-2：将希望进行复制的dna片段进行末端修复，在之后加接头的步骤中使用核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：1序列的引物进行退火形成的接头。或者将希望进行复制的dna片段进行末端修复，在末端修复之后或同时进行3'端加a的步骤得到的情况下，在加接头步骤时使用的核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：1核苷酸序列的引物进行退火形成的接头。
优选地，在所述步骤b中，还包括步骤b-1：将加接头的dna片段进行预扩增，例如，使用的试剂为：seqidno：2所示核苷酸序列引物、seqidno：5所示核苷酸序列引物、kapahifihotstart、readymix(kapa公司)等进行pcr扩增，seqidno：5核苷酸序列如下：
seqidno：5序列：5'-(n)e(n)'b(n)'at-3'。
所述步骤c中，用于pcr扩增的反应体系包括taq聚合酶、pfu聚合酶、kapahifi聚合酶、kapahifiuracil+体系、kapa2grobustdna聚合酶体系等。优选kapahifiuracil+反应体系，更优选kapa2grobustdna聚合酶体系。
所述步骤d中使用的切割试剂为具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶，具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶包括endonucleaseviii和udg的混合物。为使酶切反应更加充分，使用反应条件为30～50℃、5-60分钟，优选为20～40℃、20～40分钟，更优选为30～40℃、30～40分钟。
再使用具有单链特异性切割功能的酶可选自绿豆核酸酶和/或s1核酸酶，优选s1核酸酶。为使接头与dna扩增片段的切断更彻底，反应条件可以为20～50℃、0.1～2小时，优选为20～40℃、20～60分钟，更优选为25～35℃、25～35分钟。
优选地，本发明的方法中，步骤b与步骤c之间和/或步骤c与步骤d之间还包括产物纯化步骤，纯化步骤可以采用本技术领域的常规方法来进行，例如进行磁珠纯化。
在本发明的某实施方案中步骤b中可能包含使用带有酶切位点的接头对所述经过处理的希望进行复制的dna片段进行加接头，其中加接头的方法为本技术领域人员已知的方法，所述的酶切位点在所述接头与经过处理的希望进行复制的dna片段连接的位置。接头的设计为本领域技术人员已知的方法，在这种情况下，加接头反应可以使用在本技术领域已知的方法及试剂盒均可以实现，为普通的加接头方法。
步骤c中所述的引物的核苷酸序列的片段大小长度不大于任意接头单链核苷酸序列片段大小，在本技术领域人员已知的情况下，引物的核苷酸序列能与加接头的dna片段进行结合，并使用该技术领域已知的方法对加接头dna片段进行pcr扩增，能得到pcr产物。
步骤d中所述切割方式为试剂切割。在本发明中，所述切割方式可以是例如生物，化学或物理等的切割方式，为了将具有切割位点的pcr产物中的接头切除，得到与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段，任何合适的酶、化学或光学切割方法都可以用于切割。切割可以导致部分的或整个链被切割。任何合适的酶包括，例如，限制性内切酶、核酸外切酶、具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶。优选地所述试剂切割是采用切割试剂进行至少一次切割，
所述切割试剂为至少一种具有切割功能的酶；优选地，所述具有切割功能的酶为下组中至少一种：限制性内切酶、外切酶、具有脱氧尿嘧啶切割功能的酶和具有单链特异性切割功能的酶；当所述切割试剂为限制性内切酶时，首先使用限制性内切酶识别酶切位点进行切割，如myli酶对其进行酶切，在本领域技术人员已知情况下，可切除接头。
或者步骤d中所述切割试剂为限制性内切酶与具有单链特异性切割功能的酶，例如dpnii识别位点，在这种情况下，使用与识别位点相对应的(如hindiii酶)和具有单链特异性切割功能的酶，在这里，所述单链特异性切割功能的酶选自绿豆核酸酶和/或s1核酸酶，可切除接头，获得可利用dna片段。
限制性内切酶在一个特定的实施方案中，步骤b中初始使用的接头为本领域技人员已知的任何接头，加接头的方法也为本领域技术人员能够想到的所有加接头方法，步骤c中使用的引物为能与上述步骤b中所述接头的核苷酸序列相结合的，引物设计的原则通常情况对本领域技术人员来说是很熟悉的，并且在本领域已知的扩增条件和扩增体系下方法进行pcr扩增，即可得到pcr产物。
在这种情况下，步骤d中所述的酶切的试剂为核酸外切酶，例如bal31，在合适的情况下，对pcr产物进行消化，得到与希望进行复制的dna片段基本相同的可利用dna片段，在本发明中，可以根据不同核酸外切酶的类型，选择适合反应条件，可获得可利用dna片段。本发明提供一种可利用dna片段，该片段是通过dna片段的非特异性复制的方法获得。可利用dna片段的大小为80～1000bp，优选地可利用dna片段大小为100～250bp。
一种dna文库的构建方法，采用可利用dna片段为模板，还包括：
步骤e：将可利用dna片段进行末端修复，得到平末端dna片段；
步骤f：将获得平末端dna片段进行3'端加a，得到3'端加a的dna片段；
步骤g：将3'端加a的dna片段进行加接头，得到加接头dna片段；
步骤h：将加接头dna片段进行pcr，得到pcr扩增产物，完成文库构建。
优选地，在本发明步骤所述步骤b与步骤c之间、步骤c与步骤d之间、步骤d与步骤e之间、步骤e与步骤f、步骤f与步骤g之间、和/或步骤g与步骤h之间还包括产物纯化步骤，各步骤采用本技术领域的常规方法进行。
本发明还提供一种用于dna片段的非特异性复制的试剂盒(本发明的复制试剂盒)，其可用于实施本发明的方法。该复制试剂盒包括：
用于加接头的试剂，包括：接头；
用于pcr扩增的试剂，包括：引物；
用于切割的试剂，包括具有切割功能的酶。
另一方面，本发明还提供一种用于构建dna文库的试剂盒(本发明的建库试剂盒)，其可用于实施本发明的方法。
本发明的建库试剂盒必须包含用于对所述加接头后的产物进行pcr扩增的试剂，包括：
用于加接头的试剂，所述试剂包括接头；
用于pcr扩增的试剂，所述试剂包括引物；
用于切割的试剂，所述试剂包括具有切割功能的酶。
优选地，本发明的建库试剂盒还可以包括选自下组中的至少一种或全部：
用于末端修复的试剂，例如t4dna聚合酶、t4pnk、klenow片段及相应的连接反应缓冲液。
用于3'端加a的试剂，例如缺失外切酶活性的klenow片段及相应的反应缓冲液等。
用于段加接头的试剂，例如t4dna连接酶及相应的连接反应缓冲液等。
用于纯化的试剂，例如1.8×ampure磁珠等。
实施例1
1.样本及引物制备
1)使用的引物a、b、a’序列如下表，其中引物a在5'端进行磷酸化修饰，引物序列如下：
2)进行扩增使用的引物为a、b，其中引物a、b在3'端均有一个脱氧尿嘧啶，
引物序列如下：
3)接头制备(总体系100μl)
使用1×退火缓冲液稀释合成的引物a和引物b干粉至浓度为100μm，然后等体积混合进行退火；加入引物a(100μm)50μl和引物b(100μm)50μl，85℃反应2分钟，每分钟降温1℃，温度降至15℃，4℃保持，获得接头。
2.dna模板预处理
使用1份血浆样本，分离血浆游离dna，作为原始样本(即希望进行复制的dna)编号1，使用安捷伦2100生物分析仪及安捷伦2100高灵敏dna检测芯片(简称安捷伦2100)检测1号样本，结果显示1号样本dna片段大小主要分布在168bp左右(图1)，并取2ng进行以下处理：
1)末端修复反应
20℃温浴30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于32μl的eb中，得到平末端dna片段。
2)利用末端加a体系将平末端dna片段3'末端加a。末端加a反应体系为：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于25μl的eb中，得到3'端加a的dna片段。
3)使用接头连接体系将具有3't末端的接头连接到3'端加a的dna片段上。接头连接反应体系为：
20℃反应15分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于23μl的eb中，得到加接头dna片段。
4)对样本进行扩增处理
使用文库pcr反应体系对加接头的dna片段进行扩增，反应体系及条件如下：
pcr反应条件：
反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于50μl的eb中，获得初级扩增产物。
3.pcr扩增
使用初级扩增产物(或加接头的dna片段)作为模板，使用引物a、b进行扩增。pcr反应体系：
pcr反应条件：
反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于50μl的eb中，获得带有脱氧尿嘧啶的pcr产物。安捷伦2100检测片段大小并检测浓度定量，结果显示扩增后片段大小主要分布在235bp左右(图2)。
4.末端接头切割及产物回收
1)使用user酶切割脱氧尿嘧啶的pcr产物中的脱氧尿嘧啶，体系如下：
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于30μl的eb中，获得具有缺刻的dna片段。
2)使用s1核酸酶酶切具有缺刻的dna片段，将接头彻底切断，反应体系及反应条件如下：
30℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，获得复制产物(即，大量的、可利用的并且与孕妇血浆中游离dna片段序列基本相同的dna片段)。
5.dna片段大小检测
复制产物复制产物使用安捷伦2100检测复制产物的片段大小，结果显示复制产物的大小的主要分布在166bp左右(图3)。
图1显示1号样本dna片段大小主要分布在168bp左右，该片段大小为提出的孕妇血浆游离dna的片段大小。图2显示扩增后片段大小主要分布在253bp左右，该结果为经过加接头及pcr扩增后在1号样本长度基础上延长66bp，理论上扩增后的扩增产物长度为254bp左右，实际检测的结果片段大小主要分布在253bp左右，检测结果在波动范围之内，说明pcr扩增步骤成功的引入了脱氧尿嘧啶标记的引物，获得了具有脱氧尿嘧啶标记的pcr产物。图3显示复制产物的大小主要分布在166bp，复制产物的片段大小与原始样本(1号样本)dna片段大小相差2bp，同样在波动范围内，表明复制产物为pcr产物成功切割接头。
6.测序用dna文库的构建
取编号1原始样本游离dna作为对照，同步骤4获得的复制产物取2ng按illumina公司推荐的二代测序用dna文库构建的常规方法构建了测序用dna文库，并进行测序，测序类型为单端35bp，每个样本的测3.5g数据量。测序结果如下表：
表1高通量测序结果分析表
其中，重复率(dup率)：下机数据中，完全一致的reads占参考基因组比例。
比对率：能够完全比对到参考基因组(hg19)的reads数目占总体reads数目的比例。
覆盖度：经过序列比对后，在目标区域内，有序列覆盖到的区域占总目标区域的比例。
通过表2可以看出：原始样本与复制产物的相比，原始样本重复率为0.036％，复制产物的重复率为0.038％，重复的reads数无显著差异，说明本发明没有因pcr扩增增加重复率，对原始样本dna进行有效复制；原始样本比对率为0.783％，复制产物的比对率为0.790％，说明原始样本与复制产物测序数据利用率基本一致，无显著差异；原始样本覆盖度为0.702％，复制产物覆盖度为0.699％，即获得的数据在整个基因的比率分别0.702％和0.699％，结果无显著差异。
原始样本及酶切样本的测序下机数据，分析样本在各染色体上信号分布结果示意图(图7)，图7中横坐标为染色体编号，纵坐标为染色体信号值。所谓染色体信号值为待测样品经过与正常人类基因组进行不容错的比对之后，计算得到每条染色体上唯一比对序列数(uniquereads)，分别对每条染色体计算其序列数占所有唯一序列数(uniquereads)总和的比例，将其定义为该染色体的信号值。group2_a为原始样本，group2_b为酶切样本。从图7中可以看出原始样本和酶切样本的在每个染色体上信号值基本一致，说明原始样本和酶切样本定位到每条染色体上的uniquereads数基本一致。将编号为5的原始样本和酶切样本选择3号染色体进行分析，将3号染色体分为4000个窗口，其中每个窗口为100kb的片段大小，结果如图8中显示，原始样本和酶切样本在整个窗口中，深度信号值分布基本一致。
实施例2
在实施例1的基础上，增加9份游离dna作为原始样本，编号2-10，进行实施例1中步骤5-6处理，9份原始样本各取2ng进行实施例1中步骤2-6处理，使用引物及各种反应条件参照实施例1。
图4-图6显示原始1-10号样本10样本经步骤5-6处理(组1)及步骤2-6处理(组2)后在重复率、比对率、覆盖度方面结果：经welch‘st-test检验，t＝0.69842,df＝11.151,p-value＝0.4992，在测序序列重复率上两组结果无显著差异，对原始样本dna进行有效复制(图4)；经welch‘st-test检验，t＝0.80577,df＝15.614,p-value＝0.4325，在测序序列比对率上两组结果无显著差异，说明原始样本与酶切样本两组在测序数据利用率上基本一致(图5)；经welch‘st-test检验t＝0.54633,df＝16.409,p-value＝0.5922，在测序序列覆盖度上两组结果无显著差异(图6)。
实施例3
2.dna模板分子预处理
1)取2ng人类基因组超声打断dna片段成200bp左右的片段(样本编号a1)，安捷伦2100检测a1号样本，结果显示a1号样本dna片段主要分布在171bp(图7)，进行末端修复反应，反应体系及条件如下：
20℃温浴30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于32μl的eb中，得到平末端dna片段。
2)利用末端加a体系将平末端dna片段3'末端加a。末端加a反应体系及反应条件为：
37℃，30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于25μl的eb中，得到3'端加a的dna片段。
3)使用接头链接体系将具有3't末端的接头分子连接到3'端加a的dna片段dna片段上，接头连接反应体系为：
20℃反应15分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于23μl的eb中，得到加接头dna片段。
3.扩增
使用上步的加接头dna片段作为模板，使用扩增引物a、引物b进行扩增，获得大量带有的扩增产物分子。
使用尿嘧啶抵抗pcr反应体系对dna分子进行扩增引入尿嘧啶，反应体系及条件如下：
pcr反应条件：
反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于50μl的eb中，获得带有脱氧尿嘧啶的pcr产物。安捷伦2100检测片段大小，结果显示带有脱氧尿嘧啶的pcr产物大小主要分布在241bp左右(图8)。
4.末端接头切割及产物回收
1)使用user酶切割尿嘧啶位点尿嘧啶:
37℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，溶于30μl的eb中，获得具有缺刻的dna片段。
2)使用s1核酸酶切具有缺刻的dna片段，将接头彻底切断，反应体系及反映条件如下：
30℃反应30分钟，反应结束后使用1.8×ampure磁珠回收纯化反应体系中的dna，至此获得了复制产物，即可利用dna片段。
5.dna片段大小检测
使用安捷伦2100检测可利用片段及原始样本片段大小，结果显示该复制产物的片段大小分布在171bp左右(图9)。
图9显示a1号样本dna片段大小主要分布在171bp左右，图10显示扩增后片段大小分布在241bp左右，图11显示复制产物的大小主要分布在171bp左右，该结果与预期结果基本相同。
图9显示a1号样本dna片段大小主要分布在171bp左右，该片段大小为提出的打断的dna的片段大小。图10显示扩增后片段大小主要分布在241bp左右，该结果为经过加接头及pcr扩增后在1号样本长度基础上延长66bp，理论上扩增后的扩增产物长度为237bp左右，实际检测的结果片段大小主要分布在241bp左右，检测结果在波动范围之内，说明pcr扩增步骤成功的引入了脱氧尿嘧啶标记的引物，获得了具有脱氧尿嘧啶标记的pcr产物。图11显示复制产物的大小主要分布在171bp，复制产物的片段大小与原始样本(1号样本)dna片段大小一致，表明复制产物为pcr产物成功切割接头。
上述说明示出并描述了本发明的优选实施例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。
序列表
<110>安诺优达基因科技（北京）有限公司
<120>用于dna片段的非特异性复制的方法及试剂盒
<130>1601-1rccn
<160>10
<170>patentinversion3.3
<210>1
<211>1+a+b+t
<212>dna
<213>人工序列
<400>
5'-at(n)a(n)b-3'1+a+b+t
<210>2
<211>1+a+c
<212>dna
<213>人工序列
<400>
((n)c(n)'at1+a+c
<210>3
<211>1+a+b+e+k
<212>dna
<213>人工序列
<400>
(n)e(n)'b(n)'au(m)k1+a+b+e+k
<210>4
<211>1+a+c+f+g
<212>dna
<213>人工序列
<400>
(n)f(n)c(n)'au(m)g1+a+c+f+g
<210>5
<211>1+a+b+e
<212>dna
<213>人工序列
<400>
(n)e(n)'b(n)'at1+a+b+e
<210>6
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>引物a
gctcgttagatcgtcgtgtaggctaccagtgt32
<210>7
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>引物b
cagtggacttcagacgtgtgatctaacgagct32
<210>8
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>引物a'
acactggtagcctacacgacgatctaacgagct33
<210>9
<211>33
<212>dna
<213>人工序列
<400>引物a
acactggtagcctacacgacgatctaacgagcu33
<210>10
<211>32
<212>dna
<213>人工序列
<400>引物b
cagtggacttcagacgtgtgatctaacgagcu32