本发明涉及一种小分子硫酯酶的表达方法及应用，具体涉及一种小分子蛋白硫酯酶在大肠杆菌中的重组表达及其在生产一种10-羟基-2-癸烯酸中间产物反式-2-癸烯酸中的应用，属于生物技术领域。
背景技术：
硫酯酶广泛存在于原核和真核生物中，其功能在不同的生物体中差异很大，但是都发挥着重要的作用，硫酯酶一般催化脂肪酸链的终止，水解脂酰基-s-酰基载体蛋白质的硫酯键，释放自由脂肪酸。硫酯酶的分类有多种方式，其中有一种分类是分为同初级代谢相关的乙酰辅酶a(acyl-coa)硫酯酶和同次级代谢相关的硫酯酶。本发明利用β氧化的前两步，形成反式双键后，采用大肠杆菌酯酰辅酶a(acyl-coa)硫酯酶脱掉辅酶a，从而使反式脂肪酸释放出来。但是大肠杆菌酯酰辅酶a(acyl-coa)硫酯酶由于其蛋白分子量较小，其表达也比较困难。
10-羟基-2-癸烯酸(10-hydroxy-2-decenoicacid,10-hda)是一种含有羟基的单不饱和脂肪酸，分子式为c10h18o3。迄今为止，自然界中仅从蜂王浆及蜂胶中发现，因此又称王浆酸。研究表明10-hda具有抗菌、免疫调节及抗氧化，抗肿瘤，降低血糖等多种重要的生理功能，具有极高的医药和保健价值，应用前景十分广泛。该化合物结构如下：
鉴于10-hda广泛而重要的应用价值，寻找10-hda高效方便、低成本生产方法的研究被广泛重视。目前10-hda的获得方法主要有物理提取法、化学合成法。其中物理提取法来源单一，蜂王浆中10-hda含量仅为1.4％-2.4％，因此产量小，无法满足市场需求。而化学合成法虽然可以满足产业需求，但其操作步骤较冗繁，且化学试剂具有一定的毒性。因而探索10-hda高效方便、低成本的合成方法，对其大规模开发和利用具有重要的理论和应用价值。近年来微生物发酵合成法生产10-hda已经成为研究者及该行业的新目标。从结构式可以看出，10-hda与反式-2-癸烯酸的区别在于10号位的羟基，反式-2-癸烯酸是10-hda生产过程中一个重要的中间物。其化学结构式如下：
技术实现要素：
本发明针对现有技术的不足，提供了一种小分子硫酯酶的表达方法及应用，将大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii连接到含有sumo标签的pet-28a质粒上，转入大肠杆菌bl21(de3)，利用重组大肠杆菌(含pet-28a-ydii)，通过无细胞体系生产反式-2-癸烯酸。
本发明的技术方案如下：
一种小分子硫酯酶的表达方法，包括步骤如下：
(1)以大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii为模板进行pcr扩增，上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；
(2)将步骤(1)扩增的ydii基因片段和含有sumo标签的质粒pet-28a用bamhi和xhoi分别进行双酶切，经连接酶连接得含有sumo标签的重组质粒pet-28a-ydii；
(3)将步骤(2)的重组质粒pet-28a-ydii转入大肠杆菌bl21de(3)，筛选阳性重组大肠杆菌，诱导表达得融合型硫酯酶；
(4)将步骤(3)融合型硫酯酶通过sumo蛋白酶i对硫酯酶和sumo标签蛋白进行分离，最终获得高纯度小分子硫酯酶。
所述步骤(1)中大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii的核苷酸序列如seqidno.3所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。
根据本发明优选的，步骤(1)中pcr扩增体系为：100μm上游引物1.0μl，100μm下游引物1.0μl，模板1.0μl，5u/μlhifi酶12.5μl，ddh2o9.5μl，共25μl。
根据本发明优选的，步骤(1)中pcr扩增条件为：95℃预变性5min；95℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸30s，循环30次；72℃延伸10min。
根据本发明优选的，步骤(3)中筛选阳性菌株的方法为：采用菌落pcr鉴定和蛋白表达及可溶性鉴定，将鉴定结果为阳性的菌株再进行测序鉴定。
一种小分子硫酯酶的应用，其特征在于，发酵培养上述阳性重组大肠杆菌，诱导表达后收集菌体，超声破碎菌体细胞，向破碎菌液中加入癸烷，35～40℃条件下利用无细胞体系生产反式-2-癸烯酸。
根据本发明优选的，上述诱导表达为：将活化的重组大肠杆菌接入100ml含有相应抗生素的液体培养基中，35～40℃振荡培养至菌液od600为0.8～1.2时，降温至14～20℃适应0.5～2小时后加入终浓度为0.5～0.8mm的iptg、2～5％的癸烷、0.2～0.5％的吐温80，过夜培养。
进一步优选的，上述诱导表达为：将活化的重组大肠杆菌接入100ml含有卡那霉素的液体培养基中，37℃振荡培养至菌液od600为1.0时，降温至16℃适应1小时后加入终浓度为0.64mm的iptg、3％的癸烷、0.3％的吐温80，过夜培养。
有益效果：
1、本发明所用的硫酯酶基因ydii只有411bp，蛋白约15kd，但是小分子蛋白的表达比较困难，sumo标签能够提高融合蛋白的表达量及可溶性，促进目标蛋白正确折叠，抵抗蛋白酶的水解，选择具有sumo标签的质粒来表达小分子硫酯酶，具有极大的促进作用。
2、本发明获得的融合型硫酯酶可以通过sumo蛋白酶i对目标蛋白和somo标签蛋白进行分离，sumo蛋白酶i能识别完整的sumo标签蛋白序列，并能高效地把sumo标签蛋白从融合型蛋白上切割下来，最终获得高纯度小分子硫酯酶。
3、本发明利用含有硫酯酶的阳性重组大肠杆菌(含pet-28a-ydii)，通过无细胞体系发酵生成反式-2-癸烯酸，可进一步用于10-羟基-2-癸烯酸的生产。
附图说明
图1为pcr扩增产物琼脂糖凝胶电泳图，
其中，m为marker，从上至下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-6均为硫酯酶基因ydii的pcr扩增产物样品；
图2为菌落pcr产物琼脂糖凝胶电泳图，
其中，m为marker，从上至下依次为：5000bp，3000bp，2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp；1-8为挑取的不同的单菌落pcr扩增产物样品；
图3为融合蛋白表达产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)图，
其中，m为蛋白marker，从上至下依次为：75kd，63kd，48kd，35kd，25kd；1为含sumo标签的pet-28a-ydii重组质粒蛋白表达产物，方框内为目的蛋白；2为为含sumo标签的pet-28a-gnal重组质粒蛋白表达产物，方框内为目的蛋白。
图4为切掉sumo标签后获得的小分子硫酯酶的聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)图，
其中，m为蛋白marker，从上至下依次为：63kd，48kd，35kd，25kd，11kd，1-2为检测样品，方框内为目的蛋白；
图5为发酵产物气质联用色谱图，
其中，12号峰为反式-2-癸烯酸；
图6为反式-2-癸烯酸质谱图；
图7为不含sumo标签的pet-28a-ydii重组质粒蛋白表达产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)图，
其中，m为蛋白marker，从上至下依次为：75kd，63kd，48kd，35kd，25kd，17kd，11kd；
图8为不含sumo标签的pet-28a-gna1重组质粒蛋白表达产物的聚丙烯酰氨凝胶电泳(sds-page)图，
其中，m为蛋白marker，从上至下依次为：75kd，63kd，48kd，35kd，25kd，17kd，1-2为不含sumo标签的pet-28a-gna1重组质粒表达载体，方框内为目的蛋白。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的内容作进一步阐述，但本发明保护内容并不仅局限于此。实施例中未作详细说明的操作方法均为本领域技术人员公知的常规操作方法。
本发明中所用的试剂及药品均为普通市售产品。
实施例1：大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii的pcr扩增
根据大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii设计pcr扩增引物，上游引物的核苷酸序列如seqidno.1所示，下游引物的核苷酸序列如seqidno.2所示；
其中，大肠杆菌酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii的核苷酸序列如seqidno.3所示，表达的小分子硫酯酶的氨基酸序列如seqidno.4所示。
使用上述引物进行pcr扩增，反应体系如下：
pcr反应条件如下：
pcr产物回收：
pcr扩增结束后通过1％的琼脂糖凝胶电泳分析片段长短，结果如图1所示，根据片段大小切下目的条带，使用上海生工生物工程股份有限公司的dna胶回收试剂盒回收pcr产物。
实施例2：重组质粒pet-28a-ydii的构建
实施例1中回收的pcr产物及含有sumo标签的pet-28a质粒载体的双酶切反应，反应体系如下：
反应条件：37℃反应1.5h。
pcr产物和质粒载体双酶切后经1％琼脂糖凝胶电泳纯化，并使用dna胶回收试剂盒进行目的片段回收。
将经过酶切的pcr产物与同样经过酶切的质粒载体连接，连接反应体系如下：
将上述连接反应体系充分混匀后离心数秒，将管壁液滴收到管底，16℃连接过夜，得重组质粒pet-28a-ydii。
实施例3：重组质粒pet-28a-ydii的转化：
(1)感受态细胞的制备
①挑取大肠杆菌bl21(de3)单菌落(或挑取保存菌种)接种至10ml液体lb培养基，37℃、210rpm过夜培养；
②取5ml菌液接种于500mllb培养基中，37℃、210rpm培养至菌液od600为0.375左右；
③将菌液放置于冰水混合物上10min，同时预冷50ml离心管；
④将菌液转移到离心管中，4℃，3700rpm离心10min收集菌体；
⑤每个离心管中加入10ml预冷的0.1mcacl2溶液，重悬菌体，再加入30ml预冷的0.1mcacl2溶液，颠倒混匀，冰上静置20min；
⑥4℃，3700rpm离心10min收集菌体，按照与步骤④中菌液的体积比为3：125的比例加入预冷的含有15％甘油的0.1m的cacl2溶液，重悬菌体，得感受态细胞；
⑦将感受态细胞分装，并于-80℃冻存。
(2)重组质粒的转化
①将10μl重组质粒pet-28a-ydii加入到100μl新鲜制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴30min；
②42℃热激90s，然后迅速置于冰浴中冷却3min；
③将上述感受态细胞接入到500μllb培养基，37℃，200rpm振荡培养60min；
④取上述菌液200μl，涂布于带有50mg/ml卡那霉素的lb固体培养基；
⑤37℃培养箱中正置30min，待菌液被吸干后，倒置平板于37℃培养12-16h。
(3)阳性克隆的鉴定：
①菌落pcr鉴定
挑取上述培养出的单菌落至1ml含有卡那霉素的lb培养基，37℃、200rpm振荡培养6-8h，吸取1μl菌液，按照20μlpcr反应体系，进行菌落pcr鉴定，由于酯酰辅酶a硫酯酶基因ydii为大肠杆菌基因，故菌落pcr验证卡那霉素抗性基因，鉴定结果如图2所示，出现目的条带且条带单一的，显示菌落为阳性克隆。
②蛋白表达及可溶性鉴定
取上述菌液900μl，并加入终浓度为0.64mm的iptg，诱导表达4h，12000rpm离心1min，收集菌体，加入2倍上样缓冲液，重悬菌体，100℃水浴变性10min，用sds-page检测蛋白表达，结果如图3所示，显示为阳性克隆。
③菌样测序
将用以上两种方法鉴定后的阳性克隆，送至测序公司进行测序，进一步证明构建的阳性克隆的正确性。
实施例4：小分子硫酯酶的表达
(1)菌种活化：将实施例3中的阳性重组大肠杆菌以1％的接种量接种至50ml的含有卡那霉素的液体lb培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；
(2)菌体转接：取上述活化菌株1ml接入100ml含有卡那霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液od600为1.0时，降温至16℃适应1小时后加入终浓度为0.64mm的iptg过夜诱导表达；
(3)收集菌体：取上述菌液100ml，50000rpm，4℃离心15min，收集菌体，加入20ml20mm的磷酸盐缓冲液(ph7.0)重悬菌体；
(4)超声破碎菌体细胞：超声4s，间隔6s，400w，工作20min；
(5)通过sumo蛋白酶i对目标蛋白和sumo标签蛋白进行分离，并且由于sumo标签蛋白和sumo蛋白酶i都具有组氨酸标记，在通过层析柱时两者均可被吸附，达到一次洗脱得到目标蛋白的效果，最终获得高纯度小分子硫酯酶，用sds-page检测目标蛋白，结果如图4所示，条带单一，且分子量正确。
实施例5：小分子硫酯酶的应用
(1)菌种活化：将实施例3中的阳性重组大肠杆菌以1％的接种量接种至50ml的含有卡那霉素的液体lb培养基中，在37℃、200rpm振荡培养12h；
(2)菌体转接：取上述活化菌株1ml接入100ml含有卡那霉素的液体培养基中，37℃、200rpm振荡培养至菌液od600为1.0时，降温至16℃适应1小时后加入终浓度为0.64mm的iptg、3％的癸烷、0.3％的吐温80，过夜诱导表达；
(3)收集菌体：取上述菌液100ml，5000rpm，4℃离心15min，收集菌体，加入20ml20mm的磷酸盐缓冲液(ph7.0)重悬菌体；
(4)超声破碎菌体细胞：超声4s，间隔6s，400w，工作20min；
(5)向破碎菌液中加入3ml癸烷，37℃培养12h，得发酵液。
发酵液甲酯化处理：取2ml发酵液于具塞试管中，在氮气保护下加入2ml三氟化硼-甲醇溶液，振荡混匀，100℃水浴15min后，取出冷却至室温后加入正己烷，摇匀加蒸馏水，振荡，离心分层；取上层液体稀释后经无水硫酸钠干燥后备用。
气质联用检测生成产物：气质联用以氦气为载气，恒流模式，进样体积1ul，分流进样，分流比为1：50，进样温度250℃，100℃保持2min，以5℃/min升至140℃，保持10min，以5℃/min升至170℃，以20℃/min升至240℃。产物的色谱图如图5所示，其中12号峰为反式-2-癸烯酸，反式-2-癸烯酸的质谱图如图6所示。
对比例1：
与实施例1-3的试验步骤相同，不同的是所用质粒载体不含有sumo标签，采用菌落pcr扩增及质粒测序鉴定重组质粒构建正确，采用蛋白表达及可溶性鉴定，用sds-page检测蛋白表达，结果显示并没有目标蛋白表达(图7)。
对比例2:
利用pet-28a表达了一种乙酰氨基葡萄糖合酶(gna1)，该酶的大小为18kd，蛋白电泳结果如图8所示。继而采用含有sumo标签的质粒载体表达了该酶，通过琼脂糖凝胶电泳检测检测蛋白表达量，发现与不含sumo标签的表达量并无增加。证明该含有sumo标签的质粒载体对本发明中小分子硫酯酶的促进作用显著高于其他小分子酶的促进作用。
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