本发明涉及聚乙二醇修饰的蛋白类药物，特别是聚乙二醇修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法和其在药物制备中的应用。
背景技术：
精氨酸是人体的一种非必需氨基酸，可以经尿素循环获得，而精氨酸缺陷型肿瘤因缺少ass(argininosuccinatesynthetase)所以细胞无法合成精氨酸，因此其生长需要从外部环境中摄取精氨酸。经研究表明，精氨酸脱亚胺酶(argininedeiminase,ec3.5.3.6，简称adi)能够降解环境中的精氨酸，从而抑制这些精氨酸缺陷型肿瘤的生长，达到杀死癌细胞治疗癌症的目的。这种新型的“精氨酸剥夺疗法”可以用于某些精氨酸营养缺陷型癌细胞的治疗，例如肝癌细胞和黑素瘤细胞。
adi广泛存在于细菌和真核细胞内，自从1933年f.horn首次报道了绿脓假单胞菌(pesudomonaspyocyaneum)中含有adi后，之后很多来源于不同微生物的adi相继被报道，包括假单胞菌、支原体、盐杆菌和乳球菌等。来源于不同微生物的adi在酶活及性质方面差别较大，最适反应ph范围在5.6到7.6之间，大多数在酸性范围内；分子量范围从47kda到199kda，多为同源二聚体，部分为同源四聚体；比酶活范围从5.4到140.27u/mg。
自1990年日本和美国的研究机构和公司开始对adi的抗肿瘤活性进行研究后，adi作为有效的抗肿瘤药物目前己经进入到临床研究阶段。但adi的体内半衰期较短，仅为4h左右，美国肯塔基大学和凤凰制药公司的研究人员采用聚乙二醇(sspeg20000)对来源于支原体的adi进行化学修饰，随后进行体内外抗肿瘤活性试验，成功延长了adi在小鼠体内的半衰期，并且经过adi-sspeg20000治疗后，荷瘤小鼠的存活率得到了极大的提高。2009年，美国凤凰公司与北极星集团合作研发了标靶药物adi-peg-20，但adi-peg-20产品中所使用的peg是琥珀酰亚胺琥珀酸酯(ss-peg)，修饰产物不均一，活性损失较大，含有对酶水解敏感的或者在微碱性ph值时不稳定的酯键(美国专利号4670417)。这些性质显著降低了adi-peg-20产品体外和体内的稳定性并且副作用也较大。
目前针对adi的聚乙二醇修饰研究也有很多。但大部分采用的是peg对adi进行随机修饰，修饰adi赖氨酸残基上的氨基，因此修饰产物不均一，活性损失较大。为了提高修饰产物的活性，有人采用添加保护剂的方法，让保护剂先和adi的活性中心结合，然后再进行peg修饰，修饰后再去除结合的保护剂，这种方法制备得到的修饰产物，虽然活性保留较好，但操作步骤繁琐，不适合产业化放大。
技术实现要素：
解决的技术问题：为了克服现有技术中的上述技术问题，本发明旨在提供稳定性提高、免疫原性降低、组分均一的基础上，也具有高活性的聚乙二醇定点修饰的adi。
更进一步的说：
本发明的第一目的是提供聚乙二醇定点修饰的adi，所述聚乙二醇在adi的1或2个亚基的n端氨基上偶联，所述聚乙二醇分子量为30-40kda，聚乙二醇为分支型。
优选的，所述聚乙二醇在adi的2个亚基的n端伯氨基上偶联。
优选的，所述聚乙二醇分子量为30kda或40kda。更优选的，所述聚乙二醇优选分子量40kda。
优选的，聚乙二醇活化基团为醛基。更优选的，活化基团为乙醛、丙醛、丁醛或戊醛。
所述聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶的结构通式如下所示：
其中r为h或c1-c4的烷基；n为100到500的整数值，p为1-4的整数；aa为n端的l-氨基酸残基，m为0-5的整数，s为1-2。
优选地，所述烷基为甲基，n为320-455之间的整数值，p为2，m为0。
优选的，所述聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶的结构通式还可以如下所示：
其中z为选自烃基或含有醚键，酰胺键，氨基甲酸酯键的烃基，n1,n2,n3为1-1000。
a为n端的l-氨基酸残基，m为0-5的整数，s为1-2。
本发明的第二目的是提供一种上述的聚乙二醇定点修饰的adi的制备方法，包括如下步骤：步骤1，用40-100mmph4-6的乙酸-乙酸钠缓冲液配制5-30mg/ml的adi溶液；步骤2，按摩尔比精氨酸脱亚胺酶:聚乙二醇:还原剂＝1:(4-10):(500-1000)在4-20℃的条件下反应12-24h；步骤3，反应结束后以离子交换色谱法纯化处理，最终得到单修饰及二修饰的聚乙二醇化的adi。
修饰用的adi的氨基酸序列如seqidno:2所示，其可以是任何来源的，包括从支原体中提取或从甲单胞菌中提取，也可以是重组表达的。优选大肠杆菌重组表达的。
本发明的第三目的是提供聚乙二醇定点修饰的adi或其药学上可接受的盐或复合物。所述复合物是指两种或两种以上不同物质所形成的结合体。
本发明的第四目的是提供药物组合物，所述药物组合物含有上述聚乙二醇定点修饰的adi或其药学上可接受的盐或复合物和药学上可接受的辅料。
所述药物组合物为液态针剂或冻干粉针剂。
所述的辅料包括药学上可接受的载体和/或赋形剂等。
所述定点修饰的adi及其药物组合物通过肌肉、静脉或皮下途径给药。
本发明的第五目的是提供上述聚乙二醇定点修饰的adi、其药学上可接受的盐或复合物、含有聚乙二醇定点修饰的adi的组合物在制备治疗精氨酸缺陷型肿瘤疾病的药物中的应用。所述精氨酸缺陷型疾病如原发性肝癌、黑色素瘤、肾癌、间皮瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、乙肝、丙肝、急性髓细胞白血病、恶性毒瘤、前列腺癌、非霍奇金淋巴瘤等。
有益效果：本发明提供的聚乙二醇定点修饰的adi，在具有结构稳定均一、长效等优点的基础上，更大程度的保留了其生物活性。
附图说明
图1a：y-pald-40k-adi纯度分析色谱图
图1b：y-cho-40k-adi纯度分析色谱图
图2a：y-pald-40k-adi电泳图
图2b：y-cho-40k-adi电泳图
图2c：m-ss-20k-adi电泳图
图3：肽图分析图
图4：内源荧光图
图5：粒径检测分析图
具体实施方式
定义：
本发明使用的缩写含义如下：
peg，聚乙二醇；peg修饰剂，聚乙二醇修饰剂。
聚乙二醇(peg，ho-(ch2ch2o)n-ch2ch2oh)是一种两端带羟基的线型聚合物，聚乙二醇是经环氧乙烷聚合而成的，由重复的氧乙烯基组成，有分支型，直链型和多臂型。peg也被称为poly(ethyleneoxide)(peo)，poly(oxy-ethylene)(poe)，或者polyoxirane。一般情况下，分子量低于20,000的被称为peg，分子量更大的被称为peo。普通的聚乙二醇两端各有一个羟基，若一端以甲基封闭则得到甲氧基聚乙二醇(mpeg)，这种衍生物是蛋白质聚乙二醇化技术中最常用到。
聚乙二醇修饰剂，则是指带有官能团的聚乙二醇衍生物，是指经过活化的聚乙二醇，目前主要用于蛋白质以及多肽药物修饰，又叫修饰性聚乙二醇，修饰性peg。
y-pald-40k，分子量为40kda的“v”型分支聚乙二醇丙醛，结构通式为
y-cho-40k，分子量为40kda的“y”型分支聚乙二醇丙醛，结构通式为
其中z为选自烃基或含有醚键，酰胺键，氨基甲酸酯键的烃基，n1,n2,n3为1-1000。
adi，精氨酸脱亚氨酶。
本申请中所用，术语“偶联物”，是指聚乙二醇修饰精氨酸脱亚胺酶后得到的修饰产物。
y-pald-40k-adi：用y-pald-40k修饰adi后纯化得到的修饰产物，两个亚基的n端都偶联了peg。
y-cho-40k-adi：用y-cho-40k修饰adi后纯化得到的修饰产物，两个亚基的n端都偶联了peg。
m-ss-20k-adi：用m-ss-20k修饰adi后纯化得到的修饰产物。
在本发明中，所修饰的adi是同源二聚体，可以是任何来源的，可从支原体中提取，可从甲单胞菌中提取，也可以是重组表达的。在本发明的偶联物的特定实施方式中，adi亚基与包含seqidno:2的序列的蛋白具有至少约60％的序列一致性。
优选的本发明的adi为由大肠杆菌重组表达制备得到重组adi(即radi)。具体制备方法如下：
将优化得到的如seqidno：1所示adi碱基序列构建到原核表达质粒(优选为pet28a)中，并将该重组质粒转入大肠杆菌菌株(优选为bl21(de3))中。经过发酵种子活化、发酵种子液制备。以及高密度发酵包括如下步骤：
1、将二级种子液按照5-15％的接种量接入到含灭菌后的分批发酵培养基发酵罐中。所述分批发酵培养基成分包括：一水合柠檬酸0.5-3g/l，磷酸二氢钾8-15g/l，磷酸氢二铵3-7g/l，葡萄糖10-20g/l，七水合硫酸镁2.5-3g/l。在发酵接种之前还要向分批发酵培养基中加入1/1000(v/v)的微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。所述微量元素母液成分包括：feso4.7h2o10g/l、znso4.7h2o2.25g/l、cuso4.5h2o15g/l、mnso4.5h2o5g/l、cacl2.7h2o1g/l、cocl2.6h2o1g/l、na2moo4.2h2o1.125g/l、h3bo30.0625g/l、hcl41.75ml、biotin0.5g/l。
设定发酵温度为37℃、ph为7.0-7.2之间、do设定在30-35％之间。
2、发酵开始后定期取样进行od600和菌体湿重的测定，待do曲线出现急剧上升并且伴随温度下降和ph上升的时候表明分批培养基中葡萄糖耗尽，开始进行补料培养。补料培养基主要成分包括：甘油1024g/l，七水合硫酸镁10-20g/l，在补料开始之前还要补料培养基中加入1/1000(v/v)的上述微量元素母液用于维持菌体正常生长和代谢。
所述补料培养基的流加速度维持在25-30g/h之间。
3、待菌体生长至od600≈45-55之间向发酵罐中加入终浓度为0.4-1.0mm的iptg进行诱导表达；诱导表达4-6h结束培养。
上述发酵种子活化方法具体为：将构建好的radi大肠杆菌菌株冻存管划线接种到lb固体培养基中，37℃过夜培养进行活化。发酵一级种子液制备方法为：从固体培养基上挑取形状饱满、大小适中的单菌落接种到lb液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养8-10h，此为一级种子液。发酵二级种子液制备方法为：将一级种子液按照1％的接种量转接到新鲜的lb液体培养基中，37℃，220rpm摇床培养至od600≈3-5之间，此为二级种子液。
将上述诱导表达结束后的菌体破碎，并进行如下预处理：
1、菌体破碎收集后的radi包涵体固体颗粒使用bufferb(20-100mmtris-hcl,0.5-5mmedta，0.1-0.3mnacl，1mmpmsf，0.5-2％tritonx-100，ph＝8.0)重悬至10-25g/l，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；
2、将上步收集的radi包涵体使用bufferc(20-100mmtris-hcl，0.5-5mmedta，0.1-0.3mnacl，1mmpmsf，0.5-1.5％tritonx-100，3-4m脲，ph＝8.0)重悬至10-25g/l，室温搅拌处理5h，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次；
3、将上步收集的包涵体使用去离子水重悬至10-25g/l，室温搅拌处理30min，10000g/15min离心收集包涵体沉淀丢弃上清液，重复操作2次即得到预纯化后的radi包涵体。
将上述radi包涵体进行变性和复性，所采用的变性缓冲液bufferd主要组分包括：8-10m脲，20-50mmtris-hcl，8-10mmdtt，0-1mmedta，ph8.0-10.0；所采用的复性缓冲液buffere主要组分包括：8-12mmpb，0-1mmedta，0-10mmdtt，ph7.2。
再使用离子交换层析及疏水层析两步纯化法进行radi包涵体复性后样品的纯化，最终得到纯度近100％的radi样品。
实施例1peg定点修饰adi样品制备
制备例一，选用y-pald-40kpeg(购自北京键凯)作为修饰剂，还原剂使用氢基硼氢化钠(购自sigma)。离子交换色谱法进行分离。
1、修饰反应：
将纯化好的adi蛋白样品浓缩、置换修饰缓冲液(配比：100mm乙酸-乙酸钠，ph5.0)，浓度约为5mg/ml左右；按照adi:peg：还原剂摩尔比1:4：600称取peg，还原剂。修饰反应在4℃下进行，反应时间18小时。
2、修饰样品纯化
色谱法条件：流动相a为20mmpb(ph7.2)，流动相b为20mmpb含1mnacl(ph7.2)。
上样：上述修饰反应产物用a液稀释10倍后用双蒸水稀释5倍，10ml/min上样，结合至阴离子交换柱(购自ge公司，qsepharosehp)。
平衡，上样结束后，用a液冲洗3～5个柱体积。
洗脱，0-25％b液洗脱，洗脱体积为20个柱体积，分步收集样品y-pald-40k-adi。
制备例二，选用y-cho-40kpeg(购自厦门赛诺邦格)作为修饰剂，其他样品制备、纯化的步骤和参数和制备例一完全相同。制得样品y-cho-40k-adi。
选用上述两种peg修饰剂，调整其他修饰工艺参数，其它制备例如下表所示：
表1
实施例2：peg随机修饰adi样品的制备
选用m-ss-20kpeg(购自北京键凯)作为修饰剂离子交换色谱法进行分离。
1、修饰反应：
将纯化好的adi蛋白样品浓缩、置换修饰缓冲液(配比：100mm磷酸缓冲液，ph7.0)，浓度约为5mg/ml左右；按照adi:peg摩尔比1:50称取peg。修饰反应在4℃下进行，反应时间12小时。
2、修饰样品纯化
色谱法条件：流动相a为20mmpb(ph8.0)，流动相b为20mmpb含1mnacl(ph8.0)。
上样：上述修饰反应产物用a液稀释10倍后用双蒸水稀释5倍，10ml/min上样，结合至阴离子交换柱(购自ge公司，qsepharosehp)。
平衡，上样结束后，用a液冲洗3～5个柱体积。
洗脱，0-25％b液洗脱，洗脱体积为2个柱体积，收集洗脱样品m-ss-20k-adi。
实施例3：样品纯度检测
1色谱方法检测：
色谱法条件：hplc(waters，e2695hplc)，behsec4503.5μm(购自waters)，流动相为乙腈/水体系，流速为1ml/min，检测波长为280nm，进样量10μl，检测时间为20min。
分析结果见图1所示。结果显示y-pald-40k-adi及y-cho-40k-adi的纯度均高于98％。
2电泳方法鉴定
蛋白浓缩胶为8％，分离胶为7％。浓缩胶缓冲液为0.5mtris-hcl缓冲液(ph6.8)；分离胶缓冲液为1.5mol/ltris-hcl缓冲液(ph8.8)。取10ug蛋白样品，与样品缓冲液(10ml5×样品缓冲液配方：0.6ml1mtris-hcl(ph6.8)、5ml50％甘油、2ml10％sds、0.5mlβ-巰基乙醇、1ml1％溴酚蓝、0.9mlddh2o)等体积混合，在100℃下煮沸5min后上样运行，电泳结束后用考马斯亮蓝染液进行染色。y-pald-40k-adi、y-cho-40k-adi及m-ss-20k-adi鉴定结果分别如图2a、2b、2c所示，其泳道1为marker，泳道2为待鉴定修饰蛋白。
由鉴定结果可以看出，定点修饰样品y-pald-40k-adi及y-cho-40k-adi均一性较好，两种产物使用了相同分子量的peg进行修饰，因此样品条带位置基本一致；同时定点修饰的条带单一，说明adi的亚基上都已经偶联有peg。随机修饰样品m-ss-20k-adi的均一性显著弱于定点修饰样品。
实施例4：样品活性检测(体外降解精氨酸)
1.溶液的配制
1.110×缓冲液：精密称取磷酸二氢钠47.3g和磷酸氢二钠22.4g，加入水600ml溶解，调至ph6.5，加水定容至1l，混匀，过0.22μm滤膜。1.220mmol/l的精氨酸溶液：精密称取精氨酸0.3484g，加至100ml10×缓冲液中，混匀。1.3瓜氨酸标准液：精密称取瓜氨酸0.1752g，加入1000ml1×缓冲液中，配制1mmol/l的瓜氨酸溶液。取1mmol/l的瓜氨酸溶液50μl、100μl、200μl、400μl、600μl、800μl、1000μl稀释至1000μl(用1×缓冲液)，即得50μm、100μm、200μm、400μm、600μm、800μm、1000μm系列瓜氨酸标准液。
1.4反应终止液：准确量取磷酸18ml和硫酸6ml，混匀。
1.53％的二乙酰一肟溶液：准确量取二乙酰一肟3g，加入100ml1×缓冲液中，配制3％的二乙酰一肟溶液。
2.adi酶活检测方法
2.1样品稀释液：按照2中蛋白浓度，用1×缓冲液将样品稀释至10μg/ml。
2.2于2ml的离心管，取100μl样品稀释液，加入400μl20mmol/l的精氨酸溶液；空白对照中加入水，体积为0.5ml；于37℃下反应10min。
2.3于2ml的离心管中，分别取0.5ml不同浓度的瓜氨酸标准液(50μm、100μm、200μm、400μm、600μm、800μm、1000μm)，以水作为空白。
2.4在上述加入2.3～2.4离心管中，依次加入0.25ml反应终止液，0.05ml3％的二乙酰一肟溶液，混匀。
2.5将2.4中混匀好的溶液避光金属浴100℃加热显色5min后，即刻冷却至室温(用冰浴)，立即混匀取样，在490nm处测定吸光度值。
2.6将样品吸光度值代入瓜氨酸标准曲线中计算，最后按照下述计算公式得出样品的酶活。
活性测定的结果表明两种修饰蛋白的比活和原蛋白基本一致，都是25u/mg，说明定点修饰基本不影响adi的活性。而m-ss-20k-adi比活为13u/mg，只保留了原蛋白50％左右的活性，和文献报道的一致。
实施例5:定点修饰样品的位点鉴定
对修饰产物进行胰蛋白酶解，并通过rp-hplc检测酶解后的肽段。
具体操作方法如下：
1.取适量待检样品，以1:25(v/v)的比例加入2m的脲，室温下变性处理30min。
2.取上述混合液进行脱盐，置换到1％nh4hco3缓冲液(ph约7.8)中。
3.将置换后的样品稀释至约1.0mg/ml，取100μl，100℃加热5min。
4.向反应体系中加入2μg胰酶，37℃酶切16-24h。
5.终止反应：向反应体系中1:10(v/v)加入10μl的50％乙酸溶液终止反应。
6.同法制得相关样品的对照品及酶解空白(以等体积1％nh4hco3缓冲液代替胰酶)。
7.将上述酶解及酶解空白样品与12000rpm离心5min后取上清备用。
8.酶解样品rp-hplc检测，流速0.2ml/min，色谱梯度为
表2
流动相：a:0.1％tfa+水/乙腈(95:5，v/v)；b:0.1％tfa+水/乙腈(35:65，v/v)；
色谱柱：xbridgeproteinbehc4色谱柱(4.6×250mm,
9.样品依次进样，照上述色谱法条件检测并收集数据。
通过质谱分析确定图3中箭头所指的肽段即为n端肽段。
由图3可以看出，两种定点修饰产物的n末端肽段和原蛋白比较，都已消失。说明这两种修饰产物中，peg确实是偶联到了adi两个亚基的n末端氨基酸上，与预期结果一致。
实施例6：adi的修饰产物和adi原蛋白的内源荧光图谱分析
修饰蛋白以及未修饰蛋白的内源荧光检测的激发波长为280nm，发射波长范围为290～450nm。扫描速度为1200nm/min。激发和发射的缝隙宽度(slitwidths)均为5nm，使用0.1cm的样品池，在室温下进行检测。待测蛋白质的浓度范围是0.2mg/ml。
通过内源荧光(intrinsicfluorescence)来检测peg修饰对adi原蛋白高级结构的影响。如图4所示，当激发波长为280nm时，adi及其两种不同peg修饰产物的发射荧光峰值均在337nm处。这表明本发明所使用的两种peg对adi蛋白的修饰均不影响其三级结构。
实施例7：peg-adi和adi原蛋白的粒径分析
使用malvernzetasizernanozs90纳米粒径点位分析仪(购自malvern)，检测修饰蛋白以及未修饰蛋白的粒度分布。采用动态光散射法，90度散射角，检测布朗运动下移动颗粒的扩散情况，并用斯托克斯-爱因斯坦关系将其转化为粒度与粒度分布。
修饰蛋白及未修饰蛋白浓度均为4mg/ml，测量温度为25℃，分散系为水，检测模型为smoluchowsi模型，平衡时间20s，检测池中样品加量为200μl，检测循环3遍，每遍进行100次散射扫描。
检测结果如下图5所示。经过软件计算，adi，y-cho-40k-adi、y-pald-40k-adi和m-ss-20k-adi四个样品的粒径分别是7.9nm,22.4nm,21.1nm,18.59nm，说明adi原蛋白经过peg修饰以后，蛋白的粒径有了显著提高。另外，两种peg样品的粒径也有一定差别，y-cho-40k-adi的稍大。分析其原因，可能和所使用的peg的结构有关系，y-cho-40k-adi所使用的是“y”型peg，而y-pald-40k-adi使用的是“v”型peg，相同分子量的peg，y”型peg能够更好的覆盖在adi的表面，因此粒径更大。而随机修饰的adi，其粒径小于两种定点修饰的产品。
实施例8：peg修饰的adi的稳定性研究
将adi，y-cho-40k-adi，y-pald-40k-adi和m-ss-20k-adi分别用tris-hcl(8.0)的缓冲液稀释到1mg/ml。放入60℃水浴锅中，分别于一定时间取样，并检测其酶活性。活性测定结果显示经过水浴处理30分钟时，adi的活性基本完全损失，活性基本为零，并且有沉淀产生。y-cho-40k-adi，y-pald-40k-ad两种样品的稳定性较好，在处理1小时后仍保留了水浴前70％左右的活性，随后的2，3小时活性依然保留70％左右，而m-ss-20k-adi在处理1小时后保留了水浴前50％左右的活性，在2，3小时后活性下降显著，只保留了20％的活性。说明定点修饰样品的稳定性显著高于随机修饰样品。
实施例9：adi以及修饰产物的体外药效评价
(1)体外抑制肝癌细胞(hcc)增殖实验
收获处于对数生长期的hcc细胞，包括hcclm3、snu-368、hep3b、jhh-7、hle、snu-354等细胞株，用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μl细胞悬液至96孔板，培养至贴壁。药物经稀释后，将被测化合物和参照药在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行细胞增殖抑制的检测。
表1的结果显示，adi、m-ss-20k-adi、y-cho-40k-adi和y-pald-40k-adi对hcclm3、jhh-7和hle等五株肝癌细胞有较明显的抑制作用，而对另外三株肝癌细胞抑制效果较弱，ic50高于其最高给药浓度；其中，adi，y-cho-40k-adi和y-pald-40k-adi对细胞的抑制效果相近，均显著优于m-ss-20k-adi。但考虑到adi原蛋白体外稳定性显著弱于修饰产物，因此可以合理推测其在体内的药效会显著弱于经过peg修饰的样品。
根据adi的作用原理，其对于不能自身合成精氨酸的肿瘤细胞有显著抑制作用，但并不是所有肿瘤细胞都是精氨酸酶缺陷型，因此可以推测下表列出的3个体外抑制作用不明显的肿瘤细胞，不是精氨酸酶缺陷型，能够自身合成精氨酸，因此adi对其没有显著抑制作用。
表3.对hcc细胞的抑制情况
(2)体外抑制黑色素瘤(melanoma)增殖实验
收获处于对数生长期的melanoma细胞，包括a2058、a875、wm-266-4、a375等细胞株，用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μl细胞悬液至96孔板，培养至贴壁。药物经稀释后，将被测化合物和参照药在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行细胞增殖抑制的检测。
和肝癌细胞的体外抑制结果类似，adi、m-ss-20k-adi、y-cho-40k-adi和y-pald-40k-adi对六株黑色素瘤细胞均有较明显的抑制作用，其中，adi，y-cho-40k-adi和y-pald-40k-adi对细胞的抑制效果相近，均显著优于m-ss-20k-adi。具体结果如表4所示。
表4.对melanoma细胞的抑制情况
(3)体外抑制肾癌细胞(rcc)增殖实验
收获处于对数生长期的rcc细胞，包括g401和sk-nep-1等细胞株，用完全培养液稀释调整细胞浓度，添加90μl细胞悬液至96孔板，培养至贴壁。药物经稀释后，将被测化合物和参照药在已接种细胞的96孔板中每孔加入10μl药物溶液，每个细胞浓度设置三个复孔。将已加药的96孔板中的细胞置于37℃、5％co2、95％湿度条件下继续培养3天，分别进行细胞增殖抑制的检测。
结果显示，4种样品对g401没有显著抑制作用，但对sk-nep-1细胞均具有较明显的抑制作用。adi，y-cho-40k-adi和y-pald-40k-adi对细胞的抑制效果相近，均显著优于adi-peg-ss20。具体结果如表3所示。
表5.对rcc细胞的抑制情况
由上述三个体外药效试验结果可知，本申请的peg定点修饰的adi的活性不仅仅比peg随机修饰的adi活性高，而且基本保留了原蛋白的活性，对肿瘤细胞的抑制增值效果与原蛋白相当，甚至还优于原蛋白。而一般来说peg修饰后蛋白药物与原蛋白相比，活性都会有显著的下降，得到本申请这样的结果是出乎本领域技术人员认知范围的，具有较高的创新性。
序列表
<110>江苏众红生物工程创药研究院有限公司
<120>聚乙二醇定点修饰的精氨酸脱亚胺酶及其制备方法与应用
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