本发明涉及多肽提取
技术领域：
，具体涉及一种土鳖虫多肽的制备方法及其制备得到的土鳖虫多肽的应用。
背景技术：
：土鳖虫为鳖蠊科昆虫地鳖或冀地鳖的雌虫干燥体，主产福建、河北、陕西、甘肃、青海、山东、河南、江苏、浙江、湖南等地，具有破血逐瘀，续筋接骨之功效，是一种重要的传统中药。其生物体内含有多种活性蛋白、氨基酸、不饱和脂肪酸、微量元素、生物碱和脂溶性维生素等物质，现在药理研究表明土鳖虫具有溶栓、抗凝血、抗肿瘤、调节血脂等作用。目前，活性肽是医学及食品科学的研究热点，人们对多肽的认识也越来越全面，活性肽是由蛋白质水解得到的数个到数十个具有特殊功能的多肽类物质，具有抗病毒、抗高血压、抗衰老、抗癌、抗细菌、抗胆固醇、抗氧化和抗血栓等生物活性。由于功能性肽的特殊功能，使得人们对它需求增加，现在已提取出多种功能性肽多用于医用和保健，如功能性大豆蛋白肽已经用于降血脂。目前，对土鳖虫化学成分的研究主要集中在氨基酸、脂肪酸、微量元素、生物碱等方面，对土鳖虫小分子多肽的研究较少；现有技术公开了采用木瓜蛋白酶对新鲜的土鳖虫进行多肽提取，并对提取的土鳖虫多肽在免疫调节作用、抗凝血作用及抗肿瘤方面做了研究。微生物菌剂在发酵过程中产生一些蛋白酶，可有效将蛋白质分解为氨基酸及小分子多肽，目前未见报道采用微生物发酵法制备土鳖虫多肽。技术实现要素：本发明所要解决的技术问题是：针对现有技术存在的不足，提供一种土鳖虫多肽的制备方法。为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：一种土鳖虫多肽的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)预处理：取新鲜的土鳖虫清洗干净，按照料液比1:10～18置于浓度为2～5mol/L的NaCl溶液中，匀浆处理得到匀浆组织液；(2)一次酶解：取步骤(1)中的匀浆组织液，加入土鳖虫重量0.01～0.05倍的无花果蛋白酶，调pH值4～8.5，温度控制在50～68℃，酶解20～40min，灭酶得到酶解物；(3)发酵处理：取步骤(2)中的酶解物，加入酶解物重量0.01～0.05倍的混合菌种，调pH5～7.5，温度控制在30～40℃，发酵12～24h，得到发酵混合物；(4)二次酶解：取步骤(3)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.01～0.05倍的胰蛋白酶，调pH5～8，温度控制在30～40℃，酶解20～50min，灭酶，将酶解物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提掖。(5)超滤处理：取步骤(4)中的土鳖虫多肽粗提液，经过超滤膜过滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。作为一种改进的技术方案，所述步骤(2)中无花果蛋白酶的加入量为土鳖虫重量的0.04倍，酶解时的pH为5.5，温度为60℃，酶解时间为35min。作为一种改进的技术方案，所述混合菌种为枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌，所述枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.1～0.3:0.15～0.5:0.1～0.35。作为一种优选的技术方案，所述枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.25:0.42:0.3。作为一种优选的技术方案，所述步骤(4)中胰蛋白酶的加入量为发酵混合物重量的0.04倍，pH为7.8，温度为37℃。作为一种改进的技术方案，步骤(4)中二次酶解得到的酶解物，经过胃蛋白酶的三次酶解，其中胃蛋白酶的加入量为酶解物重量0.01～0.04倍，酶解结束后将酶解物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提液。作为一种改进的技术方案，步骤(5)中超滤膜的截留分子量为3000。本发明还研究了上述方法制备的土鳖虫多肽在胃癌离体细胞生长抑制方面的应用。本发明建立的土鳖虫多肽的制备方法获得的土鳖虫糖蛋白对胃癌离体细胞生长起到抑制作用；为了更好的说明土鳖虫多肽在胃癌离体细胞生长抑制中的作用，本发明通过药理实验及结果进行如下描述：(1)肿瘤细胞的培养将人胃癌细胞SGC-7901于37℃、5％CO2、含10％新生小牛血清和1.25μg/ml庆大霉素的RPMI1640培养基条件下培养，每隔2-3d换新鲜培养基1次。(2)苔盼蓝活细胞计数法检测土鳖虫糖蛋白对细胞的作用选取对数生长期的胃癌细胞，制成单细胞悬浮液，调整细胞浓度至2×105个/ml,接种1ml上述细胞悬液至25ml的细胞培养瓶中，加入3ml生长培养液，培养18h，灭菌的PBS洗涤3次后加入3ml不同浓度的土鳖虫多肽溶液(以维持培养液配置，过滤除菌)，置培养箱中继续培养24h和48h。取出培养瓶，用0.2mL胰酶液在1min内将细胞消化使脱落，随即加入3ml生长培养液终止消化并吹打成单个细胞悬液，吸取0.5ml细胞悬液于干净的试管中，加入0.1ml苔盼染色液(0.4％，以生理盐水配)，摇匀静置2min，用血球计数板对未染色的细胞计数，并在1min完成。(3)MTT法检测细胞对土鳖虫多肽的敏感性用生长液调整细胞浓度至4×104个/ml，随即接孔到96孔板，每孔200μl，96孔板边缘一圈的36个孔弃用，各孔加200μl灭菌的PBS；37℃，5％CO2，饱和湿度培养箱中放置18h使细胞贴壁，吸去培养液，各孔用灭菌的PBS洗3次，除去孔中的残留血清，加入不同浓度的多肽溶液(以维持液配成)各200μl，培养24h和48h，设空白对照。样品液作用后，各孔各加入配置好的5mg/ml,25μl的MTT溶液，继续培养4h，倾倒各孔液体，每孔加入150μl,37℃预温的二甲基亚砜(DMSO),震荡10min后放入酶标仪作双波长吸光度检测，检测波长570nm，参考波长630nm。(4)实验结果苔盼蓝活细胞计数法检测分析结果显示：胃癌细胞在土鳖虫多肽作用24h和48h后，均呈现明显的抑制作用，多数细胞出现坏死症状，与阴性对照组相比有显著性差异，p＜0.05。其实验结果见表1。表1土鳖虫多肽对胃癌细胞的抑制作用土鳖虫多肽浓度(mg/L)24h抑制率(％)48h抑制率(％)0000.0831.462.970.8206.2320.359.50012.4632.4636.0048.7958.54MTT法检测结果显示：胃癌细胞对土鳖虫多肽溶液比较敏感，作用48h即呈现较明显的抑制作用，与阴性对照组相比有显著性差异，p＜0.05。其实验结果见表2。表2土鳖虫多肽对胃癌细胞作用24h和48h的MTT检测土鳖虫多肽浓度(mg/L)24h抑制率(％)48h抑制率(％)0000.0862.689.320.7606.1414.175.68328.4638.379.78042.2058.62采用了上述技术方案后，本发明的有益效果是：(1)本发明采用Nacl溶液对新鲜土鳖虫浸泡，然后进行匀浆处理，由于蛋白质易溶于低浓度的盐溶液，促进了蛋白质的溶出；(2)本发明首先通过无花果蛋白酶实现了对土鳖虫匀浆组织液中蛋白分子的充分降解，然后通过大量实验筛选出有效的混合菌种，并且在发酵过程中混合菌种的协同作用得到充分发挥，实现了对土鳖虫组织的充分降解，由于微生物的代谢作用会对一些多肽分子进行修饰，使小肽之间，小肽与氨基酸之间发生移接与重排，制得的活性肽无苦味和异味，进而改善多肽的质量；最后再通过胰蛋白酶的酶解，提高了小分子多肽的提取率；本发明采用酶解－发酵－酶解的工艺，有效实现了对土鳖虫蛋白组分的充分降解，改善了土鳖虫多肽的质量，而且还提高了土鳖虫多肽的提取率。具体实施方式为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种土鳖虫多肽的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)预处理：取新鲜的土鳖虫清洗干净，按照料液比1:10置于浓度为2mol/L的Nacl溶液中，匀浆处理得到匀浆组织液；(2)一次酶解：取步骤(1)中的匀浆组织液，加入土鳖虫重量0.02倍的无花果蛋白酶，调pH值4.5，温度控制在50℃，酶解25min，灭酶得到酶解物；(3)发酵处理：取步骤(2)中的酶解物，加入酶解物重量0.02倍的混合菌种(枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.1:0.18:0.13)，调pH5.5温度控制在30℃，发酵12h，得到发酵混合物；(4)二次酶解：取步骤(3)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.02倍的胰蛋白酶，调pH5.3，温度控制在30℃，酶解20min，灭酶，将酶解物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提掖。(5)超滤处理：取步骤(4)中的土鳖虫多肽粗提液，经过截留分子量为4000的超滤膜过滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。此条件下土鳖虫多肽的提取率为11.89％。实施例2一种土鳖虫多肽的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)预处理：取新鲜清洗干净的土鳖虫1000g，按照料液比1:12置于浓度为3mol/L的Nacl溶液中，匀浆处理得到匀浆组织液；(2)一次酶解：取步骤(1)中的匀浆组织液，加入土鳖虫重量0.03倍的无花果蛋白酶，调pH值6.2，温度控制在55℃，酶解30min，灭酶得到酶解物；(3)发酵处理：取步骤(2)中的酶解物，加入酶解物重量0.03倍的混合菌种(枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.2:0.3:0.27)，调pH5.8，温度控制在35℃，发酵16h，得到发酵混合物；(4)二次酶解：取步骤(3)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.03倍的胰蛋白酶，调pH5.8，温度控制在32℃，酶解30min，灭酶，将酶解物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提掖。(5)超滤处理：取步骤(4)中的土鳖虫多肽粗提液，经过截留分子量为5000的超滤膜过滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。此条件下土鳖虫多肽的提取率为12.45％。实施例3一种土鳖虫多肽的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)预处理：取新鲜清洗干净的土鳖虫1000g，按照料液比1:15置于浓度为3.5mol/L的Nacl溶液中，匀浆处理得到匀浆组织液；(2)一次酶解：取步骤(1)中的匀浆组织液，加入土鳖虫重量0.04倍的无花果蛋白酶，调pH值5.5，温度控制在60℃，酶解35min，灭酶得到酶解物；(3)发酵处理：取步骤(2)中的酶解物，加入酶解物重量0.04倍的混合菌种(枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.25:0.42:0.3)，调pH7.2，温度控制在37℃，发酵20h，得到发酵混合物；(4)二次酶解：取步骤(3)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.04倍的胰蛋白酶，调pH7.8，温度控制在37℃，酶解45min，灭酶，将酶解物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提掖。(5)超滤处理：取步骤(4)中的土鳖虫多肽粗提液，经过截留分子量为3000的超滤膜过滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。此条件下土鳖虫多肽的提取率为13.36％。实施例4一种土鳖虫多肽的制备方法，所述制备方法包括下列步骤：(1)预处理：取新鲜清洗干净的土鳖虫1000g，按照料液比1:18置于浓度为4.5mol/L的Nacl溶液中，匀浆处理得到匀浆组织液；(2)一次酶解：取步骤(1)中的匀浆组织液，加入土鳖虫重量0.05倍的无花果蛋白酶，调pH值8.2，温度控制在68℃，酶解40min，灭酶得到酶解物；(3)发酵处理：取步骤(2)中的酶解物，加入酶解物重量0.05倍的混合菌种(枯草芽孢杆菌、酵母菌和乳酸菌的质量比为0.3:0.5:0.32)，调pH7.5，温度控制在40℃，发酵24h，得到发酵混合物；(4)二次酶解：取步骤(3)中的发酵混合物，加入发酵混合物重量0.05倍的胰蛋白酶，调pH7.8，温度控制在40℃，酶解50min，灭酶，然后向酶解产物中加入酶解物重量0.03倍的胃蛋白酶，调pH2～3，酶解结束后将酶解产物离心去渣，得到土鳖虫多肽粗提掖。(5)超滤处理：取步骤(4)中的土鳖虫多肽粗提液，经过截留分子量为4000的超滤膜过滤，然后再将所得滤液经过纳滤膜截留，将所得截留液冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。此条件下土鳖虫多肽的提取率为13.08％。对比实施例采用传统方法提取：称取步骤(1)中清洗干净的新鲜土鳖虫粉1000g，加入磷酸盐缓冲溶液进行匀浆处理，离心过滤后向所得的上清液中加入木瓜蛋白酶，酶解结束后离心取上清液，经过冷冻干燥得到土鳖虫多肽提取物。此条件下土鳖虫糖蛋白的提取率为10.15％。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。当前第1页1 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