本发明涉及生物技术领域，特别提供了一种适合规模化生产的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续虾青素诱导的方法。
背景技术：
在雨生红球藻的大规模养殖中，通常采用两步法进行培养：第一步为绿色扩培，在环境适宜、营养丰富的条件下雨生红球藻以绿色的营养细胞形态存在，在这个过程中藻细胞分裂繁殖，产生大量带鞭毛的游动细胞，此时细胞脆弱，对光、温度等环境因素敏感，因此，绿色扩培通常在温度与光照控制良好的室内进行。第二步为虾青素诱导，将绿色细胞置于不利的环境条件，细胞失去鞭毛，以不动的厚壁孢子形态存在，这时细胞内会积累大量的虾青素以对抗不利的环境条件，由于需要高光照的刺激，因此，虾青素诱导通常在室外进行。在实际的生产过程中，尤其是在北方地区，冬季室外温度低，无法进行虾青素的诱导培养，养殖企业不得不面对冬季停产的困境，造成设施和人员的闲置和浪费。而绿色扩培阶段是在室内进行，不受气候条件的影响。因此，如果能够将冬季室内生产的绿色细胞进行保藏，待春季气温回升之后再进行虾青素诱导，可以实现全年的生产，提高虾青素的产量。
藻种保藏常用的方法主要是低温（4℃）、冷冻（-20）、超低温保藏（-60~-196℃）等，其中超低温保藏法仅适用于少量藻种的保藏，低温保藏法中藻细胞存在一定的生理活动，随时间延长，藻细胞逐渐降解，同时由于细菌在低温条件下仍然会繁殖，长时间保藏也会腐败变质。冷冻保藏法能够保藏较长时间，同时工艺相对简单，具备规模化藻细胞保藏的潜力。
由于不同藻种对冷冻条件的耐受性不同，这也导致了不同微藻冷冻保藏时的方法和结果有很大差别。文章《3种优质海洋微藻的低温保存研究》报道了在-20℃条件下保存亚心型扁藻、三角褐指藻、球等鞭金藻的方法，但仅扁藻在10%DMSO+10%蔗糖条件下的存活率达到60.2%，但解冻后的生长速率仅为0.12 d-1，其他两种藻的存活率极低。文章“海链藻絮凝和凝后保存技术研究”报道了使用10%甘油在-20℃条件下保存壳聚糖絮凝的海链藻，在保藏后比生长速率稍有降低，但是由于甘油粘稠，不易除去，后续培养中易造成污染。专利201010222005.0公开了一种保藏小球藻、葡萄藻、小环藻、微绿球藻、硅藻藻种的方法，采用-60℃低温预冻后冷冻真空干燥的工艺，但该方法生产成本高，只适合小量的菌种保藏，不适合规模化应用。
雨生红球藻绿色扩培的细胞脆弱，在冷冻保藏过程中鞭毛易受到冰晶和冷冻剂的损伤和毒害，同时后续的虾青素诱导需要高光、高盐、营养缺失等条件的刺激，因此，冷冻保藏细胞活性的保持以及后续的诱导方法是需要解决的关键问题。另外，规模化绿色扩培细胞密度通常不高，培养体积大，因此将细胞浓缩为藻泥的状态可以减小保藏体积，降低生产成本。但目前尚未有关于雨生红球藻藻泥大规模保藏以及后续虾青素诱导方法的相关报道。而现有的微藻保藏方法存在成本高、存活度低、局限于部分藻种、不适合规模化生产等缺点，无法应用于雨生红球藻的生产过程中。
因此，需要开发雨生红球藻规模化生产过程中绿色细胞冷冻保藏以及后续保藏细胞的复苏与虾青素诱导工艺。
技术实现要素：
为解决以上问题，本发明提供了一种适合规模化生产的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续虾青素诱导的方法，采用的技术方案如下：
（a）藻泥制备：将处于对数生长期的雨生红球藻藻液收集于不锈钢搅拌罐中进行静置沉降，去除部分上清培养基，得到细胞密度为10~20 g/L的浓缩藻液；将冻存液按照0.5~10：1的体积比加入到浓缩藻液中，搅拌混合均匀，再加入质量比为0.5~20%（w/v）的脱脂乳粉，搅拌混匀后离心去除上清液，得到用于冷冻保藏的藻泥；
（b）冷冻保藏：将制备好的藻泥迅速置于4℃预冷4~12小时，然后转入到-5~-20℃冷冻保藏，保藏周期30~100天；
（c）细胞活化：将冷冻保藏的藻泥置于20℃水浴融化，然后利用0.1~1.0%（w/v）的氯化钠溶液，结合离心、沉降或过滤等方法洗脱冻存剂。将清洗后的藻细胞按照0.2~0.8 g/L的浓度接种到低氮BG11培养基，在弱光条件下通气培养，其中光强为10~50 μmol m-2 s-1，温度为15~25℃，活化时间为2~4天；
（d）虾青素诱导：藻细胞完成活化培养后，培养基中的氮基本消耗完毕，此时加入浓度为10~100 mM的碳源，并将藻液置于室外光生物反应器中进行诱导培养以积累虾青素，培养周期为5~10天。
优选的，步骤（a）中的冻存液为浓度1~20%（v/v）的DMSO或甘油，使用前需要4℃预冷。
优选的，步骤（a）中的搅拌、离心操作需要在4℃进行
优选的，步骤（a）中的藻泥的含水率为70~90%（w/w）。
优选的，步骤（c）中的低氮BG11培养基氮源为硝酸盐，浓度为0.5~2 mM。
优选的，步骤（d）中的碳源包括碳酸氢盐、碳酸盐、醋酸盐、柠檬酸盐、乙醇中一种或多种。
本发明首先通过冻存剂与浓缩藻液搅拌混合的方式，实现冻存剂对藻细胞充分的接触和保护，而添加脱脂乳一方面可以减少冷冻剂的使用量，另一方面可以降低冻存剂对藻细胞的伤害。而后通过离心去除多余的水分，获得体积更小的藻泥，可以降低冷冻保藏环节的设备需求和运行成本。在细胞活化过程中，采用氯化钠溶液进行洗脱，可以减少冻存剂对藻细胞后续培养的毒性，同时利用低氮、弱光的预培养，实现藻细胞的活化，避免诱导阶段过强的环境刺激导致细胞的漂白死亡。另外，低氮条件可以保证细胞完成活化后处于营养缺失的诱导条件，并通过在培养基中添加碳源，实现活化细胞的快速诱导和虾青素积累。本发明提供的雨生红球藻绿色细胞保藏以及后续的虾青素诱导工艺，操作简单，适合大规模生产应用，可以有效地解决生产企业冬季停产的困境，实现冬季生产的绿色藻细胞在春季进行虾青素诱导，提高设备和人员的生产效率以及虾青素的产量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步详细的描述，但仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、结合、简化，均为等效形式，同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
实施例1
（1）藻泥制备：将处于对数生长期的雨生红球藻藻液收集于10 m3不锈钢搅拌罐，装液量为7 m3。搅拌罐在4℃条件下静置沉降6~12小时，去除部分上清培养基，得到细胞密度为10~20 g/L的浓缩藻液。将4℃预冷的浓度为1~20%（v/v）的DMSO按照0.5~10：1的体积比加入到浓缩藻液中，搅拌混合均匀，转速为10~50 rpm，搅拌时间为5~30 min。而后加入质量比为0.5%-20%（w/v）的脱脂乳粉，搅拌混匀后，1000~5000 rpm离心去上清，得到用于冷冻保藏的藻泥，含水率为70~90%（w/w）。
（2）冷冻保藏：将制备好的藻泥迅速置于4℃预冷4~12小时，然后转入到-20℃冷冻保藏90天。
（3）细胞活化：将冷冻保藏的藻泥置于20℃水浴融化，然后按体积比2：1比例加入0.1~1.0%（w/v）的氯化钠溶液混合搅拌均匀，1000~5000 rpm离心去除上清液。将清洗后的藻细胞按照0.2~0.8 g/L的浓度接种到硝酸盐浓度为0.5~2 mM的低氮BG11培养基，在室内光径为10 cm的玻璃平板式光生物反应器中进行通气培养，其中光强为10~50 μmol m-2 s-1，温度为15~25℃，活化培养时间为2~4天。每天取样观察细胞状态，结果显示部分藻细胞进入分裂增殖的状态，极少量漂白细胞，细胞数目和干重均有较多增长。
（4）虾青素诱导：藻细胞活化培养过程中取样测定培养基氮含量，待氮基本消耗完毕，加入浓度为10~100 mM的醋酸盐和碳酸氢盐的混合碳源，并将藻液置于室外光径为5 cm的薄膜立柱式光生物反应器中进行诱导培养。培养季节为3月份，培养期间室外温度14.3~27.6℃，白天最高光照强度800~1800 μmol m-2 s-1。培养5~10天后，采用改良的Boussiba测定虾青素含量。结果显示，进行诱导培养后，藻细胞迅速积累虾青素，由绿色细胞向红色细胞转变，培养结束时，基本所有细胞都转化为红色不动细胞，仅有少量细胞漂白，最终的干重为1.5~1.8 g L-1，其虾青素含量为3.2~3.6%，相比于正常扩培后直接诱导的对照组没有明显差别。
实例说明了采用上述方法经过冬季90天的保藏，雨生红球藻绿色细胞活性保持完整。春季气温转暖后，结合活化后再诱导的方案，冷冻保藏的藻细胞可以正常进行虾青素的诱导生产。
此外，需要说明的是，本说明书中所描述的具体实施例，其各部分名称等可以不同，凡依本发明专利构思所述的构造、特征及原理所做的等效或简单变化，均包括于本发明专利的保护范围内。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例做修改或补充或采用类似的方式替代，只要不偏离本发明的结构或者超越本权利要求书所定义的范围，均应属于本发明的保护范围。