一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器的制作方法

本实用新型涉及生物传感器技术领域，更为具体地说，涉及一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器。

背景技术：

鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)是一种常见的人畜共患病原菌，其致病机制与菌体的毒力岛基因表达分泌的毒素和毒力蛋白有关。鼠伤寒沙门氏菌的毒力岛基因为SSeC基因，SSeC基因位于毒力岛-2(SPI-2)上，且序列十分保守，SSeC基因编码表达的毒素蛋白能够引起机体发生器官功能障碍等症状，因此SSeC基因可以作为检测鼠伤寒沙门氏菌的一个重要标记物。

目前，鼠伤寒沙门氏菌的检测方法有传统的微生物培养检测法、生化鉴定法，以分子生物学为基础的快速检测方法以及以免疫学为基础的检测技术，其中，以分子生物学为基础的快速检测方法包括聚合酶链式反应(PCR)、基因芯片技术等，以免疫学为基础的检测技术包括酶联免疫吸附试验(ELISA)、同位素标记抗体、免疫荧光法、免疫磁性分离技术、自动酶标免疫检测仪等，上述检测方法包含了微生物培养、核酸分析、抗原-抗体反应等技术。但是，微生物培养检测法、生化鉴定法等传统检测方法存在耗时长、灵敏度低、检测准确度低等的缺点；ELISA和PCR等方法虽然检测速度快，但存在操作繁琐、易被污染、对设备要求高等的缺点，而且检测的特异性也不是很理想，无法满足现代临床和食品的快速检测的要求。

为应对上述缺点，近年来，检测鼠伤寒沙门氏菌的方法出现了生物传感器检测法。生物传感器由具有生物活性的识别原件和信号转换器组成，生物活性物质通常包括酶、抗原-抗体、适配体等。由于生物传感器具有高度自动化、微型化、能在复杂的体系中进行实时监测等的功能，因而在制药、食品、化工、生物医学、临床检验等方面带来了巨大的经济效益和广泛的应用前景。然而大多数的纳米生物传感器由于存在灵敏度低、特异性差、检测范围窄的缺点，限制了纳米生物传感器的大范围使用。

技术实现要素：

本实用新型的目的是提供一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器，利用纳米氧化石墨烯对单链DNA的吸附及荧光猝灭性构建荧光探针，进而实现对含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的快速检测，且灵敏度高、特异性好、检测范围宽。

为了解决上述技术问题，本实用新型提供如下技术方案：

一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器，所述生物传感器包括氧化石墨烯和荧光标记的核酸探针，其中，所述氧化石墨烯为载体，所述荧光标记的核酸探针位于所述氧化石墨烯的表面上，所述荧光标记的核酸探针为所述SSeC基因序列的互补链序列。

优选地，所述荧光标记的核酸探针通过非共价键结合在所述氧化石墨烯的表面上。

优选地，所述非共价键为π-π共价键。

优选地，所述荧光标记的核酸探针的基因序列为6-FAM-GCCTCCTCTG CCATCTCATTCG。

一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器，所述生物传感器包括氧化石墨烯和荧光标记的核酸探针，其中，所述氧化石墨烯为载体，所述荧光标记的核酸探针位于所述氧化石墨烯的表面上，所述荧光标记的核酸探针为所述SSeC基因序列的互补链序列。本实用新型提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器通过以氧化石墨烯为载体，基于氧化石墨烯的非共价偶联核酸分子和猝灭荧光的特性，已荧光标记的核酸探针设置在氧化石墨烯的表面上，从而得到检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器。本实用新型提供的生物传感器处于非检测状态时，由于氧化石墨烯和荧光标记的核酸探针之间的距离很小，因此，生物传感器中发生能量共振转移，进而荧光猝灭；当生物传感器处于检测状态时，即生物传感器中加入待检测样品的单链DNA时，单链DNA会与荧光标记的核酸探针互补形成双链DNA，从而双链DNA从氧化石墨烯的表面游离下来，进而恢复荧光，通过检测荧光值就能够得知待检测样品中含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的浓度。本实用新型提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器具有操作简单、检测精确、检测下限低、灵敏度高、特异性好的特点，且能够定量检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的浓度。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1是本实用新型实施例提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器的结构示意图；

图2是本实用新型实施例提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器 的氧化石墨烯与荧光标记的核酸探针的浓度优化图；

图3是本实用新型实施例提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器检测待测样品灵敏度的线性曲线图；

图4是本实用新型实施例提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器检测待测样品时特异性的图谱。

具体实施方式

本实用新型的目的是提供检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器，利用纳米氧化石墨烯对单链DNA的吸附及荧光猝灭性构建荧光探针，进而实现对含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。

为了使本技术领域的人员更好地理解本实用新型实施例中的技术方案，并使本实用新型实施例的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本实用新型实施例中的技术方案作进一步详细的说明。

本实用新型提供了一种检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器，所述生物传感器包括氧化石墨烯1(graphene oxide，GO)和荧光标记的核酸探针2(FAM-P)，其中，所述氧化石墨烯1为载体，所述荧光标记的核酸探针2位于所述氧化石墨烯1的表面上，所述荧光标记的核酸探针2为所述SSeC基因序列的互补链序列。

具体的，本实用新型提供的检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌纳米生物传感器简称为FAM-P/GO生物传感器，GO1为纳米材料，FAM-P2为羧基荧光素(carboxy-fluorescein，FAM)标记的核酸。附图1示出了本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器的结构示意图。本实用新型提供的FAM-P/GO生物传感器包含有GO1和FAM-P2两个部分，GO1为载体，FAM-P2分布在GO1的表面上，优选地，FAM-P2均匀地分布在GO1的表面上。FAM-P2通过非共价键偶联在GO1的表面上，其中，该非共价键为π-π共价键结合，即FAM-P2通过π-π共价键结合在GO1的表面上。

本实用新型提供的FAM-P/GO生物传感器的检测原理为：基于GO1的非共价偶联核酸分子和猝灭荧光的特性，在GO1的表面引入FAM-P2。具体为：当FAM-P/GO生物传感器处于非检测状态时，即没有加入靶标DNA时，FAM-P2呈自由卷曲状态，由于FAM-P2位于GO1的表面上，FAM-P2和GO1之间的距离很小，因此，FAM-P/GO生物传感器中发生能量共振转移，进而荧光猝灭，检测不到荧光值；当FAM-P/GO生物传感器处于检测状态时，即FAM-P/GO生物传感器中加入待检测样品的单链DNA(single－stranded DNA,ssDNA)时，即加入靶标DNA时，靶标DNA的ssDNA会与FAM-P2互补形成双链DNA(double-stranded DNA,dsDNA)，由于形成dsDNA时的结合力大于GO1和FAM-P2之间的非共价键力，因此，dsDNA能够从GO1的表面游离下来，进而恢复荧光，最后通过检测荧光值就能够得知待检测样品中含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的浓度，检测精确，操作简单。

基于上述原理，加入的靶标DNA越多，形成的双链也就越多，荧光回复也就越强，进而能够定量检测含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的浓度，同时，本实用新型提供的FAM-P/GO生物传感器还具有检测下限低、灵敏度高的特点。

进一步，SSeC基因序列为5’-CGAATGAGATGGCAGAGGAGGC-3’，由于FAM-P的基因序列为SSeC基因序列的互补链序列，则FAM-P的基因序列为6-FAM-GCCTCCTCTGCCATCTCATTCG。

由于荧光共振能量转移受纳米材料GO1和FAM-P2比例的影响很大，同时，为使本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器具有灵敏的检测性能及检测极低浓度的含SSeC基因鼠伤寒沙门氏菌的性能，本实用新型实施例提供了FAM-P/GO生物传感器供受比例优化的研究，即研究GO1的表面上设置多少FAM-P2时，FAM-P/GO生物传感器具有最优的效益，具体研究内容为：

设定FAM-P/GO生物传感器体系中FAM-P2溶液的浓度恒定为50nM，考察GO1溶液浓度分别为0.02mg/mL、0.04mg/mL、0.05mg/mL、0.06mg/mL、0.07mg/mL、0.08mg/mL、0.09mg/mL时的荧光值。具体实施过程为：在一定体积的FAM-P2溶液中分别加入超声处理后的不同浓度的GO1溶液形成混合液，上述混合液在温度为95℃的条件下变性处理5min，并用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffer saline，PBS)稀释至100ul形成复合溶液，该复合溶液充分混合并在37℃下静置15min，检测各荧光值。在进行荧光值检测时，设置激发波长为480nm，发射波长517nm，测定复合溶液荧光值F和原始荧光值F₀,通过GO1溶液浓度与荧光相对值F/F₀-1之间的关系得知FAM-P2溶液的浓度为50nM时，与FAM-P2相配合的GO1溶液的最佳浓度，具体请参考附图2。

附图2示出了本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器体系中FAM-P2与GO1的浓度优化图。从附图2中能够看出，随着GO1浓度的不断增大，FAM-P/GO生物传感器体系的荧光相对值F/F₀-1不断升高，这表明随着GO1浓度的增大荧光值呈显著下降的趋势，当GO1浓度达到0.05mg/mL及以上时，荧光相对值F/F₀-1几乎不变且接近于1.0，而且超过95％的FAM-P2的荧光被GO1猝灭，由此能够表明FAM-P/GO生物传感器体系中FAM-P2已经完全结合到GO1表面，溶液中不存在游离的FAM-P2，背景值低，此时，FAM-P2溶液的浓度为50nM，与FAM-P2相配合的GO1溶液的最佳浓度为0.05mg/mL。

本实用新型实施例还提供了FAM-P/GO生物传感器检测待测样品灵敏度的实验研究， 具体内容为：将鼠伤寒沙门氏菌在温度为37℃的条件下培养24h，经平板计数后，制备浓度分别为10³CFU/mL、10⁴CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL和10⁸CFU/mL的菌体，将上述不同浓度的菌体放置于95℃的水浴中15min，然后放置冰上10min以获取相应的ssDNA，将所获得的ssDNA分别加入配置好的FAM-P/GO生物传感器体系中，在温度为37℃的条件下孵育30min，最后分别检测各体系的荧光值，并根据所测得的各体系的荧光值与菌体浓度的对数绘制线性曲线，线性曲线结果具体请参考附图3。

附图3示出了本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器检测待测样品灵敏度的线性曲线图。从附图3中能够得知，随着菌体浓度的不断增大，荧光值显著增大，且在上述浓度范围内荧光值与菌体浓度的对数呈现良好的线性关系，荧光值与菌体浓度的对数的线性方程为Y＝29.192X-45.239，线性相关系数为0.9987，由此能够说明，FAM-P/GO生物传感器体系能够检测到菌体的下限为10³CFU/mL，进而说明本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器在检测待检样品时具有很高的灵敏度，且能够检测到较低浓度的菌体。

进一步，本实用新型实施例还提供了FAM-P/GO生物传感器检测待测样品特异性的实验研究，具体研究内容为：将20种不同菌体的ssDNA，均配置成浓度为5×10⁷CFU/ml的溶液，其中，20种不同菌体为1-鼠伤寒沙门氏菌；2-甲型副伤寒沙门氏菌；3-肠炎沙门菌；4-猪霍乱沙门氏菌；5-志贺氏菌；6-金黄色葡萄球菌；7-大肠杆菌K88；8-变形杆菌；9-副溶血性弧菌；10-溶血性弧菌；11-李斯特菌；12-空肠弯曲菌；13-嗜热链球菌；14-枯草杆菌；15-地衣芽孢杆菌；16-嗜热双歧杆菌；17-长双歧杆菌；18-短双歧杆菌19-嗜酸乳杆菌、20-干酪乳杆菌，上述菌体均可以采用外购菌体。设置不加菌体的ssDNA为空白组，即为图4中的21组，将空白组与上述20种不同菌体的ssDNA分别加入配置好的FAM-P/GO生物传感器体系中，在温度为37℃的条件下孵育30min，然后分别测量荧光值，并以各菌体的排列为横坐标、荧光值为纵坐标绘制特异性图谱，具体结果请参考附图4。

附图4示出了本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器检测待测样品时特异性的图谱。从附图4中能够得知，1号菌体的荧光值显著增加且明显高于其余20组菌体的荧光值，2-4号的其余种类的沙门氏菌由于其序列存在一定的同源性而产生部分荧光，但其荧光值远远低于1号菌体的荧光值，其他种类的菌体及空白组的荧光值更低，由此能够说明，本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器在检测待检样品时具有很好的特异性。

由上述检测内容及描述能够得知，本实用新型实施例提供的FAM-P/GO生物传感器具有检测下限低、灵敏度高、特异性好的特点，且能够定量检测含SSeC基因鼠伤寒沙门 氏菌的浓度。

虽然已经以具体实施例的方式描述了本实用新型，但是对于本领域技术人员来说，在不脱离所附权利要求书所限定的本实用新型的精神和范围的情况下，可以对本实用新型进行各种变化和修改，这些变化和修改同样包括在本实用新型的范围内。