靶向Notch通路抑制剂的制作方法

本发明涉及式(i)的缀合物：

s–l–a(i)

或其药学上可接受的盐，以及它们的制备方法、包含它们的药物组合物及它们作为药物的用途，其中a是γ-分泌酶抑制剂，l是连接体，且s是肽酶特异性底物。

背景技术：

靶向治疗剂已脱颖而出，提供了改进的功效和降低的毒性。特异性靶向器官有两种可能性：第一种是通过在靶器官中特异性表达的受体，或者第二种是通过在该器官中具有更高表达或更高活性的酶。这些概念可以结合起来以更好地靶向。

组织靶向是药物研究的关键主题，以便最大化期望的治疗效果，同时最小化毒副作用，即改善治疗指数。肾特异性药物靶向可为一个有吸引力的选择：

·避免不必要的肾外效应；

·对于器官内的靶细胞，药物的肾内输送可能不是最佳的；

·一些药物在到达肾脏的作用部位之前，大部分已被灭活；

·病理状况，诸如肾小球滤过、肾小管分泌的异常或者蛋白尿的发生可影响药物的正常肾分布。

此外，肾脏内的细胞特异性药物靶向可以提供理解某些药物作用的机制并因此也可以操纵肾脏生理学的工具。

在肾脏内，足细胞(podocyte)的损伤是许多肾脏疾病的起因，导致可能发展为终末期肾脏疾病的蛋白尿。足细胞在维持肾小球过滤屏障和肾小球结构完整性中起着关键作用。靶向于足细胞的药物具有两个重要挑战：(1)靶向正确的细胞(其中对足细胞解剖学的理解以及其与周围的细胞和结构如何相互作用是至关重要的)和(2)选择和解决正确的药理通路和哪些事件导致足细胞损伤。

在导致肾小球硬化的足细胞损伤的同时，肾小管间质纤维化是急性肾损伤(aki)的另一个标志，再次，通过减少施加不良副作用的药物的毒性和/或通过增加抗纤维化药物的肾功效，靶向于近端肾小管细胞的药物可为其治疗提供新的工具。

最近，关于肾脏疾病的提高的了解已经产生了几种用于设计细胞靶向治疗剂的候选通路，其包括notch通路。在肾脏内，肾小球或肾小管细胞的损伤是许多急性和慢性疾病的起因，导致进行性功能障碍和终末期肾脏疾病。肾小球是决定整体肾功能的主要过滤屏障。炎性和非炎性应激影响肾小球，并导致其结构的改变，从而导致其渗透性和功能的改变，并导致慢性肾脏疾病(ckd)。肾小管间质组织的损伤是急性肾损伤(aki)的主要原因，特别是在虚弱的住院患者中。

急性肾损伤(aki)是进展至慢性肾脏疾病(ckd)的危险因素，慢性肾脏疾病是一种无有效治疗的严重临床症状，伴有包括心血管和代谢并发症的患者的高发病率。肾脏疾病可为原发的或作为多系统遗传、炎症、自身免疫、毒性或代谢病症的一部分发生。在肾脏、肾小球、肾小管间质组织或血管中三种主要结构可受到影响，导致疾病早期阶段的不同临床症状。然而，无论最初的发作如何，疾病进展将导致不可逆的肾小球硬化和肾小管间质纤维化，因此最后的终末期肾脏疾病需要透析或肾移植。目前的疗法主要是治疗原发疾病以限制ckd进展。早先的研究已发现，属于notch通路的基因在来自患者的肾脏样本中和在肾脏疾病的动物模型中表达上调。

notch是膜插入蛋白，其活性部分朝向胞内空间。γ-分泌酶这个酶是由两个天冬氨酰蛋白酶催化亚基(早老素(presenilin)-1和-2)和三个支持亚基(pen-2、aph-1和呆蛋白(nicastrin))组成的大蛋白酶复合物，这些均为膜蛋白。γ-分泌酶的底物首先结合呆蛋白(nicastrin)，然后在两个早老素亚基之间转移到进行膜内水解的γ-分泌酶。γ-分泌酶复合物能够通过在膜内部位水解notch蛋白的肽键来活化notch，从而允许裂解的notch细胞内结构域迁移到细胞核，在那其激活响应基因。γ-分泌酶的膜内活性也参与了涉及正常和病理过程的其他生物相关膜蛋白从膜的释放，所述其他生物相关膜蛋白包括胰岛素样生长因子或分选受体。因此，对于选择性疗法，必须仅实现对该活性的局部抑制，从而特别地保护该酶和notch通路的其它功能。

据报道，notch通路参与肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，因此是治疗肾脏疾病的潜在靶点。然而，由于γ-分泌酶和notch通路对于控制包括正常细胞在内的其它细胞的功能也是重要的，因此有必要开发用于将notch拮抗剂特异性靶向至患病肾细胞的工具。

在具有条件表达活性notch1蛋白的小鼠中进行的遗传研究显示，大量的肾小球硬化最终导致肾衰竭和动物死亡。notch转录结合配偶体的遗传缺失以及γ-分泌酶抑制剂的治疗，因此抑制了γ-分泌酶介导的notch活化和至细胞核的转运，保护动物免受肾病综合征。因此，notch通路信号传导的靶向药理学抑制可以预防各种疾病中的肾损伤。notch通路信号传导的调控主要发生在配体结合和γ-分泌酶复合物介导的裂解的水平上。然后，裂解的notch(其包括notch1本身)迁移到细胞核，在那其激活响应基因。

γ-分泌酶抑制化合物及其制备已在例如wo2006/061136a2中描述。据报道，在其中公开了(6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-丙二酰胺衍生物可用于治疗阿尔茨海默病或常见癌症，包括但不限于宫颈癌和乳腺癌以及造血系统的恶性肿瘤。

为了制备药物-载体缀合物，常用的方法是将药物共价偶联到载体上。药物和载体系统之间的键合特征极大地影响药物-载体缀合物的体内行为。缀合物需要在循环中稳定以防止游离药物的过早损失，即在载体已经在预定靶细胞中累积之前。但是在积累后，药物从载体的定量释放和母体药物的再生是理想的。

在本文中，我们描述了一种新颖的治疗策略，旨在通过制备与底物偶联的γ-分泌酶抑制剂的前药以提供在受损肾脏中经特异细胞以高水平表达的特异性水解酶活性，来局部增加在肾脏中作为notch拮抗剂的γ-分泌酶抑制剂的浓度。理想的前药将是i)在γ-分泌酶上无活性，且ii)仅在肾脏中释放以使血浆中没有母体暴露或具有极低的母体暴露，并且(例如在肝脏中)提高安全(边际)窗口。

如本文中通过体外试验以及急性肾小管间质疾病的小鼠模型所证明的，抑制γ-分泌酶的有效载荷在肾脏中从前药中选择性地释放，起到对notch通路的调节作用。我们的方法涉及γ-分泌酶抑制剂的ac-γ-glu前药，其靶向γ-谷氨酰转肽酶(γ-gt)和/或肾脏中的特异性转运蛋白，以及细胞内n-酰胺酸脱酰酶(acy1)和γ-谷氨酰环化转移酶(γ-gct)，从而选择性控制在肾脏疾病背景下notch通路的活化。我们可以表明，这种方法能够改善治疗剂的稳定性以及经设计的前药对患病肾脏的选择性，潜在地开辟了对于旨在控制具有急性和慢性肾脏病症的患者的notch通路的疗法改善其治疗并减少其副作用的途径。

发明详述

除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述类似或等同的方法和材料可以用于本发明的实践或测试中，但是合适的方法和材料在下面描述。

本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其它参考文献通过引用整体并入本文。

本申请中使用的命名法是基于iupac系统命名法，除非另有说明。

除非另有说明，本文结构中出现在碳、氧、硫或氮原子上的任何开放化合价均表示存在氢。

术语“部分(moiety)”是指通过一个或多个化学键连接到另一个原子或分子从而形成分子的一部分的一个原子或一组化学键合的原子。例如，式(i)的变量r¹、r²和r³是指通过共价键连接到式(i)的核心结构的部分。

当指示取代基的数目时，术语“一个或多个”是指从一个取代基到最高可能取代数的范围，即经由取代基取代一个氢直到取代所有氢。

术语“可选”或“可选地”表示随后描述的事件或情况可以发生但不必发生，并且该描述包括事件或情况发生的例子以及其不发生的例子。

术语“取代基”表示取代母体分子上的氢原子的一个原子或一组原子。

术语“本发明化合物”和“本发明的化合物”是指本文公开的化合物及其立体异构体、互变异构体、溶剂化物和盐(例如药学上可接受的盐)。

当本发明的化合物是固体时，本领域技术人员应理解，这些化合物及其溶剂化物和盐可以以不同的固体形式(特别是不同的晶体形式)存在，所有这些都确定为在本发明和具体式的范围内。

术语“药学上可接受的盐”表示并非生物学上或其他方面所不希望的盐。药学上可接受的盐包括酸和碱加成盐。

术语“药学上可接受的酸加成盐”表示与无机酸(诸如盐酸、氢溴酸、硫酸、硝酸、碳酸、磷酸)以及选自脂族、脂环族、芳族、芳脂族、杂环、羧酸和磺酸类有机酸的有机酸(诸如甲酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、葡萄糖酸、乳酸、丙酮酸、草酸、苹果酸、马来酸、丙二酸、琥珀酸、富马酸、酒石酸、柠檬酸、天冬氨酸、抗坏血酸、谷氨酸、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、肉桂酸、扁桃酸、扑酸(embonicacid)、苯乙酸、甲磺酸、乙磺酸、对甲苯磺酸和水杨酸)形成的盐。

术语“药学上可接受的碱加成盐”表示与有机碱或无机碱形成的那些药学上可接受的盐。可接受的无机碱的实例包括钠、钾、铵、钙、镁、铁、锌、铜、锰和铝盐。衍生自药学上可接受的有机无毒碱的盐包括伯胺、仲胺和叔胺、取代胺(包括天然存在的取代胺)、环胺和碱性离子交换树脂(诸如异丙胺、三甲胺、二乙胺、三乙胺、三丙胺、乙醇胺、2-二乙基氨基乙醇、三甲基胺(trimethamine)、二环己胺、赖氨酸、精氨酸、组氨酸、咖啡因、普鲁卡因、海巴明(hydrabamine)、胆碱、甜菜碱、乙二胺、葡萄糖胺、甲基葡萄糖胺、可可碱、嘌呤、哌嗪(piperizine)、哌啶、n-乙基哌啶和聚胺树脂)的盐。

本文使用的立体化学定义和惯例通常遵循s.p.parker,ed.,mcgraw-hilldictionaryofchemicalterms(1984)mcgraw-hillbookcompany,newyork；以及eliel,e.和wilen,s.,“stereochemistryoforganiccompounds”,johnwiley&sons,inc.,newyork,1994。在描述旋光化合物时，前缀d和l或者r和s是用于表示关于分子手性中心的分子的绝对构型。予以考虑的附于手性中心的取代基按照cahn、ingold和prelog的次序规则(cahnetal.angew.chem.inter.edit.1966,5,385；勘误表511)进行排序。前缀d和l或者(+)和(-)是用于指定化合物对平面偏振光的旋转的符号，其中(-)或l表示化合物是左旋的。以(+)或d为前缀的化合物是右旋的。

术语“立体异构体”表示具有相同的分子连接和键多重性但其空间上原子排列不同的化合物。

术语“手性中心”表示与四个不全同取代基键合的碳原子。术语“手性”表示与镜像不重叠的能力，而术语“非手性”是指与其镜像重叠的实施方案。手性分子是旋光的，即它们具有旋转平面偏振光平面的能力。

本发明的化合物可以具有一个或多个手性中心，并且能够以以下形式存在：旋光纯的对映异构体、对映异构体的混合物(例如外消旋体)、旋光纯的非对映异构体、非对映异构体的混合物、非对映异构的外消旋体或非对映异构的外消旋体的混合物。每当手性中心存在于化学结构中时，其意为与该手性中心相关的所有立体异构体都包含在本发明中。

术语“卤代”，“卤素”和“卤化物”在本文中可互换使用，并且表示氟、氯、溴或碘。卤素的具体实例是氟。

术语“烷基”表示1至12个碳原子的一价直链或支链饱和烃基。在具体实施方案中，烷基具有1至7个碳原子，在更具体的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。烷基的具体实例是甲基。

术语“烯基”表示具有至少一个双键的2至7个碳原子的一价直链或支链烃基。在具体实施方案中，烯基具有2至4个碳原子并具有至少一个双键。烯基的实例包括乙烯基、丙烯基、丙-2-烯基、异丙烯基、正丁烯基和异丁烯基。

术语“烷氧基”表示具有式-o-r’的基团，其中r’是烷基。烷氧基部分的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基和叔丁氧基。

术语“卤代烷基”表示其中烷基的至少一个的氢原子被相同或不同的卤素原子(特别是氟原子)取代的烷基。卤代烷基的实例包括单氟-、二氟-或三氟-甲基(-乙基或-丙基)，例如3,3,3-三氟丙基、2-氟乙基、2,2,2-三氟乙基、氟甲基或三氟甲基。术语“全卤代烷基”表示烷基的全部氢原子被相同或不同的卤素原子取代的烷基。卤代烷基的具体实例是-ch2-cf3,、-ch2-ch2-cf3或-ch2-cf2-cf3，最特别的是-ch2-cf2-cf3。

术语“羟烷基”表示烷基的至少一个氢原子被羟基取代的烷基。羟烷基的实例包括羟甲基、2-羟乙基、2-羟丙基、3-羟丙基，1-(羟甲基)-2-甲基丙基、2-羟丁基、3-羟丁基、4-羟丁基、2,3-二羟丙基、2-羟基-1-羟基甲基乙基、2,3-二羟丁基、3,4-二羟丁基或2-(羟甲基)-3-羟丙基。羟烷基的具体实例是-ch2-ch2-oh。

术语“环烷基”表示3至10个环碳原子的一价饱和单环或双环烃基。在具体实施方案中，环烷基表示3至8个环碳原子的一价饱和单环烃基。双环意为由具有一个或多个共同碳原子的两个饱和碳环组成。具体的环烷基是单环的。单环环烷基的实例是环丙基、环丁基、环戊基、环己基或环庚基。双环环烷基的实例是双环[2.2.1]庚基或双环[2.2.2]辛基。

术语“氨基”表示具有式-nr’r”的基团，其中r’和r”独立地为氢、烷基、烷氧基、环烷基、杂环烷基、芳基或杂芳基。或者，r’和r”与它们所连接的氮一起可以形成杂环烷基。术语“伯氨基”表示其中r’和r”都是氢的基团。术语“仲氨基”表示其中r’是氢且r”不是氢的基团。术语“叔氨基”表示其中r’和r”都不是氢的基团。具体的仲胺和叔胺是甲胺、乙胺、丙胺、异丙胺、苯胺、苄胺二甲胺、二乙胺、二丙胺和二异丙胺。

术语“活性药物成分”(或“api”)表示药物组合物中具有特定生物活性的化合物或分子。

术语“药物组合物”和“药物制剂”(或“制剂”)可互换使用，并且表示待给药于有需要的哺乳动物(例如人)的包括治疗有效量的活性药物成分和药学上可接受的赋形剂的混合物或溶液。

术语“药学上可接受的”表示用于制备药物组合物的材料的属性，所述药物组合物通常是安全的，无毒的，既非生物学上所不希望的也不是其他方面所不希望的，并且对于兽医以及人类药物用途是可接受的。

术语“药学上可接受的赋形剂”、“药学上可接受的载体”和“治疗惰性赋形剂”可以互换使用，并且表示对给药的受试者没有治疗活性并且无毒的药物组合物中的任何药学上可接受的成分，诸如用于配制药物产品的崩解剂、粘合剂、填料、溶剂、缓冲剂、张度剂、稳定剂、抗氧化剂、表面活性剂、载体、稀释剂或润滑剂。

“个体”或“受试者”是哺乳动物。哺乳动物包括但不限于驯养的动物(例如，牛、羊、猫、狗和马)、灵长类动物(例如，人类和非人类灵长类动物如猴子)、兔子和啮齿动物(例如，小鼠和大鼠)。在某些实施方案中，个体或受试者是人。

本文所用的术语“动物”包括人类和非人类动物。在一个实施方案中，“非人类动物”是哺乳动物，例如啮齿动物(诸如大鼠或小鼠)。在一个实施方案中，非人类动物是小鼠。

术语“半最大抑制浓度”(ic50)表示在体外获得生物过程的50％抑制所需要的特定的化合物或分子的浓度。ic50值能够以对数转换为pic50值(-logic50)，其中较高值表示指数上较大的效力。ic50值不是绝对值，而是取决于实验条件(例如，所使用的浓度)。可以使用cheng-prusoff方程(biochem.pharmacol.(1973)22:3099)将ic50值转化为绝对抑制常数(ki)。

术语“治疗有效量”表示本发明化合物或分子在向受试者给药时，(i)治疗或预防特定疾病、病状或病症，(ii)缓解、改善或消除本文中描述的特定疾病、病状或病症的一种或多种症状，或者(iii)预防或延迟本文中描述的特定疾病、病状或病症的一种或多种症状的发作的量。治疗有效量将根据化合物、所治疗的疾病状态、所治疗疾病的严重程度、受试者的年龄和相对健康状况、给药方式和形式、主治医师或兽医的判断和其他因素而变化。

术语疾病状态的“治疗”包括抑制疾病状态，即阻止疾病状态或其临床症状的发展，或者缓解疾病状态，即引起疾病状态或其临床症状的暂时性或永久性消退。

术语疾病状态的“预防”表示导致疾病状态的临床症状不会在可暴露于或易感于疾病状态但尚未经历或显示疾病状态的症状的受试者中发展。

详细地说，本发明涉及式(i)的缀合物

s–l–a(i)

或其药学上可接受的盐，其中a是具有羟基部分的γ-分泌酶抑制剂，l是可裂解的连接体，且s是肽酶特异性底物。

在本发明的一个具体实施方案中，a是具有羟基部分的γ-分泌酶抑制剂。

在本发明的一个具体实施方案中，l是可裂解的连接体，特别是氨乙基-氨基甲酸酯(aminoethyl-carbamate)连接体。

在本发明的一个具体实施方案中，s是识别基序/靶向载体/肽酶特异性底物，特别是关于转运蛋白，关于γ-谷氨酰转肽酶特异性底物(γ-gt，ec2.3.2.2)，γ-谷氨酰环化转移酶(γ-gct,ec2.3.2.4)和/或(谷氨酰)氨肽酶a特异性底物(apa，ec3.4.11.7)。

在本发明的一个实施方案中，a是式(a1)的部分

其中，

x是-cr⁴r^4’-或-cr⁴r^4’-o-；

r是卤素、c1-7烷基或经卤素取代的c1-7烷基；

r¹是氢、c1-7烷基、经卤素或羟基取代的c1-7烷基、c1-7烯基、-(ch2)m-c3-8环烷基、-(ch2)m-cor’、-(ch2)m-吗啉基、苄基或经卤素取代的苄基；

r’是c1-7烷氧基、羟基或氨基；

r²是氢、c1-7烷基、经卤素或羟基取代的c1-7烷基、或是苄基或c3-8环烷基；

r³是c1-7烷基、经卤素取代的c1-7烷基，是苄基、经两个卤素取代的苄基，是-(ch2)m-c3-8环烷基或-(ch2)m-吡啶基；

r⁴和r^4’彼此独立地是氢、卤素、c1-7烷基、经羟基取代的c1-7烷基、c1-7烷氧基或羟基；

n是0、1或2；

m是0、1或2；

条件是r¹、r²、r⁴或r^4’中的至少一个是羟基或经羟基取代的c1-7烷基；

其中l在r¹、r²、r⁴或r^4’的羟基基团处与a结合。

式(a1)的化合物及其制备已经描述于wo2006/061136a2中，其通过引用并入本文。式(a1)的化合物已经在wo2006/061136a2中描述为γ-分泌酶抑制剂，如第17-18页的体外ic50数据所证明的。式(a1)的化合物已经在wo2006/061136a2中公开为可用于治疗阿尔茨海默病或常见癌症。

在本发明的一个具体实施方案中，l在r¹的羟基基团处与a结合。

在本发明的一个实施方案中，x是-ch2-、-chch3-、-ch(ch2ch3)-、-c(ch3)2-、-c(ch3)(oh)-、-c(ch2ch3)(oh)-、-ch(och3)-或-c(ch3)2-o-。

在本发明的一个实施方案中，x是-c(ch3)2-、-c(ch3)(oh)-或-c(ch2ch3)(oh)-。

在本发明的一个具体实施方案中，x是-c(ch3)(oh)-。

在本发明的一个实施方案中，r是卤素，特别是氟。

在本发明的一个实施方案中，n是1。

在本发明的一个实施方案中，r¹是氢、经卤素取代的c1-7烷基或被羟基取代的c1-7烷基，特别是经羟基取代的c1-7烷基。

在本发明的一个实施方案中，r¹是氢，-ch2-cf3或-ch2-ch2-oh，特别地r¹是-ch2-ch2-oh。

在本发明的一个实施方案中，r²是c1-7烷基、经羟基取代的c1-7烷基或c3-8环烷基，特别地r²是c1-7烷基。

在本发明的一个实施方案中，r²是甲基、乙基、羟基-乙基或环丙基，特别地r²是甲基。

在本发明的一个实施方案中，r³是经卤素取代的c1-7烷基，特别地r³是经3或5个氟取代的c1-7烷基。

在本发明的一个实施方案中，r³是-ch2-cf3、-ch2-ch2-cf3或-ch2-cf2-cf3，特别地r³是-ch2-cf2-cf3。

在本发明的一个实施方案中，a是式(a2)的部分

其中x、r、n、r²和r³如本文所述。

在本发明的一个实施方案中，a是式(a3)的部分

其中x、r、r²和r³如本文所述。

在本发明的一个实施方案中，a是式(a4)的部分

在本发明的一个实施方案中，a是式(a5)的部分，

本发明的一个具体实施方案涉及式(i)的缀合物或其药学上可接受的盐，其中部分a选自以下列表：

n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

n-((6r,7s)-6-环丙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

n-((6r,7s)-6-环丙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s)-n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(r)-n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s)-n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r)-n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r或s)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(3,3,3-三氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(3,3,3-三氟-丙基)-丙二酰胺；

n-[(6s,7r)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(s或r)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r或s)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s或r)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(3,3,3-三氟-丙基)-丙二酰胺；

(s或r)-2-乙基-n-((6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-n-(3,3,3-三氟-丙基)-丙二酰胺；

(r或s)-2-乙基-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-n-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(s或r)-2-乙基-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-n-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r或s)-2-乙基-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s或r)-2-乙基-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

n-[(6r,7s)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

n-[(6s,7r)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s)-n-[(6s,7r)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r)-n-[(6s,7r)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(s)-n-[(6r,7s)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

(r)-n-[(6r,7s)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

n-[(6r,7r)或(6s,7s)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

n-[(6s,7s)或(6r,7r)-2-氟-6-(2-羟基-乙基)-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2,2-二甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺；

(s)-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；和

(r)-n-[(6r,7s)-6-乙基-2-氟-8-氧代-9-(2,2,2-三氟-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,2-三氟-乙基)-丙二酰胺；

其中l在羟基基团处与a结合，且其中l和s如本文所述。

在本发明的一个实施方案中，l是式(l1)的部分

其中，

y不存在(void)、或者是o或nh；

r⁵是氢、卤素、c1-7烷基或c1-7烷氧基；

q是1、2、3或4。

在本发明的一个实施方案中，y是nh。

在本发明的一个实施方案中，r⁵是氢。

在本发明的一个实施方案中，q是2。

在本发明的一个具体实施方案中，l是式(l1)的部分，其中y是nh，r⁵是氢，q是2。

在本发明的一个具体实施方案中，l是式(l2)的部分

其中q为1、2或3，特别是q为2。

在本发明的一个实施方案中，s是式(s1)的部分，

其中，

r⁶是氢、c1-7烷基、-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基；

各r⁷独立地选自氢、卤素、c1-7烷基或c1-7烷氧基；

r⁸是氢、c1-7烷基、-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基；

r是0、1、2或3；

条件是r⁶或r⁸中的至少一个是-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基。

在本发明的一个实施方案中，r⁶或r⁸中的一个是-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基，r⁶或r⁸中的另一个是氢或c1-7烷基。

在本发明的一个实施方案中，r⁶或r⁸中的一个是-nh2或-nh-c(o)-ch3，r⁶或r⁸中的另一个是氢。

在本发明的一个实施方案中，r⁷是氢。

在本发明的一个实施方案中，r是0或1，特别是1。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁷是氢并且r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是氢，r⁷是氢，r⁸是-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基，并且r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是氢，r⁷是氢，r⁸是-nh2或-nh-c(o)-ch3，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是氢，r⁷是氢，r⁸是-nh2，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是氢，r⁷是氢，r⁸是-nh-c(o)-ch3，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基，r⁷是氢，r⁸是氢，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是-nh2或-nh-c(o)-ch3，r⁷是氢，r⁸是氢，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是-nh2，r⁷是氢，r⁸是氢，r是1。

在本发明的一个具体实施方案中，s是式(s1)的部分，其中r⁶是-nh-c(o)-ch3，r⁷是氢，r⁸是氢，r是1。

本发明的一个具体实施方案涉及式(ia)的缀合物

或其药学上可接受的盐，其中s是如本文所述的肽酶特异性底物。

本发明的一个具体实施方案涉及式(ib)的缀合物

其中r⁶或r⁸中的一个是-nh2或-nh-c(o)-c1-7烷基，且r⁶或r⁸中的另一个是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁶或r⁸中的一个是-nh2或-nh-c(o)-ch3，且r⁶或r⁸中的另一个为氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁶是-nh2或-nh-c(o)-ch3，且r⁸是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁸是-nh2或-nh-c(o)-ch3，且r⁶是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁶是-nh2，且r⁸是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁶是-nh-c(o)-ch3，且r⁸是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁸是-nh2，r⁶是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，r⁸是-nh-c(o)-ch3，r⁶是氢。

在本发明的一个具体实施方案中，式(i)的缀合物选自以下列表：

(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸；

(s)-2-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸；

(s)-4-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸；

(s)-4-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸；

(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧基)乙氨基)-5-氧代戊酸；

及其药学上可接受的盐。

本发明的另一个实施方案涉及式(ii)的缀合物，

h–l–a(ii)

或其药学上可接受的盐，其中a是本文所述的γ-分泌酶抑制剂，l是如本文所述的连接体，且h是氢。

本发明的一个具体实施方案涉及式(iia)化合物，

或其药学上可接受的盐。

式(ii)化合物适合作为用于制备式(i)化合物的中间体。此外，式(ii)的其它化合物本身表现出高notch抑制活性。

合成

式(a)化合物可以如wo2006/061136a2中所述，例如根据第9至16页的一般合成方案制备。式(a)化合物及其药学上可接受的盐可以通过本领域已知的方法制备，例如通过下述方法制备，该方法包括

a)将式(a-ii)化合物

与式(a-iii)化合物反应

得到式(a’)化合物

其中r、r¹、r²、r³和r⁴/r^4’以及n为本文所描述的；或者

b)将式(a-iv)化合物

与式nh2r³(a-v)化合物反应

得到式(a’)化合物

其中r、r¹、r²、r³和r⁴/r^4’以及n为本文所描述的；或者

c)将式(a-vi)化合物

与式nh2r³(a-v)化合物反应

得到式(a”)化合物

其中r、r¹、r²、r³和r⁴/r^4’以及n为本文所描述的。

或者，式(a)化合物可以根据方案1制备：

式8化合物可以从已知的手性丙二酸半酯1开始制备。进行标准肽偶联，随后用氢氧化锂进行催化氢化和皂化，得到4。氧氮杂(oxazepine)7从5制备，经由苄基2-溴乙基乙醚的烷基化，随后用tfa去除boc。将4与7肽偶联以及随后的催化氢化提供了8，其作为在丙二酰胺中心具有(s)-构型的单一异构体。

方案1.γ-分泌酶抑制剂8的合成

试剂和条件：(a)2,2,3,3,3-五氟丙胺，hobt，edci，i-pr2net在thf中，室温，59％；(b)10％的h2/pd-c，在meoh/催化hcl水溶液中，室温，定量；(c)氢氧化锂在thf/水中，室温，83％；(d)氢化钠，苄基2-溴乙基乙醚在dmf中，室温，81％；(e)三氟乙酸在ch2cl2中，室温，98％；(f)4，hobt，edci，i-pr2net在thf中，室温，61％；(g)10％的h2/pd-c，在meoh/催化hcl水溶液中，室温，定量。

式(i)的缀合物能够以如下所述的方案2和方案3制备。将γ-分泌酶抑制剂8与二(4-硝基苯基)碳酸酯反应，以90％产率得到碳酸酯9，然后单boc保护的乙二胺可以以93％产率连接以得到10a。在dmap存在下与n-boc-gycinol反应以77％产率得到10b。用二烷中用hcl脱保护得到连接体官能化的γ-分泌酶抑制剂11a或11b，以允许n-保护的和游离的α-和γ-谷氨酰基底物的附着。

用ac-glu(osu)-obzl随后通过苄酯的氢化分两步从氨基甲酸酯11a合成具有作为式(s)部分的ac-γ-glu以及y等于nh的缀合物13a(方案2)。用boc-glu-otbu与edci偶合随后通过hcl去保护以总计82％的收率合成了未保护的缀合物13b(具有h-γ-glu)(方案2)。用ac-glu-ome随后通过甲酯的氢氧化锂水解从碳酸酯11c分两步合成具有作为式(s)部分的ac-γ-glu以及y等于o的缀合物13c(方案2)。

相同的胺结构单元11a用于合成共轭物15a(ac-α-glu)和15b(h-α-glu)。在1-羟基-7-氮杂苯并三唑的存在下，胺11a与ac-glu(otbu)-oh的edci偶合以定量的产率得到酰胺14a。在二烷中经由hcl的酯脱保护以81％产率得到了缀合物15a。通过以定量的产率与boc-glu(otbu)-oh偶联随后双重脱保护，以相同的方式合成缀合物15b，从而以80％产率得到15b(方案3)。

方案2.胺-secri11a和胺-o-secri11b，ac-γ-glu-secri13a，h-γ-glu-secri13b和ac-γ-glu-o-secri13c的合成。

试剂和条件：(a)二(4-硝基苯基)碳酸酯，i-pr2net在ch2cl2中，室温，90％；(b)对于10a：n-boc-乙二胺，et3n在ch2cl2中，0℃至室温，93％；对于10b：n-boc-gycinol，et3n/dmap在ch2cl2中，0℃至室温，77％；(c)溶于ch2cl2的二烷中的4mhcl，0℃至室温，(11a：77％；11b：91％)；(d)对于12a：ac-glu(osu)-obzl，et3n在dmf中，0℃至室温，83％；对于12b：boc-glu-otbu，1-羟基-7-氮杂苯并三唑，et3n和edcl在dmf中，0℃至室温，定量；对于12c：boc-glu-ome，1-羟基-7-氮杂苯并三唑，et3n和edcl在dmf中，0℃至室温，52％；(e)对于13a：10％的h2/pd-c，在二烷和meoh中，室温，82％；对于13b：溶于ch2cl2的二烷中的4mhcl，0℃至室温，82％；13c：thf中的0.9当量lioh水溶液，0℃，36％。

方案3.ac-α-glu-secri(15a)和h-α-glu-secri(15b)的合成

试剂和条件：(a)对于14a：ac-glu(otbu)-oh，1-羟基-7-氮杂苯并三唑，et3n和edci在dmf中，0℃至室温，定量；对于14b：boc-glu(otbu)-oh，1-羟基-7-氮杂苯并三唑，et3n和edci在dmf中，0℃至室温，定量；(b)溶于ch2cl2的二烷中的4mhcl，0℃至室温；对于15a：81％；对于15b：80％。

方案4中总结了释放活性药物所需的化学结构和酶活性。

方案4.γ-分泌酶抑制剂的类似物的化学结构和靶向酶活性。

前药由三个不同的部分组成：活性化合物(γ-分泌酶抑制剂，secri)，连接体(氨基乙基-氨基甲酸酯)和用于释放肽酶的靶向底物(箭头)。

药物组合物

另一个实施方案提供了包含本发明化合物和治疗上惰性的载体、稀释剂或药学上可接受的赋形剂的药物组合物或药物，以及使用本发明化合物制备该组合物和药物的方法。

组合物以符合良好医学实践的方式配制、给药和递送。在这种情况下考虑的因素包括正在治疗的具体疾病、待治疗的具体哺乳动物、个体患者的临床状况、病症的原因、试剂的递送部位、给药方法、给药时间表以及医生已知的其它因素。

本发明的化合物可以通过任何合适的方式给药，包括口服、局部(包括口腔和舌下)、直肠、阴道、经皮、肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、皮内、鞘内和硬膜外和鼻内、以及病灶内(如果对于局部治疗需要)给药。肠胃外输液包括肌肉内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。

本发明的化合物可以以任何方便的给药形式给药，例如片剂、粉剂、胶囊、溶液、分散剂、混悬剂、糖浆剂、喷雾剂、栓剂、凝胶剂、乳剂、贴剂等。该组合物可包括药物制备中的常规组分，例如稀释剂、载体、ph调节剂、防腐剂、增溶剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、甜味剂、着色剂、调味剂、用于改变渗透压的盐、缓冲剂、掩蔽剂、抗氧化剂和其它活性剂。它们还可以包括其它治疗上有价值的物质。

通过将本发明的化合物与载体或赋形剂混合来制备典型的制剂。合适的载体和赋形剂是本领域技术人员熟知的，并且在例如anselh.c.etal.,ansel’spharmaceuticaldosageformsanddrugdeliverysystems(2004)lippincott,williams&wilkins,philadelphia；gennaroa.r.etal.,remington:thescienceandpracticeofpharmacy(2000)lippincott,williams&wilkins,philadelphia；和rower.c,handbookofpharmaceuticalexcipients(2005)pharmaceuticalpress,chicago中详细描述的。制剂还可以包含一种或多种缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、润湿剂、润滑剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂、抗氧化剂、遮光剂、助流剂、加工助剂、着色剂、甜味剂、芳香剂、调味剂、稀释剂和其它已知的添加剂以提供药物(即，本发明的化合物或其药物组合物)的雅致呈现或帮助制造药物产品(即药物)。

本发明化合物可以给药的剂量能够在宽范围内变化，并且当然在每种特定情况下都适合于个体要求。通常，在口服给药的情况下，对于通式(i)的化合物每人约0.01至1000mg日剂量应该是合适的，尽管必要时也可以超过上述上限。

合适的口服剂型的实例是包括与约30至90mg无水乳糖、约5至40mg交联羧甲纤维素钠、约5至30mg聚乙烯吡咯烷酮(pvp)k30和约1至10mg硬脂酸镁混合的约100mg至500mg的本发明化合物的片剂。粉末成分首先混合在一起，然后与pvp的溶液混合。所得组合物可以干燥，造粒，与硬脂酸镁混合，并使用常规设备压制成片剂形式。

气溶胶制剂的实例可以通过将本发明的化合物(例如10至100mg)溶解在合适的缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)中来制备，如有需要可加入张度剂(例如，诸如氯化钠的盐)。可以过滤(例如，使用0.2μm过滤器)溶液以除去杂质和污染物。

治疗用途

如上所述，式(i)化合物及其药学上可接受的盐具有有价值的药理学性质，并且已经被发现是选择性肾notch通路抑制剂或γ-分泌酶抑制剂。

本发明的化合物可单独使用或与其它药物组合使用，用于治疗或预防由γ-分泌酶活性或notch蛋白活化引起的疾病。这些疾病包括但不限于肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，特别是急性肾损伤、慢性肾脏疾病、足细胞损伤、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、蛋白尿、终末期肾病。

本发明的一个具体实施方案还涉及包括本文所述的式(i)化合物和至少一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。

本发明的一个具体实施方案还涉及用作治疗活性物质的本文所述的式(i)化合物。

本发明的一个具体实施方案还涉及用于治疗或预防与γ-分泌酶活性或notch蛋白活化有关的疾病的本文所述的式(i)化合物。

本发明的一个具体实施方案还涉及本文所述的式(i)化合物，其用于治疗或预防肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，特别是急性肾损伤、慢性肾脏疾病、足细胞损伤、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、蛋白尿、终末期肾病。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防与γ-分泌酶活性或notch蛋白活化有关的疾病的方法，该方法包括将本文所述的式(i)化合物给予人或动物。

在另一个实施方案中，本发明涉及用于治疗或预防肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，特别是急性肾损伤、慢性肾脏疾病、足细胞损伤、肾小球硬化、肾小管间质性纤维化、蛋白尿、终末期肾病的方法，该方法包括将本文所述的式(i)化合物给予人或动物。

本发明还包括本文所述的式(i)化合物的用途，其用于治疗或预防与γ-分泌酶活性或notch蛋白活化有关的疾病。

本发明还包括本文所述的式(i)化合物的用途，其用于治疗或预防肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，特别是急性肾损伤、慢性肾脏疾病、足细胞损伤、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、蛋白尿、终末期肾病。

本发明还涉及本文所述的式(i)化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防与γ-分泌酶活性或notch蛋白活化有关的疾病。

本发明还涉及本文所述的式(i)化合物在制备药物中的用途，所述药物用于治疗或预防肾脏中的肾脏疾病和组织损伤，特别是急性肾损伤、慢性肾脏疾病、足细胞损伤、肾小球硬化、肾小管间质纤维化、蛋白尿、终末期肾病。该药物包括如上所述的式(i)化合物。

附图说明

图1.人类患病肾脏中apa和γ-gt的酶活性的组织酶学图谱。

将冷冻的oct包埋的人类患病肾脏的切片(7μm)在37℃下暴露于apa(α-glu-βna)或γ-gt(γ-glu-βna)的β-甲氧基萘酰胺(β-na)特异性底物以及fastblueb，然后用浅苏木精试剂对切片进行复染。酶活性可视化为红色沉淀。

图2a.对于α-glu-和γ-glu-分泌酶抑制剂前药的胺-secri(11a)代谢物的细胞外释放。将前药加入细胞中19h，然后收集上清液，并分析secri(8)，胺-secri(11a)，前药13a、13b、15a、15b以及(对于13a、15a)相应的脱乙酰化代谢物。

白色：hek293细胞；浅灰色：215/f2细胞；深灰色：hk2细胞；黑色：ec219细胞。

添加cpd：在pbs中20μm，孵育19小时。secri(8)在加入到细胞19h时是稳定的；从任何前药中都未检测到游离的secri(8)。

图2b.在无病balb/c小鼠的肾脏中通过组织酶谱法确定的γ-分泌酶类似物对apa和γgt的酶活性的选择性抑制。

图3.在暴露于马兜铃酸(aa)并且经胺-secri(11a)或用ac-γ-glu-secri(13a)处理的小鼠肾脏中通过免疫组化确定的notch1和活性裂解的notch1的表达。

将急冻的肾脏的切片(7μm)暴露于抗γ-分泌酶裂解的notch(cnotch)抗体，随后进行碱性磷酸酶固红色原染色。免疫染色可视化为黑色沉淀。

实施例

提供以下实施例1-16用以说明本发明。它们不应被认为是限制本发明的范围，而只是作为其代表。

使用的缩写

ac：乙酰基

aa：马兜铃酸；8-甲氧基-6-硝基菲并[3,4-d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-羧酸

apa：谷氨酰氨肽酶(ec3.4.11.7)

γ-gt：γ-谷氨酰转肽酶(ec2.3.2.2)

γ-gct：谷氨酰环化转移酶(3.5.1.14)

acy1：n-酰基-l-氨基酸酰胺水解酶(3.5.1.14)

acoh：乙酸

ac-glu(osu)-obzl：乙酰基-l-谷氨酸γ-n-羟基琥珀酰亚胺酯α-苄基酯

boc：叔丁氧羰基

boc-glu(otbu)-oh：n-boc-l-谷氨酸γ-叔丁基酯

n-buli：正丁基锂

ch2cl2：二氯甲烷

dmap：4-二甲氨基吡啶

edci：n-(3-二甲基氨基丙基)-n’-乙基碳二亚胺盐酸盐

etoac：乙酸乙酯

etoh：乙醇

et2o：乙醚

et3n：三乙胺

hobt：1-羟基苯并三唑水合物

meoh：甲醇

i-pr2net：n-乙基二异丙胺

tfa：三氟乙酸

thf：四氢呋喃

secri：γ-分泌酶抑制剂

bql：低于可量化限。

一般信息和分析化合物表征

反应在氩气气氛下进行。溶剂和试剂从商业来源获得，并按原样使用。所有反应均经tlc(tlc板f254，merck)。在bruker300、400或600mhz仪器上获得质子和碳nmr谱。各自的碳nmr谱为150mhz。相对于作为内标的四甲基硅烷记录化学位移(δ，ppm)。nmr缩写如下：s，单峰：d，双峰；t，三重态；q，四重态；m，多重态；br，变宽。通过¹hnmr分析纯度。在¹hnmr谱中，未观察到hcl盐和酸(cooh)的酸性质子。在装有watersacquity、ctcpal自动进样器和waterssqd单四极质谱仪的watersuplc-ms系统上记录lc-ms。在zorbaxeclipseplusc18上，在50℃下，在1,7μm2.1*30mm柱上实现分离；a＝溶于水的0.01％甲酸；b＝在流速1下的乙腈。梯度：0分钟3％b，0.2分钟3％b，2分钟97％b，1.7分钟97％b，2.0分钟97％b。注射体积为2μl。使用由agilent1290高压梯度系统、ctcpal自动进样器和agilent6520qtof组成的agilentlc系统记录lc-ms高分辨率谱。在zorbaxeclipseplusc18上，在55℃下，在1,7μm2.1*50mm柱上实现分离；a＝溶于水的0.01％甲酸；b＝在1ml/min流速下乙腈中的0.01％甲酸。梯度：0分钟5％b，0.3分钟5％b，4.5分钟99％b，5分钟99％b。注射体积为2μl。在agilentsmultimode源中进行电离。质谱仪以“2ghz扩展动态范围”模式运行，导致在m/z＝922下分辨率约为10000。通过内部漂移修正确保质量精度。

实施例1-γ-分泌酶抑制剂(secri)8

n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-(s)-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺

如wo2006/061136a2中对于实施例70a(第95-97页)所描述的来制备标题化合物。

步骤a)n-((6r,7s)-9-烯丙基-2-氟-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基)-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺

向0.06g(0.31mmol)(6r,7s)-9-烯丙基-7-氨基-2-氟-6-甲基-6,7-二氢-9h-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮在5ml四氢呋喃中的溶液中加入0.07g(0.31mmol)2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙酰胺酸、0.04g(0.31mmol)1-羟基苯并三唑水合物、0.06g(0.31mmol)n-(3-二甲基氨基丙基)-n'-乙基-碳二亚胺-盐酸盐和0.1ml(0.62mmol)二异丙基乙胺。在室温下搅拌过夜后，将混合物加入到1n盐酸水溶液中。用二氯甲烷萃取，然后用饱和碳酸氢钠水溶液洗涤，用硫酸钠干燥，并用乙酸乙酯/庚烷在硅胶上层析，得到标题化合物，其为白色固体，msm/e(％)：498.5(m+h+,100)。

步骤b)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2-氧代-乙基)-6,7,8,9-四氟-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺

1.30g(3mmol)(6r,7s)-9-烯丙基-7-氨基-2-氟-6-甲基-6,7-二氢-9h-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-8-酮在60ml二氯甲烷中的溶液在-75℃下经臭氧处理60分钟。加入0.81g(13mmol)甲硫醚，并且溶液在室温下搅拌16小时。在真空下蒸馏掉溶剂，并且残余物用100:0至0:100的正庚烷/乙酸乙酯在硅胶中进行层析，得到1.07g(82％)的n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2-氧代-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺，msm/e(％)：500.3(m+h⁺,100)。

步骤c)n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺

将1.00g(2.0mmol)n-[(6r,7s)-2-氟-6-甲基-8-氧代-9-(2-氧代-乙基)-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺在30ml四氢呋喃中用0.09g(2.0mmol)硼氢化钠还原。用0:100至100:0的乙酸乙酯/正庚烷在硅胶中进行层析，得到0.33g(34％)的n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺，msm/e(％)：502.0(m+h⁺,100)。

步骤d)n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-(s)-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺

用异丙醇/庚烷15:85在chiralpakad上通过色谱法分离0.31g(1.0mmol)n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺差向异构体，得到0.11gn-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-(s)-羟基-2-甲基-n-(2,2,3,3,3-五氟-丙基)-丙二酰胺。msm/e(％):502.3(m+h⁺,100)。

实施例2-γ-分泌酶抑制剂(secri)8

(2s)-n-[(2r,3s)-7-氟-5-(2-羟基乙基)-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]-2-羟基-2-甲基-n'-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺

步骤a)(2s)-2-苄氧基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸乙酯(2)。

(2s)-2-苄氧基-3-乙氧基-2-甲基-3-氧代-丙酸1(1)(1.2g，4.75mmol)、2,2,3,3,3-五氟丙胺(722mg，4.75mmol)、hobt(654mg，4.75mmol)、edci(928mg，4.75mmol)和i-pr2net(2.1ml，11.9mmol)在thf(20ml)中的混合物在环境温度下搅拌18小时。在真空中将挥发物蒸发掉。得到的粗制物通过快速色谱法(50g硅胶柱，正庚烷/etoac0-30％)纯化，得到标题化合物(1.08g，59.4％)，其为无色液体。¹hnmr(300mhz,cdcl3)：δ＝7.37(m,5h),7.26(m,1h),4.60(d,j＝36hz,1h),4.42(d,j＝36hz,1h),4.25(q,24hz,2h),4.25(m,2h),1.75(s,3h),1.28(t,j＝24hz,3h)。lc-ms：382.3(m-h)^-。

步骤b)(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸乙酯(3)。

在氩气和搅拌下，将(2s)-2-苄氧基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸乙酯(2)(1.0g，2.61mmol)溶解于meoh(70ml)水溶液。加入hcl(37％，3滴)和pd-c10％(278mg，0.26mmol)。在抽空并用h2(5次)置换后，将混合物氢化18小时，然后过滤，用meoh洗涤并蒸发，得到标题化合物(766mg，>99％)，其为白色固体。¹hnmr(300mhz,cdcl3)：δ＝4.32(m,2h),4.10(s,1h),3.97(m,2h),1.67(m,3h),1.33(t,j＝24hz,3h)。lc-ms：294.0(m+h)⁺。熔点41-42℃。

步骤c)(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸(4)。

(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸乙酯(3)(716mg，2.44mmol)和lioh(239mg，9.77mmol)在thf(10ml)和水(2ml)中的混合物在环境温度下搅拌18h。将混合物用水稀释并用etoac萃取。水相用hcl水溶液(37％)酸化至ph0，并用etoac萃取两次。将合并的有机层用盐水洗涤，用mgso4干燥并蒸发至干，得到标题化合物(537mg，83％)，其为白色固体。¹hnmr(300mhz,cdcl3)：δ＝7.42(s,宽,1h),4.40(s,宽,1h),4.05(m,2h)1.72(s,3h)。lc-ms：264.3(m-h)^-。熔点67-69℃。

步骤d)n-[(2r,3s)-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]氨基甲酸叔丁酯(6)。

在室温下在氮气气氛下向n-[(2r,3s)-7-氟-2-甲基-4-氧代-3,5-二氢-2h-1,5-苯并氧氮杂-3-基]氨基甲酸叔丁酯(500mg，1.61mmol)在dmf(30ml)中的溶液中加入氢化钠(60％，在矿物油中，97mg，2.42mmol)。将所得混合物搅拌30分钟，然后加入2-溴乙基苄基醚(107mg，0.48mmol)，继续搅拌18小时。将反应混合物用水猝灭并用etoac萃取两次，合并的有机层用柠檬酸水溶液和盐水洗涤，用mgso4干燥并蒸发至干。得到的粗制物通过快速色谱法(20g硅胶柱，正庚烷/etoac0-20％)纯化，得到标题化合物(577mg，81％)，其为黄色油状物。¹hnmr(300mhz,cdcl3)：δ＝7.27(m,6h),7.09(m,1h),6.88(m,1h),5.50(br.d,1h),4.72(m,2h),4.51(s,2h),3.99(m,2h),3.78(m,1h),3.63(m,1h),1.41(d,j＝20hz,9h),1.35d,j＝21hz,3h)。lc-ms：445.4(m+h)⁺。

步骤e)(2r,3s)-3-氨基-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-4-酮(7)。

n-[(2r,3s)-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]氨基甲酸叔丁酯(6)(540mg，1.22mmol)和tfa(2.34ml，30.4mmol)在ch2cl2(30ml)中的混合物在室温下在氮气气氛下搅拌18h。通过过量的nahco3饱和水溶液，混合物变成碱性，然后用水稀释并用etoac萃取两次。将合并的有机层用mgso4干燥并蒸发至干，得到标题化合物(411mg，98％)，其为黄色油状物。¹hnmr(300mhz,cdcl3)：δ＝7.27(m,6h),7.08(m,1h),6.88(m,1h),4.54(m,3h),4.07(m,1h),3.85(m,3h),3.67(m,1h),1.35(d,j＝22hz,3h)。lc-ms：345.0(m+h)⁺。

步骤f)(2s)-n-[(2r,3s)-7-氟-5-(2-羟基乙基)-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]-2-羟基-2-甲基-n’-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺(8)。

(2r,3s)-3-氨基-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-4-酮(7)(207mg，0.60mmol)、(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酸(4)(191mg，0.72mmol)、hobt(91.2mg，0.66mmol)、edci(141mg，0.72mmol))和i-pr2net(263μl，1.50mmol)溶解于thf(10ml)中并在氮气氛围中在环境温度下搅拌60小时。蒸发至干后，将粗制物通过快速色谱法(20g硅胶柱，正庚烷/etoac0-30％)纯化，得到(2s)-n-[(2r,3s)-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]-2-羟基-2-甲基-n’-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺(8a)(218mg，61％)，其为无色粘稠油状物。lc-ms：592.3(m+h)⁺。

(2s)-n-[(2r,3s)-5-(2-苄氧基乙基)-7-氟-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-3-基]-2-羟基-2-甲基-n’-(2,2,3,3,3-五氟丙基)丙二酰胺(8a)(209mg，0.35mmol)溶于meoh(20ml)中，加入hcl(37％，2滴)和pd-c10％(38mg，0.35mmol)。在抽空并用h2(5次)置换后，将混合物氢化18小时，然后过滤，用meoh洗涤并蒸发，得到标题化合物(182mg，>99％)，其为白色泡沫。hplc：tr2.37min,99.3％(265nm)；tr2.37min,99.3％(220nm)。¹hnmr(600mhz,dmso-d6)：δ＝8.56(t,j＝6.50hz,1h),7.84(d,j＝6.75hz,1h),7.57(dd,j＝3.02,9.87hz,1h),7.27(dd,j＝5.64,8.86hz,1h),7.13(dt,j＝3.02,8.46hz,1h),6.74(s,1h),5.00(brs,1h),4.58-4.69(m,2h),3.83-3.97(m,3h),3.76(ddd,j＝5.69,8.16,13.95hz,1h),3.65(ddd,j＝5.19,8.11,11.08hz,1h),3.43-3.49(m,1h),1.40(s,3h),1.19(d,j＝6.04hz,3h)。¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)：δ＝171.8,169.9,167.4,159.6,158.0,145.8,145.8,137.4,137.3,123.6,123.5,113.8,113.7,111.5,111.3,82.3,76.5,57.9,51.5,50.9,38.0,23.4,15.5。lc-ms：500.1(m-h)⁺。hrms(c19h21f6n3o6)：计算值501.1335[m]；实验值501.1345。

实施例3-胺-γ-分泌酶抑制剂(胺-secri)11a

2-氨乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐

步骤a)4-硝基苯基碳酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯(9)。

向(s)-n-[(6r,7s)-2-氟-9-(2-羟基-乙基)-6-甲基-8-氧代-6,7,8,9-四氢-5-氧杂-9-氮杂-苯并环庚烯-7-基]-2-羟基-2-甲基-n’-(2,2,3,3,3-氟-丙基)-丙二酰胺(8)(1g，1.99mmol)在ch2cl2(75ml)中的溶液中加入i-pr2net(2.08ml，11.97mmol)和双(4-硝基苯基)碳酸酯(1.82g，5.98mmol)，并将得到的透明黄色溶液在25℃下在氩气气氛中搅拌12小时。将反应混合物倒入10％khso4水溶液(40ml)中。分离有机层，并用ch2cl2(2×40ml)再萃取水溶液层。合并的有机层用nahco3饱和水溶液(2×30ml)和盐水(30ml)洗涤，用无水na2so4干燥，过滤并在真空中蒸发。所得粗制物在正常硅胶(2-8％etoac/正己烷)上通过柱色谱法纯化，得到标题化合物(1.2g，90％)，其为白色固体。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)：δ＝7.17(ddd,j＝8.5,3.2hz,1h),8.27-8.37(m,2h),7.84(d,j＝6.7hz,1h),7.42-7.52(m,3h),7.32(dd,j＝8.9,5.7hz,1h),7.17(td,j＝8.5,3.2hz,1h),6.73(s,1h),4.68-4.74(m,1h),4.62(dd,j＝6.3hz,1h),4.42-4.56(m,2h),4.20-4.32(m,1h),3.95-4.06(m,1h),3.78-3.94(m,2h),3.29(s,3h),1.39(s,3h),1.21(d,j＝6.3hz,3h)。lc-ms：667.2(m+h)⁺。

步骤b)n-[2-[2-[(2r,3s)-7-氟-3-[[(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰基]氨基]-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-5-基]乙氧基羰基氨基]乙基]氨基甲酸叔丁酯(10a)。

在氩气气氛下在0℃下向4-硝基苯基碳酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯(9)(1200mg，1.80mmol)在ch2cl2(15ml)中的溶液中滴加n-boc-乙二胺(317mg，1.98mmol)在ch2cl2(9ml)中的溶液以及et3n(1.05ml，1.89mmol)。将得到的反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在25℃下再搅拌12小时。将反应混合物倒入10％khso4水溶液(10ml)中。分离有机层，并用etoac(2×20ml)再萃取水溶液层。合并的有机层用无水na2so4干燥，过滤，并在真空中蒸发掉。得到的粗制物通过快速色谱法(50g硅胺，cilicycle柱，etoac/正庚烷1:1至2:1)纯化，得到标题化合物(1.15g，93％)，其为白色粉末。¹hnmr(300mhz,dmso-d6)：δ＝8.56(t,j＝6.9hz,1h),7.82(d,j＝6.1hz,1h),7.40(dd,j＝9.7,2.6hz,1h),7.28(dd,j＝9.0,5.6hz,1h),7.15(td,j＝8.3,2.4hz,1h),7.02(br.s.,1h),6.74(s,2h),4.51-4.73(m,2h),4.14(d,j＝19.8hz,1h),4.06(d,j＝4.6hz,2h),3.77-3.98(m,3h),3.29(s,3h),2.93(br.s.,3h),1.39(s,3h),1.36(s,9h),1.20ppm(d,j＝5.9hz,3h)。lc-ms：688.2(m+h)⁺。

步骤c)2-氨基乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐(11a)。

在0℃下向n-[2-[2-[(2r,3s)-7-氟-3-[[(2s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰基]氨]-2-甲基-4-氧代-2,3-二氢-1,5-苯并氧氮杂-5-基]乙氧基羰基氨基]乙基]氨基甲酸酯(10a)(1.15g，1.67mmol)在ch2cl2(5.7ml)中的溶液中滴加4mhcl在二烷中的溶液(4.2ml)。将反应混合物在25℃下搅拌1.75小时。在真空中将挥发物蒸发掉。得到的粗制物用ch2cl2/et2o研磨，得到标题化合物(997mg，96％)，其为灰白色的粉末。hplc:tr1.67min,99.1％(265nm)；tr1.67min,98.0％(220nm)。¹hnmr(600mhz,dmso-d6)：δ＝8.56(t,j＝6.55hz,1h),7.70-8.01(m,4h),7.42(dd,j＝2.87,9.62hz,1h),7.29(dd,j＝5.64,8.87hz,1h),7.21(t,j＝5.74hz,1h),7.16(dt,j＝3.02,8.46hz,1h),6.88(brs,1h),6.74(s,1h),4.64-4.68(m,1h),4.57-4.64(m,1h),4.24-4.52(m,1h),4.13-4.23(m,1h),4.05-4.12(m,2h),3.79-3.99(m,3h),3.17(q,j＝6.28hz,2h),2.86-3.12(m,1h),2.74-2.86(m,2h),2.62-2.74(m,1h),1.39(s,3h),1.21(d,j＝6.25hz,3h)。13cnmr(151mhz,dmso-d6)：δ＝172.3,170.4,168.1,160.1,158.5,156.4,146.5,146.5,136.9,136.8,124.3,124.2,120.0,114.7,114.5,113.6,113.4,111.5,111.3,82.7,76.9,61.3,51.8,47.0,39.1,38.7,38.5,38.4,24.0,15.9。lc-ms：586.17(m-h)^-。hrms(c22h27f6n5o7):计算值587.1815[m]；实验值587.1841。

实施例4-ac-γ-glu-前药(ac-γ-glu-secri)13a

(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸

步骤a)2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-苄基酯(12a)。

在0℃下在氩气中向2-氨基乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐(11a)(225mg，360μmol)和ac-glu(osu)-obzl(149mg，396μmol)在dmf(3.99ml)中的几乎无色的溶液中在15分钟内滴加1/3的et3n(40.1mg，55.2μl，396μmol)在dmf(2.40ml)中的溶液(溶液变成浅黄色)。在15分钟后，第二份三分之一量在15分钟内加入，且在15分钟后，最后的三分之一量在15分钟内加入。使反应升温至室温过夜。在lc/ms中仍然检测到起始胺。将反应再次冷却至0℃，在15分钟内滴加et3n(40.1mg，55.2μl，396μmol)在dmf(1.20ml)中的溶液，并且在1小时后加入ac-glu(osu)-obzl(135mg，360微摩尔)。使反应在4小时内升温至室温，并在室温下搅拌过夜。在蒸发后，残余物用10％khso4水溶液和etoac(3x)处理。有机相用10％khso4水溶液、nahco3饱和水溶液和10％nacl水溶液洗涤一次，将合并的有机相用na2so4干燥，过滤并蒸发。产物用et2o和正戊烷从ch2cl2中沉淀2次，得到253mg(83％)白色固体。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝8.54(t,j＝6.6hz,1h),8.28(d,j＝7.5hz,1h),7.81(t,j＝6.2hz,2h),7.33-7.43(m,6h),7.24-7.32(m,1h),7.09-7.19(m,1h),7.05(d,j＝6.3hz,1h),6.71(s,1h),5.11(s,2h),4.53-4.70(m,2h),4.23(d,j＝12.3hz,1h),4.05(br.s.,2h),3.79-3.98(m,3h),2.86-3.09(m,4h),2.08-2.19(m,2h),1.89-2.04(m,1h),1.84(s,3h),1.77(s,1h),1.39(s,3h),1.20(d,j＝5.9hz,3h)。lc-ms：849.7(m+h)⁺。

步骤b)(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(13a)。

在氩气和搅拌下将2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-苄基酯(12a)(202mg，238μmol)溶于二烷(3.81ml)和meoh(3.81ml)中，将pd-c10％，type10n(20.2mg，190μmol)加入，并在抽空并用h2取代(5次)后将混合物氢化3.5小时，然后过滤，用meoh洗涤，蒸发，在从ch2cl2用et2o沉淀后得到标题化合物化合物(148mg，82％)，其为灰白色的固体。hplc：tr1.04min,99.2％(265nm)；tr1.04min,98.2％(225nm)。1hnmr(300mhz,dmso-d6)：δ＝8.72(br.s.,1h),7.86(d,j＝6.9hz,1h),7.81(t,j＝5.5hz,1h),7.44-7.52(m,1h),7.42(dd,j＝9.7,3.0hz,1h),7.28(dd,j＝8.9,5.5hz,1h),7.14(td,j＝8.5,2.9hz,1h),7.06(t,j＝5.6hz,1h),6.80(br.s.,1h),4.66(t,j＝6.8hz,1h),4.58(quin,j＝6.3hz,1h),4.17-4.25(m,1h),4.02-4.10(m,1h),3.93-4.00(m,1h),3.82-3.93(m,4h),3.01-3.08(m,2h),2.91-3.00(m,2h),2.03-2.09(m,2h),1.85-1.91(m,1h),1.82(s,3h),1.66-1.76(m,1h),1.38(s,3h),1.22(d,j＝6.3hz,3h)。lc-ms：759.6(m+h)⁺。hrms(c29h36f6n6o11)：计算值758.2346[m]；实验值758.2341。

实施例5-h-γ-glu-前药(h-γ-glu-secri)13b

(s)-2-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸

步骤a)(s)-叔丁基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸酯(12b)。

将2-氨基乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐(11a)(299mg，480μmol)在dmf(5ml)中的溶液用boc-glu-otbu(160mg，528μmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(65mg，480μmol)处理并在0℃下用edci(101mg，528μmol)处理。在2小时内将在dmf(3.5ml)中的et3n(74μl，528μmol)分为3份非常缓慢地加入。使反应升温至室温过夜，并用10％khso4/et2o水溶液萃取(3次)。有机相用nahco3饱和水溶液和10％nacl洗涤，用na2so4干燥，并蒸发。残余物从ch2cl2中用et2o-正戊烷沉淀，得到标题化合物(422mg，定量)，其为白色固体。1hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝8.54(t,j＝6.4hz,1h),7.73-7.88(m,2h),7.40(dd,j＝10.1,3.0hz,1h),7.28(dd,j＝8.9,5.7hz,1h),7.14(td,j＝8.3,2.8hz,1h),6.99-7.10(m,2h),6.71(s,1h),4.53-4.72(m,2h),4.14(d,j＝8.1hz,1h),4.02-4.09(m,2h),3.81-3.99(m,3h),3.70(s,1h),2.88-3.09(m,4h),2.11(t,j＝7.2hz,2h),1.79-1.96(m,1h),1.59-1.77(m,1h),1.36-1.44(m,21h),1.20(d,j＝6.1hz,4h)。lc-ms：871.6(m-h-)。

步骤b)(s)-2-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸盐酸盐(13b)。

在0℃下向ch2cl2(6.8ml)和二烷(6.8ml)中的(s)-叔丁基-2-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸酯(12b)(320mg，367μmol)中滴加4mhcl在二烷(1.8ml，7.3mmol)中的溶液和一滴水。在10分钟后，将反应混合物在25℃下搅拌21小时。再次在0℃下加入在二烷(0.9ml，3.7mmol)中的4mhcl和1滴水，并在室温下3.5小时后，在真空中蒸发掉挥发物。得到的粗制物用ch2cl2/et2o研磨2次，得到标题化合物(226mg，82％；纯度为83％，17％为相应的叔丁基酯)，其为白色固体。hplc:tr1.86min,82.9％(265nm)；tr1.86min,83.4％(220nm)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝13.80(brs,1h),8.56(t,j＝6.55hz,1h),8.31(brs,3h),8.00(brt,j＝5.49hz,1h),7.82(d,j＝6.85hz,1h),7.40(dd,j＝2.82,9.67hz,1h),7.29(dd,j＝5.59,8.92hz,1h),7.15(dt,j＝2.92,8.41hz,1h),7.09(brt,j＝5.69hz,1h),6.74(s,1h),4.66(t,j＝6.70hz,1h),4.56-4.63(m,1h),4.11-4.22(m,1h),4.06(brt,j＝5.69hz,2h),3.80-3.97(m,4h),3.02-3.11(m,2h),2.923.00(m,2h),2.26-2.35(m,1h),2.16-2.24(m,1h),1.90-2.06(m,2h),1.39(s,3h),1.20(d,j＝6.25hz,3h).¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)δ171.9,171.0,170.8,170.0,167.6,159.7,158.1,155.8,146.1,146.0,136.4,136.4,123.8,123.7,114.2,114.0,111.0,110.8,83.1,82.2,76.5,60.6,51.6,51.3,46.6,40.2,40.0,39.0,38.6,38.0,30.6,27.5,25.9,25.8,23.5,15.4.lc-ms：717.3(m+h)⁺。hrms(c27h34f6n6o10):计算值716.2241[m]；实验值716.2255。

实施例6-ac-α-glu-前药(ac-α-glu-secri)15a

(s)-4-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸

步骤a)4-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-叔丁基酯(14a)。

将2-氨基乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐(11a)(530mg，850μmol)在dmf(16.1ml)中的溶液用ac-glu(otbu)-oh(229mg，935μmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(116mg,850μmol)、et3n(130μl，935μmol)处理并在0℃用edci(179mg，935μmol)处理。使反应升温至室温过夜，并用10％khso4/etoac水溶液萃取(3次)。有机相用nahco3饱和水溶液和10％nacl洗涤，用na2so4干燥，并蒸发。残余物用et2o从ch2cl2中沉淀，得到标题化合物(700mg，定量)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝8.54(t,j＝6.5hz,1h),7.94(d,j＝8.1hz,1h),7.87(t,j＝5.7hz,1h),7.82(d,j＝6.5hz,1h),7.40(dd,j＝9.6,2.9hz,1h),7.28(dd,j＝8.9,5.7hz,1h),7.14(ddd,j＝8.6,3.0hz,1h),7.03(t,j＝5.3hz,1h),6.71(s,1h),4.53-4.75(m,2h),4.10-4.23(m,2h),4.06(t,j＝5.1hz,2h),3.76-3.98(m,3h),2.85-3.16(m,4h),2.10-2.22(m,2h),1.83(s,3h),1.79-1.93(m,1h),1.57-1.75(m,1h),1.39(s,3h),1.38(s,9h),1.20(d,j＝5.9hz,3h)。lc-ms：815.3(m+h⁺)。

步骤b)(s)-4-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(15a)。

在0℃下向4-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-叔丁基酯(14a)(600mg，736μmol)在ch2cl2(13.7ml)和二烷(13.7ml)中的溶液中滴加4mhcl在二烷(3.68ml，14.7mmol)中的溶液和一滴水。在10分钟后，将反应混合物在25℃下搅拌22小时。在真空中将挥发物蒸发掉。得到的粗制物用ch2cl2/et2o研磨，得到标题化合物(455mg，81％)，其为白色固体。hplc:tr2.09min,90.7％(265nm)；tr2.09min,86.5％(220nm)。¹hnmr(600mhz,dmso-d6):δ＝11.42-12.63(m,1h),8.56(t,j＝6.50hz,1h),7.97(d,j＝8.06hz,1h),7.90(brt,j＝5.54hz,1h),7.82(d,j＝6.85hz,1h),7.40(dd,j＝2.87,9.72hz,1h),7.29(dd,j＝5.59,8.81hz,1h),7.14(dt,j＝3.02,8.41hz,1h),7.05(t,j＝5.69hz,1h),6.73(brs,1h),4.65(t,j＝6.75hz,1h),4.57-4.63(m,1h),4.26-4.46(m,1h),4.15(dt,j＝4.43,8.81hz,2h),4.05(brt,j＝5.69hz,2h),3.84-3.96(m,3h),2.89-3.12(m,4h),2.63-2.76(m,1h),2.13-2.24(m,2h),1.81-1.94(m,4h),1.63-1.72(m,1h),1.39-1.41(m,1h),1.39(s,2h),1.20(d,j＝6.25hz,3h).¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)δ173.9,171.8,171.4,170.0,169.3,167.6,159.7,158.1,155.8,146.0,136.4,136.4,123.8,123.7,119.5,117.6,114.2,114.0,113.1,112.9,111.0,110.8,82.2,76.5,64.9,60.6,51.9,51.3,46.6,38.5,38.0,30.2,27.7,27.3,26.0,23.5,22.5,15.4,15.2。lc-ms：759.3(m+h)⁺。hrms(c29h36f6n6o11):计算值758.23463[m]；实验值758.23636。

实施例7-h-α-glu-前药(h-α-glu-secri)15b

(s)-4-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸。

步骤a)(s)-叔丁基-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸酯(14b)。

将2-氨基乙基氨基甲酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯盐酸盐(11a)(265mg，425μmol)在dmf(8ml)中的溶液用boc-glu(otbu)-oh(142mg，468μmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(58mg,425μmol)、et3n(65μl，468μmol)处理并在0℃下用edci(90mg，468μmol)处理。使反应升温至室温过夜，并用10％khso4/et2o水溶液萃取(3次)。有机相用nahco3饱和水溶液和10％nacl洗涤，用na2so4干燥，并蒸发。残余物用et2o和正戊烷从ch2cl2中沉淀，得到标题化合物(373mg,定量)，其为白色固体。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝8.55(t,j＝6.6hz,1h),7.82(d,j＝6.7hz,2h),7.41(dd,j＝10.7,2.4hz,1h),7.28(dd,j＝8.9,5.7hz,1h),7.14(td,j＝8.3,2.8hz,1h),7.01(br.s.,1h),6.80(d,j＝7.5hz,1h),6.71(s,1h),4.55-4.72(m,2h),4.11-4.23(m,1h),4.07(d,j＝4.8hz,2h),3.773.99(m,4h),2.91-3.16(m,3h),2.18(t,j＝7.4hz,2h),1.74-1.89(m,1h),1.54-1.72(m,1h),1.35-1.41(m,21h),1.20(d,j＝5.9hz,3h)。lc-ms：871.6(m-h^-)。

步骤b)(s)-4-氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸盐酸盐(15b)。

在0℃下向(s)-叔丁基-4-(叔丁氧基羰基氨基)-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氨基)乙氨基)-5-氧代戊酸酯(14b)(320mg，367μmol)在ch2cl2(6.8ml)和二烷(6.8ml)中的溶液中滴加4mhcl在二烷(1.8ml，7.4mmol)中的溶液和一滴水。在10分钟后，将反应混合物在25℃下搅拌18小时。在真空中将挥发物蒸发掉。得到的粗制物用ch2cl2/etoac研磨，得到标题化合物(222mg，80％；纯度为88％，12％为相应的叔丁基酯)，其为白色固体。hplc:tr1.76min,88.0％(265nm)；tr1.76min,88.8％(220nm)。¹hnmr(300mhz,dmso-d6):δ＝12.31(brs,1h),8.56(t,j＝6.55hz,1h),8.53(brt,j＝5.59hz,1h),8.19(brs,3h),7.82(d,j＝6.95hz,1h),7.40(dd,j＝2.77,9.72hz,1h),7.29(dd,j＝5.59,8.81hz,1h),7.08-7.19(m,2h),6.74(s,1h),4.66(t,j＝6.75hz,1h),4.58-4.64(m,1h),4.11-4.20(m,1h),4.00-4.10(m,2h),3.83-3.98(m,3h),3.72(brd,j＝5.44hz,1h),3.18(td,j＝6.45,12.89hz,1h),3.07(td,j＝6.28,12.92hz,1h),3.02(q,j＝6.45hz,2h),2.23-2.34(m,2h),1.93(q,j＝7.35hz,2h),1.39(s,3h),1.21(d,j＝6.15hz,3h).¹³cnmr(151mhz,dmso-d6)δ173.2,171.9,170.0,168.2,167.6,159.7,158.1,155.8,146.0,136.4,123.8,123.7,114.2,114.0,110.9,110.8,82.2,76.5,60.7,51.7,51.3,46.6,40.0,38.9,38.9,38.6,38.2,38.0,29.1,27.7,26.1,23.5,15.4。lc-ms:717.3(m+h)⁺。hrms(c27h34f6n6o10):计算值716.2241[m]；实验值716.2254。

实施例8-胺-γ-o-分泌酶抑制剂(胺-o-secri)11b

2-氨乙基2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙基碳酸酯盐酸盐

步骤a)2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧)叔丁烷(10b)。

在氩气气氛下在0℃下向4-硝基苯基碳酸2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙酯(9)(实施例3；步骤a)(666mg，1.00mmol)在ch2cl2(8.3ml)中的溶液中滴加dmap(110mg，0.90mmol)并滴加n-boc-乙醇胺(178μl，1.10mmol)在ch2cl2(5ml)中的溶液以及et3n(193μl，1.00mmol)。将得到的反应混合物在0℃下搅拌1小时，然后在25℃下再搅拌12小时。再次在0℃下加入dmap(12.2mg,0.10mmol)以及n-boc-glycinol(32μl，0.20mmol)在ch2cl2(0.7ml)中的溶液，在25℃下搅拌5小时，然后倒入10％khso4水溶液(10ml)中。分离有机层，并用etoac(2×20ml)再萃取水溶液层。合并的有机层用无水na2so4干燥，过滤，并在真空中蒸发掉。得到的粗制物通过快速色谱法(130gsio2，cilicycle柱，ch2cl2/et2o6:1)纯化，得到标题化合物(530g，77％)，其为白色泡沫。hplc:tr1.43min,100％(225nm)。hrms(c27h34f6n4o10):计算值688.2179[m]；实验值688.218。

步骤c)2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙基碳酸2-氨乙基酯盐酸盐(11b)。

在0℃下向2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧)叔丁烷(10b)(511mg，0.74mmol)在ch2cl2(2.8ml)中的溶液中滴加4mhcl在二烷(1.86ml)中的溶液。将反应混合物在0℃下搅拌3.5小时并在25℃下搅拌0.5小时。在真空中将挥发物蒸发掉。得到的粗制物用ch2cl2/et2o研磨，得到标题化合物(424mg，91％)，其为白色粉末。hplc:tr0.85min,100％(225nm)。hrms(c22h26f6n4o8):计算值588.1655[m]；实验值588.1652。

实施例9-ac-γ-glu-o-前药(ac-γ-glu-o-secri)13c

(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧基)乙氨基)-5-氧代戊酸

步骤a)2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-甲酯(12c)。

将2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙基碳酸2-氨乙基酯盐酸盐(11b)(313mg，501μmol)在dmf(9.5ml)中的溶液用ac-glu-ome(112mg，551μmol)、1-羟基-7-氮杂苯并三唑(68mg，501μmol)处理并在0℃下用edci(115mg，601μmol)处理。非常缓慢地添加et3n(70μl，501μmol)。使反应升温至室温过夜，并用10％khso4/etoac水溶液萃取(3次)。有机相用nahco3饱和水溶液和10％nacl洗涤，用na2so4干燥，并蒸发。得到的粗制物通过快速色谱法(130gsio2，cilicycle柱，ch2cl2/meoh2-5％)纯化，得到标题化合物(300mg，52％)，其为白色泡沫。hplc:tr1.13min,100％(225nm)。hrms(c30h37f6n5o12):计算值773.2343[m]；实验值773.2333。

步骤b)(s)-2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧基)乙氨基)-5-氧代戊酸(13c)。

在0℃下向2-乙酰氨基-5-(2-((2-((2r,3s)-7-氟-3-((s)-2-羟基-2-甲基-3-氧代-3-(2,2,3,3,3-五氟丙氨基)丙酰氨基)-2-甲基-4-氧代-3,4-二氢苯并[b][1,4]氧氮杂-5(2h)-基)乙氧基)羰基氧基)乙氨基)-5-氧代戊酸(s)-甲酯(12c)(62mg，80.1μmol)在thf(0.2ml)中的溶液中滴加1nlioh水溶液(72.1μl，72.1μl)。反应在3.75小时(0℃)后用10％khso4/etoac水溶液萃取(3次)。有机相用10％nacl水溶液洗涤，用na2so4干燥，并蒸发。得到的粗制物通过快速色谱法(10gsio2，cilicycle柱，ch2cl2/meoh5-25％)纯化，得到标题化合物(17mg，28％)，其为白色泡沫。hplc:tr1.06min,100％(225nm)。hrms(c29h35f6n5o12):计算值759.2186[m]；实验值759.2181。

实施例10-式(a)的γ-分泌酶抑制剂

根据以下表1，已如wo2006/061136a2中所述制备另外的式(a)的γ-分泌酶抑制剂醇。

表1.如wo2006/061136a2中所述的制备式(a)的γ-分泌酶抑制剂醇。

实施例11-体外γ-分泌酶活性测定

本发明的式(a)的γ-分泌酶抑制性醇的γ-分泌酶活性在无细胞体外测定中确定，其中例如将含有γ-分泌酶复合物的细胞裂解物与合适的β-淀粉样前蛋白(app)衍生的底物孵育，该底物被裂解为abeta肽。产生的肽的量可以用特异性elisa测定法来确定。神经元起源的细胞系分泌abeta肽，其可以用特异性elisa测定法来测量。用抑制γ-分泌酶的化合物进行处理导致了分泌的abeta的减少，从而提供了抑制的量度。

γ-分泌酶活性的体外测定使用作为γ-分泌酶来源的hek293膜部分以及重组app底物。后者由与(用于纯化的)6x组氨酸尾部融合的人app的c-末端100个氨基酸组成，其在可调节的表达载体(例如，pet15)中在大肠杆菌中表达。该重组蛋白对应于截短的app片段，其在细胞外结构域的γ-分泌酶裂解后产生，并构成γ-分泌酶底物。测定原理描述于liymetal,pnas97(11),6138-6143(2000)。hek293细胞经机械破坏，并通过差速离心分离微粒体部分。将膜溶解在洗涤剂(0.25％chapso)中并与app底物孵育。通过所述(brockhausmetal,neuroreport9(7),1481-1486(1998))的特异性elisa测定法检测通过底物的γ-分泌酶裂解所产生的abeta肽。

本发明的式(a)的γ-分泌酶抑制性醇的ic50活性值公开在表2中。

表2.式(a)的γ-分泌酶抑制性醇的ic50值。

实施例12-体外notch信号转导通路活性测定

用于体外实验的γ-分泌酶抑制剂类似物的制备。

将化合物以10mm储备溶液溶解在二甲基亚砜(dmso)中，等分并储存在-4℃直到使用，然后在pbs或细胞培养基中稀释。在实验设置中，总是包含含有渐增浓度的dmso(对应于稀释化合物的dmso的量)的对照。对于体内实验，将化合物溶解在0.9％nacl中，在40℃孵育30分钟并超声5分钟。

体外notch信号转导通路活性测定

使用报告子测定法研究前药的蛋白水解活化对抑制经γ-分泌酶裂解的notch的要求(表3)。dr215/f2细胞系表达报告子构建体，该构建体经设计以监测notch信号转导通路的活性。dr215/f2细胞系39携带两种转基因：在gal4启动子控制下表达的萤火虫荧光素酶报告基因和与酵母gal4转录因子融合的人notch1活化基因。该测定证实了前药能够抑制γ-分泌酶以及notch通路的活化。dr215/f2细胞报告子测定法也用于确定所有经设计和制备的化合物对阻断notch通路的ic50。游离的γ-分泌酶抑制剂和胺-γ-secri和胺-o-γ-secri在低纳摩尔范围内显示出抑制作用，而非水解的前药活性要低得多，对于ac-α-glu-secri(15a)和h-α-glu-secri(15b)表现出高nm范围内的ic50值，对于h-γ-glu-secri(13b)和ac-γ-glu-secri(13a)甚至表现出显示出μm范围内的ic50值(表3)。

表3.γ-分泌酶抑制剂和前药的ic50值。

对于经由γ-分泌酶的notch活化，使用215/f2报告细胞系确定其值。所有值均为至少3次实验的平均值。

实施例13-γ-分泌酶抑制剂从前药的细胞外释放

细胞和体外测定

大鼠脑源性ec219内皮细胞的制备和表征已在juillerat-jeanneret,l.etal.invitrocell.dev.biol.1992,28a,537-543中描述。这些细胞表达高水平的apa和γ-gt活性，并可用于确定活细胞的动力学，并被选作apa-和γ-gt-阳性代表性细胞模型。在未包被的细胞培养塑料制品上，在含有1g/l葡萄糖、10％热灭活的胎牛血清(fcs，euroclone，uk)的dmem培养基中培养ec219细胞，所述培养基补充有100u/ml青霉素和100μg/ml链霉素(p/s)。hek293和hk2人肾脏细胞可从atcc(americantissueculturecollection，manassas，va，usa)获得。在含有10％fcs和p/s的iscove改良的dulbecco培养基(imdm，lifetechnologies)中，在未包被的细胞培养塑料制品中培养hek293细胞。在含有5％fcs、p/s、1％its(1.0mg/ml牛胰岛素、0.55mg/ml人转铁蛋白和0.5μg/ml亚硒酸钠，sigma-aldrich)和5ng/ml氢化可的松的dmem/f-12glutamax培养基(gibco)中，在未包被的细胞培养塑料制品上培养hk2细胞。如wo2006/061136a2和brockhaus,m.neuroreport19989,1481-1486中所描述的用pfrluc和app-notchgal(dr215质粒)稳定转染的人hek293衍生的dr215/f2胚胎肾细胞系使用补充有p/s的具有10％fcs的imdm维持，并在包被的(1:100聚-l-赖氨酸)细胞培养塑料制品上在经150μg/mlg-418和50μg/ml潮霉素b的双重选择下保存。在该测定中，notch-gal4蛋白通过其跨膜结构域结合于细胞膜。notch细胞内结构域通过由γ-分泌酶介导的蛋白水解裂解释放，并移动到细胞核，在那其激活报告荧光素酶基因转录本。γ-分泌酶的抑制因此降低了荧光素酶活性。简言之，培养物在96孔微孔板中生长至80％汇合；然后将细胞在pbs中洗涤，并在37℃下在没有红色酚的imdm完全培养基中暴露于渐减浓度的γ-分泌酶抑制剂类似物达19小时。然后除去每个孔中的75μl上清液，并通过加入25μl的steady-glo荧光素酶测定试剂(promega)来确定荧光素酶活性。在室温下孵育后(对于ic50测定为180分钟，对于评价notch活化为20分钟)，对于ic50和notch活化，在微板光度计(spectramaxparadigm，moleculardevices)或synergymx(monochromator，biotek)中分别测量各个微孔的荧光，并使用graphpad软件分析值。

组织酶谱法

如juillerat-jeanneret,l.etal.,labinvest.2000,80,973-980所述，通过组织酶谱法在冷冻组织上对apa和γ-gt酶活性进行评估。简言之，在低温恒温器中将oct包埋的冷冻肾脏切成7μm切片，在冷(-20℃)丙酮中固定5分钟，在室温下风干并在0.9％nacl中再水合5分钟。从商业来源(来自bachem的α-glu-4-甲氧基-β-萘酰胺(apa)；和来自serva的γ-glu-4-甲氧基-β-萘酰胺(γ-gt))获得萘酰胺底物。将底物(1mg)溶解于1mldmf中，并将2mgfastblueb(sigma-aldrich)溶解于含有700mg/lcacl2的2ml0.2m二甲胂酸盐缓冲液(ph7.4)中；然后将两种溶液在使用前立即缓慢混合并将ph调至6.5-7.0。如果出现一些沉淀，则过滤溶液，将溶液加至载玻片并在37℃下在加湿气氛中孵育15至60分钟，直到可见红色着色。将载玻片在蒸馏水中洗涤，用苏木精(mayer)复染1分钟，用自来水漂洗，然后施加scott溶液1分钟，在自来水下漂洗，安装于aquamount(immu-mount，thermoshandonpittsburgh，pa，usa)，并使用act-1软件经nikoneclipsee800显微镜和dxm1200数字相机进行分析。

γ-分泌酶抑制剂从前药的细胞外释放

在体外进行不同γ-分泌酶前药的首次筛选以确定各个化合物的裂解速率和在小鼠肾组织中的离体。对于释放活性抑制剂secri(8)或胺-secri(11a)，通过人肾脏细胞(hek293，hek293衍生的notch报告基因215/f2细胞28、39，和hk2细胞)以及表达非常高水平的apa和γ-gt活性的大鼠脑源性ec219内皮细胞对γ-分泌酶抑制剂从前药的细胞外释放进行评估(图2a)。ec219和hk2细胞(而不是hek293细胞)能够以涉及apa活性的模式将胺-secri(11a)(而不是游离抑制剂(8))从h-α-glu-secri(15b)释放至细胞外空间中。ac-α-glu(15a)衍生物不是该酶的底物，并且ac-γ-glu-secri(13a)衍生物不被γ-gt水解。但是更令人惊奇的是，游离的h-γ-glu-secri(15a)也不被γ-gt水解。

为了证实ac-γ-glu-secri(13a)可为用于相关细胞酶活性的底物，我们通过酶组织化学确定了ac-γ-glu-secri(13a)前药是否可抑制α-glu-萘酰胺和γ-glu-萘酰胺衍生物的水解，apa活性作为阴性酶对照且胺-secri(11a)作为用于非患病小鼠的离体肾脏中的阴性对照的药物(图2b)。只有ac-γ-glu-secri(13a)(而不是ac-α-glu-secri(15a)或胺-secri(11a))能够抑制γ-gt样活性，而apa活性不被任何化合物抑制。因此，这些结果清楚地表明，ac-γ-glu-secri(13a)前药抑制了γ-gt的细胞外活性和/或细胞内γ-gct活性，这表明活性抑制剂的释放在细胞内进行。

实施例14-在c57bl/6健康野生型小鼠和雄性wistar大鼠中的药代动力学评估

γ-分泌酶抑制剂及其类似物在细胞中和在小鼠或雄性wistar大鼠血浆、肝脏和肾脏中的定量和药代动力学(pk)。

使用蛋白质沉淀并随后进行lc-ms/ms分析来分析所有样品。在与细胞孵育之后，收集细胞外培养基，并用3倍体积的乙腈猝灭，所述乙腈含有100ng/ml的奥沙西泮(oxazepam)作为内标(istd)。在分析之前，制备的样品在-20℃下储存。在室温(rt)下解冻后，将样品搅拌并以5600rpm(6℃，10分钟)离心。通过lc/ms分析1μl上清液。所用的lc柱和条件是：phenomenex，polarrp，4μm，50x1mm，0.15ml/min流速，具有从100％溶剂a至100％溶剂b的1min非线性梯度(溶剂a：水/甲醇/hcooh，95:5:0.5；溶剂b：甲醇)。质谱条件为：absciexapi4000，在ms/ms模式下具有正加热电喷雾电离。监测的化合物质量跃迁(transition)如表4所述：

表4.化合物质量跃迁

孵育的药物及代谢物的相对浓度通过与时间零加标(spiked)化合物相比的峰面积比的百分比来确定。

对于pk评估，使用4ml/kg的给药体积以悬浮剂(在水中明胶/盐水7.5％/0.62％)将化合物腹膜内给药至雄性c57bl/6小鼠。将血液样品收集在含有edta的管中，通过离心分离血浆并储存在-80℃。使用precellys组织匀浆管(precellys.com)将肝脏和肾脏样品(～100mg等分)在三倍体积的水中匀浆。25μl的每个组织匀浆进一步用25μl空白血浆稀释，以产生用于提取的最终组织匀浆。使用蛋白质沉淀并随后进行lc-ms/ms分析来分析所有样品。简言之，将50μl血浆或最终组织匀浆与50μl的0.5mhclo4/乙腈9/1(含有200ng/ml的内标波生坦)混合。搅拌样品，并加入300μl水，然后以5600rpm(4℃，10分钟)离心。通过lc/ms分析对10μl上清液进行分析。血浆中的校准用标准以相同的方式制备。所用的lc柱和条件是：phenomenex，polarrp，4μm，50x2.1mm，0.4ml/min流速，具有从95％溶剂a至95％溶剂b的3min梯度(溶剂a：水/acn/hcooh，90:10:0.1+10mm甲酸铵；溶剂b：水/acn/hcooh，10:90:0.1+10mm甲酸铵)。质谱条件为：thermotsqvantage，在ms/ms模式下具有正加热电喷雾电离。监测的化合物质量跃迁为m/z320.7至119.9。使用phoenixwinnonlin软件计算所有研究的pk参数。

c57bl/6健康野生型小鼠的药代动力学评估

我们接下来确定在非患病小鼠中经设计的前药在血浆、肝脏和肾脏中的稳定性、组织分布和裂解速率。在体内筛选中，将γ-分泌酶抑制剂前药ac-γ-glu-secri(13a)、ac-α-glu-secri(15a)和h-α-glu-secri(15b)的动力学和分布与活性γ-分泌酶抑制剂胺-secri(11a)相比较。在c57bl/6小鼠中腹膜内给药(10mg/kg)之后，在血浆、肝脏和肾脏中比较前药的消失和活性胺-secri(11a)的形成(表5)。首先，我们确定了在腹膜内给药后胺-secri(11a)的药代动力学(pk)行为(表5a)。正如所预期的，胺-secri(11a)具有非常低的血浆暴露，这表明快速的血浆清除率。肝脏和肾脏的暴露则高得多，与肾脏相比，肝脏中的暴露大约为4.5倍高。正如对于前药ac-γ-glu-secri(13a)所预期的那样，我们在0.5小时看到向胺-secri(11a)的高转化率，其基本上完全是肾脏选择性的，没有可检测到的血浆浓度(表5b)。对肾脏的选择性似乎随着时间降低，这可能是由于胺-secri(11a)的快速清除率和再平衡。然而，在较早时间点的高选择性保证了肾脏中总的暴露与肝脏相比要高得多。ac-α-glu-secri(15a)前药以比ac-γ-glu-secri(13a)低得多的程度被转化为胺-secri(11a)，且在肝脏(400％)中比在肾脏中转化更多(表5c)。h-α-glu-secri(15b)显示出转化为胺-secri(11a)的整体最高转化率，但又一次在肝脏中(在0.5小时为700％)比肾脏中更高效(表5d)。总之，这些结果清楚地表明，ac-γ-glu-secri(13a)的低血浆暴露是由于肝脏和肾脏的快速摄取，随后通过肾选择性水解形成胺-secri(11a)而不是在血浆中直接水解，这是因为在血浆中胺-secri(11a)在所有时间点均低于检测限。我们从未观察到显著量的11a中的连接体的水解(生成游离的拮抗剂8)。

表5.γ-分泌酶抑制剂类似物的腹膜内注射(10mg/kg)后在非患病小鼠的血浆、肝脏和肾脏中活性药物的分布。

在c57b/6小鼠中10mg/kg腹膜内给药之后(由于稀疏取样而没有给出标准偏差；每时间点n≤3只小鼠)确定给药化合物(a-d)和形成的胺-secri(11a)(b-d)的血浆和组织浓度。括号中的数字表示相对量，其中将肾脏中的11a暴露在每个时间点任意设定为100％。没有检测到游离的γ-分泌酶抑制剂8。bql＝低于可量化限。

实施例15-胺-secri(11a)及其前药ac-γ-glu-secri(13a)在急性肾损伤的小鼠模型中的作用

诱发急性肾脏疾病的动物模型

所有使用动物的实验均按照联邦和地方法规在相应的研究地点进行。通过在10周龄的balb/c雄性小鼠中腹膜内注射马兜铃酸(aa，sigma-aldrich，1x5mg/kg)引起肾损伤。将γ-分泌酶抑制剂前药在0.9％的nacl中稀释，并在注射aa前一天(第-1天)开始腹膜内给药，然后每天两次，直到第6天晚上(n＝5只小鼠/实验组)。在第7天上午(在最后一次前药注射后12小时)，收集血液，处死小鼠以除去肝脏和两个肾脏。肾脏被切成四个片段。一个片段在液氮中立即冷冻，一个片段包含在oct(tissue-tek，vwrinternational，switzerland)中并冷冻，一个片段在-80℃下冷冻，且一个片段固定在4％多聚甲醛中并包含在石蜡中。

在暴露于马兜铃酸和ac-γ-glu-secri(13a)的小鼠肾脏中notch1和裂解的notch1的免疫组化

oct包埋的冷冻肾脏被切成7μm。将切片空气干燥，在冷(-20℃)甲醇中固定10分钟，在0.1％tritonx-100的pbs(pbs/triton)中漂洗，并用含有5％牛血清白蛋白(bsa)的pbs/triton封闭30分钟。兔抗-notch1抗体(d1e11，1/50稀释)和兔抗-裂解notch1抗体(val1744，1/50稀释)购自cellsignaling，生物素化的抗兔抗体(1/500稀释)来自vectorlaboratories且链霉抗生物素蛋白/hrp(1/500稀释)来自dako。将一抗在含有5％bsa的pbs中稀释，并在室温下与切片孵育1小时。分别使用3％h2o2和抗生物素蛋白/生物素封闭试剂盒(vectorlaboratories)封闭内源性过氧化物酶和生物素。将载玻片用pbs/triton洗涤三次，并在室温下与抗兔生物素二抗孵育1小时，所述二抗在与一抗相同的缓冲液中稀释。用pbs洗涤三次后，将载玻片与链霉抗生物素蛋白/hrp抗体在室温下孵育1小时，然后加入3,3’-二氨基联苯胺(dab，dako)15分钟。将载玻片在蒸馏水中洗涤，安装在aquamount中并进行分析。

胺-secri(11a)及其前药ac-γ-glu-secri(13a)在急性肾损伤的小鼠模型中的作用

为了研究使用γ-分泌酶抑制的notch阻断的潜在肾脏保护作用，并评估我们的酶靶向前药策略的作用，我们使用了急性肾小管损伤的体内aa小鼠模型。aa是对肾小管上皮细胞有毒的天然草药成分，诱导凋亡，再生受损以及近端肾小管上皮细胞的自噬导致了进行性肾小管萎缩和不可逆的肾衰竭。在单剂量给药中显示出高肾暴露的胺-secri(11a)(表5a)以10mg/kg每日两次(b.i.d)给药，并且其前药ac-γ-glu-secri(13a)以30mg/kg每日两次给药，在腹膜内注射单剂量的aa之前一天开始治疗。与胺-secri(11a)相比，我们选择以较高剂量给药前药(13a)，以补偿在单剂量pk期间(表5和上述)对于活性胺-secri(11a)实现的肾暴露的相对差异。在第7天，在最后一次前药给药后12小时，处死动物，收集血浆、肝脏和肾脏样品用于确定暴露(表6)以及免疫组化(图3)，以评估notch1和裂解的notch1。我们检测到甚至在给药后12小时胺-secri(11a)在肾脏和肝脏的高度暴露(表6a)，以及在ac-γ-glu-secri(13a)组中胺-secri(11a)的相对较低暴露(表6b和表6c)，这证实了如从pk实验中所预测的我们的剂量选择(也与表5中的7小时时间点进行比较)。在仅ac-γ-glu-secri(13a)处理的动物中具有对于肾脏暴露的潜在选择性(表6b)，但由于时间点较晚而难以确定。在aa处理和ac-γ-glu-secri(13a)处理的动物中我们还观察到小的选择性(表6c)，这表明前药裂解的作用在患病的肾脏中仍然起作用。在免疫组化评价(图3)中，我们观察到在不存在前药的情况下在aa处理的小鼠的患病肾脏中notch1和裂解的notch1的表达上调，其在aa暴露的小鼠以及(11a)处理的或(13a)处理的小鼠中是减少的(图3)，这表明n-酰基转移酶-γ-gt靶向的γ-分泌酶前药在控制急性肾损伤中notch通路的活化方面具有有益效果。单独注射的(11a)或(13a)均不导致对健康野生型小鼠的肾脏中notch或裂解的notch水平的任何改变(结果未显示)。总体而言，这些实验表明n-乙酰基-γ-谷氨酰前药(13a)在体内被裂解成胺-secri(11a)，而不是游离的γ-分泌酶抑制剂(8)，其是肾特异性的，并且在体内通过急性损伤的肾小管细胞中表达的酶裂解后具有活性从而控制notch通路的活化。

表6.γ-分泌酶抑制剂类似物的腹膜内注射后在暴露于马兜铃酸的小鼠的血浆、肝脏和肾脏中活性药物的分布。

在aa处理的c57b/6小鼠(在第2天进行aa处理)中以10mg/kg每天两次(表6a)或以30mg/kg每天两次(表6b-c)的8日重复腹膜内给药之后确定给药化合物(表6a-c)和形成的游离γ-分泌酶抑制剂(8)(表6a)或胺-secri(11a)(表6b-c)的血浆和组织浓度。括号中的数字表示相对量，其中将肾脏中的11a暴露在每个时间点任意设定为100％。在(13a)处理的小鼠中没有检测到游离的γ-分泌酶抑制剂(8)。bql＝低于可量化限。

实施例16-secri(11a)及其前药ac-γ-glu-secri(13a)和ac-α-glu-o-secri(13c)在大鼠中的稳定性

雄性wistar大鼠的药代动力学评估

我们接下来确定在雄性wistar大鼠中经设计的前药在血浆、肝脏和肾脏中的稳定性、组织分布和裂解速率。在体内筛选中，将前药ac-γ-glu-secri(13a)和ac-γ-glu-o-secri(13c)的动力学和分布与活性γ-分泌酶抑制剂胺-secri(8)相比较。在雄性wistar大鼠中的静脉注射之后，在血浆、肝脏和肾脏中比较前药的消失和活性胺-secri(11a)、胺-o-secri(11b)和secri(8)的形成(表7a-c)。首先，我们确定了在静脉注射给药后secri(8)的药代动力学(pk)行为(表7a)。正如所预期的，secri(8)具有良好的血浆暴露和快速的血浆清除率。肝脏和肾脏的暴露则高得多，在肝脏和肾脏中具有相同的暴露。正如对于前药ac-γ-glu-secri(13a)所预期的那样，我们在0.25小时看到向胺-secri(11a)的高转化率，其基本上完全是肾脏选择性的，没有可检测到的活性γ-分泌酶抑制剂11a和8的血浆浓度(表7b)。随着时间的推移，对肾脏的选择性保持不变。碳酸酯类似物ac-γ-glu-o-secri(13c)前药以比ac-γ-glu-secri(13a)低的程度转化为胺-o-secri(11b)，但更多地转化为无连接体的γ-分泌酶抑制剂8(表7c)。胺-o-secri(11b)在早期时间点具有非常好的肾脏选择性，但是更加显著的游离γ-分泌酶抑制剂8在所有时间点上仅具有中等的肾脏选择性。活性γ-分泌酶抑制剂8和11b二者在早期时间点上在血浆中显示出可检测的浓度，这证明了碳酸酯连接体不太适用于动物中最佳的肾脏选择性。总之，这些结果清楚地表明，ac-γ-glu-secri(13a)的低血浆暴露是由于血浆中的良好稳定性，肝脏和肾脏的快速摄取，随后通过肾选择性水解以形成胺-secri(11a)而不是在血浆中直接水解。

对于ac-γ-glu-secri(13a)，我们从未观察到显著量的11a中的连接体的水解(生成游离的γ-分泌酶抑制剂8)。相反，紧密相关的ac-γ-glu-o-secri(13c)前药被显著转化为无连接体的γ-分泌酶抑制剂8，令人遗憾的是在血浆中也是如此。这证明了需要连接体和前药机制的特异性组合来实现选择性转运和裂解，从而避免活性γ-分泌酶抑制剂的不需要的血浆和/或组织暴露。

表7.γ-分泌酶抑制剂类似物的静脉注射之后在非患病大鼠的血浆、肝脏和肾脏中活性药物的分布。

在大鼠中静脉给药后确定给药化合物(a-c)和形成的胺-secri(11a)、胺-o-secri(11b)或secri(8)(b-c)的血浆和组织浓度(由于稀疏取样而没有给出标准偏差；每时间点n≤3只大鼠)。括号中的数字表示相对量，其中将在每个时间点上肾脏的暴露任意设定为100％。在ac-γ-glu-secri(13a)给药之后没有检测到游离的γ-分泌酶抑制剂8。bql＝低于可量化限。