发明领域本发明涉及实现信号传导通路的融合蛋白质和截短的蛋白质，所述通路在操纵或调节免疫细胞激活之后得以传播。发明背景用自体t细胞的过继性免疫疗法涉及从患者中分离t细胞，然后进行它们的离体刺激，修饰和/或扩增以产生显示抗肿瘤特异性的t细胞群体。一旦重新输注到患者中，这些细胞能够识别肿瘤表达的抗原并介导肿瘤排斥。这种方法已经在不同设置中的大量的试验中显示出具有成为强力的，有效的和长期的癌症治疗的潜力。例如，可以通过离体扩增的ebv特异性t细胞有效治疗ebv驱动的肿瘤，如实体器官移植后的淋巴组织增生性疾病。非病毒性恶性肿瘤的类似疗法涉及肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)，其分离自切除的肿瘤片段且然后经受使用自体肿瘤样品的刺激和扩增。然后将显示肿瘤反应性的扩增的t细胞培养物重新输注到患者中。并非用重复暴露至抗原来选择和改善t细胞特异性，可以通过基因修饰和导入肿瘤特异性t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)来赋予t细胞期望的抗肿瘤特异性。离体扩增这些细胞以生产足够数量的细胞来实现患者内有意义的临床反应。但是，上面详述的方法有局限性。例如由于信号传导不足、缺少il2或分化，过继性转染的t细胞可以表现出有限的体内存留和扩增。作为进一步的例子，过继性转染的t细胞可能会屈服于肿瘤微环境内的抑制性刺激。例如，它们可能会变得耗竭，由于过度激活而经历激活诱导的细胞死亡，或者可能导致靶向肿瘤外效应(on-targetoff-tumoureffects)。激活治疗性抗肿瘤免疫的另一种有前景的方法是阻断免疫检查点。免疫检查点是指免疫系统的各种抑制途径，其对于维持自身耐受性和调节外周组织中生理性免疫应答的持续时间和幅度是重要的。已知肿瘤利用某些免疫检查点途径作为免疫抗性，特别是针对肿瘤抗原特异性的t细胞免疫抗性的主要机制。许多免疫检查点由配体-受体相互作用启动，这意味着它们可被抗体阻断或被重组形式的配体或受体调节。细胞毒性t淋巴细胞相关抗原4(ctla4)抗体是获得美国食品和药物管理局(fda)批准的首个该类别的免疫治疗剂。最近，已经开发了另外的免疫检查点蛋白质的阻断剂，例如程序性细胞死亡蛋白1(pd1)，并显示出增强抗肿瘤免疫。使用免疫检查点抑制剂的一个问题是由众多配体：受体相互作用触发众多抑制途径。使用抗体或重组形式的配体/受体将仅阻断一种此类的抑制性途径，留下肿瘤可以使用其他分子来补偿特定的免疫检查点阻断的可能性。发明概述本发明人已经开发了用于调节和/或操纵免疫细胞(例如t细胞和自然杀伤(nk)细胞)中的信号传导途径的系统。通过蛋白质的可逆的翻译后修饰来起始和控制细胞内信号传导途径。本发明人已经确定了可以通过包含来自直接t细胞信号传导蛋白(immediatet-cellsignaltransductionproteins)的sh2结构域的融合蛋白质或截短的蛋白质来调节和/或操纵t细胞中激活和抑制性信号传导。换而言之，可以通过包含来自能够结合磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)或磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的蛋白质的sh2结构域的融合蛋白质或截短的蛋白质来激活或抑制t细胞中的信号传导通路。因此，在第一方面，本发明提供了细胞，其包含嵌合抗原受体(car)和信号传导修饰蛋白，所述信号传导修饰蛋白选自以下之一：(i)截短的蛋白质，其包含sh2结构域，但缺少激酶结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质；(ii)截短的蛋白质，其包含sh2结构域，但缺少磷酸酶结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质；(iii)融合蛋白质，其包含(a)含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)异源结构域。信号传导修饰蛋白可以是截短的蛋白质，其包含zap70sh2结构域但缺少zap70激酶结构域。信号传导修饰蛋白可以是截短的蛋白质，其包含ptpn6sh2但缺少ptpn6磷酸酶结构域。信号传导修饰蛋白可以是截短的蛋白质，其包含shp-2sh2结构域但缺少shp-2磷酸酶结构域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)sh2结构域；和(ii)磷酸酶结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质。融合蛋白质例如可以包含zap70sh2结构域、ptpn6或shp-2磷酸酶结构域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)sh2结构域；和(ii)激酶结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质。融合蛋白质可以包含来自ptpn6或shp-2的sh2结构域。融合蛋白质可以包含zap70激酶结构域。融合蛋白质可以包含akt或jak激酶结构域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。融合蛋白质可以包括来自zap70、ptpn6或shp-2的sh2结构域。异源信号传导结构域可以来自通常不被含有itam或itim的受体激活的信号传导分子。异源信号传导结构域可以是共刺激性结构域。在该方面，融合蛋白质可以包含cd28、ox40或41bb共刺激性结构域异源信号传导结构域可以是抑制性结构域。在该方面，抑制性结构域可以是或包含cd148或cd45的胞内域(endodomain)。或者，异源信号传导结构域是或包含icos、cd27、btla、cd30、gitr或hvem的胞内域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)sh2结构域；和(ii)含有itam的结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质。融合蛋白质包含zap70sh2结构域。含有itam的结构域是或包含cd3-zeta的胞内域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)sh2结构域；和(ii)含有itim的结构域，所述sh2结构域来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质。融合蛋白质可以包含来自ptpn6或shp-2的sh2结构域。含有itim的结构域可以是或包含来自pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3的胞内域。信号传导修饰蛋白可以是融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域。融合蛋白质包含来自zap70、ptpn6或shp-2的sh2结构域。蛋白酶结构域是或包含烟草蚀刻病毒蛋白酶(tev)。细胞还可以包含具有蛋白酶切割位点的膜栓系转录因子(membrane-tetheredtranscriptionfactor)。蛋白酶切割位点处的切割释放转录因子而导致靶基因的表达增加。靶基因编码细胞因子，例如选自下组的细胞因子：il-2、il-7、il-15和il-12。在该实施方案中，嵌合抗原受体(car)可以是包含细胞内蛋白酶切割位点的靶car。靶car可以包含激活性或共刺激性胞内域，并且在蛋白酶切割位点处的切割从靶car除去胞内域。或者，靶car可以包含抑制性胞内域，并且在蛋白酶切割位点处的切割从所述靶car除去所述抑制性胞内域。抑制性胞内域可以包含cd148或cd45胞内域。本发明的细胞可以包含两种car：包含含有itam的胞内域的激活性(activating)car；和如上定义的靶car。或者，本发明的细胞可以包含两种car：包含含有itim的胞内域的抑制性car；和如上定义的靶car。在第二方面，本发明提供了核酸构建体，其包含：编码嵌合抗原受体的第一核酸序列；和编码如本发明第一方面中相关定义的截短的蛋白质或融合蛋白质的第二核酸序列。核酸构建体还可以包括编码如上定义的膜栓系转录因子的第三核酸序列。核酸构建体还可以包含编码如上定义的靶car的第三核酸序列。核酸构建体还可以包含编码如上定义的激活性car或抑制性car的第四核酸序列。在第三方面，载体，其包含根据本发明第二方面的核酸构建体或如上定义的第一和第二，以及任选地第三和/或第四核酸序列。还提供了载体组，其包含如上定义的第一和第二，以及任选地第三和/或第四核酸序列。载体或载体组可以是逆转录病毒或慢病毒载体。在第四方面，提供了药物组合物，其包含多个根据本发明第一方面的细胞。在第五方面，提供了根据本发明第四方面的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。在第六方面，提供了治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据本发明第四方面的药物组合物的步骤。方法还可以包括以下步骤：(i)从受试者分离含有细胞的样品；(ii)用根据本发明第二方面的核酸构建体，根据本发明第三方面的载体或载体组转导或转染所述细胞；并且(iii)向受试者施用来自(ii)的细胞。在第七方面，提供了根据本发明第四方面的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。所述疾病可以是癌症。在第八方面，提供了制备根据本发明第一方面的细胞的方法，其包括向所述细胞导入：根据本发明第二方面的核酸构建体，根据本发明第三方面的载体或载体组。细胞可以来自从受试者分离的样品。在第一进一步的方面中，本发明还提供了融合蛋白质，其包含：(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)异源结构域。融合蛋白质可以包含zap70sh2结构域和含有itam的结构域。所述含有itam的结构域可以是或包含cd3-zeta的胞内域。融合蛋白质可以包含ptpn6sh2结构域和含有itim的结构域。所述含有itim的结构域可以是或包含来自pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3的胞内域。融合蛋白质可以包含ptpn6sh2结构域并与zap70激酶结构域融合。融合蛋白质可以包含zap70sh2结构域并与ptpn6激酶结构域融合。融合蛋白质可以包含(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。异源信号传导结构域可以来自通常不被含有itam的受体激活的信号传导分子。异源信号传导结构域可以是或来自cd28、41bb或ox40的胞内域。异源信号传导结构域可以是或来自icos、cd27、btla、cd30、gitr或hvem的胞内域。融合蛋白质可以包含：(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)激酶结构域。激酶结构域可以是或包含akt或jak激酶结构域。融合蛋白质可以包含：(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域。蛋白酶结构域可以是或包含烟草蚀刻病毒蛋白酶(tev)。在第二进一步的方面中，本发明提供了截短的蛋白质，其包含zap70sh2结构域但缺少zap70激酶结构域。在第三进一步的方面中，本发明提供了截短的蛋白质，其包含ptpn6sh2结构域但缺少ptpn6激酶结构域。本发明还提供了信号传导系统，其包含：(i)受体，其包含抗原结合域，跨膜域和包含cd3zeta胞内域的细胞内信号传导结构域；和(ii)根据本发明的第一进一步的方面中的包含zap70sh2结构域的融合蛋白质；或根据本发明的第二进一步的方面中的截短的蛋白质；其中抗原与抗原结合域的结合导致cd3zeta胞内域与融合/截短的蛋白质之间的结合。本发明还提供了信号传导系统，其包含：(i)受体，其包含抗原结合域，跨膜域和包含ptpn6结合结构域的细胞内信号传导结构域；和(ii)根据本发明的第一进一步的方面中的包含ptpn6sh2结构域的融合蛋白质；或根据本发明的第三进一步的方面中的截短的蛋白质；其中抗原与抗原结合域的结合导致ptpn6结合结构域与融合/截短的蛋白质之间的结合。受体可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。在第四进一步的方面中，本发明提供了编码根据第一进一步的方面中的融合蛋白质或根据第二或第三进一步的方面中的截短的蛋白质的核酸。在第五进一步的方面中，本发明提供了核酸构建体，其包含编码融合蛋白质的核酸序列，所述融合蛋白质包含(1)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)和编码膜栓系转录因子的核酸序列，所述膜栓系转录因子包含：(i)膜栓系物(membranetether)；(ii)蛋白酶识别位点；和(iii)转录因子。在第六进一步的方面中，本发明提供了核酸构建体，其包含：(a)编码根据本发明的第一进一步的方面中的包含ptpn6sh2结构域的融合蛋白质的核酸序列，或编码根据本发明的第三进一步的方面中的截短的蛋白质的核酸序列；和(b)编码包含含有itim的胞内域的受体的核酸分子。在第七进一步的方面中，本发明提供了核酸构建体，其包含编码融合蛋白质的核酸序列和编码包含蛋白酶切割位点的受体的核酸序列，该融合蛋白质包含(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)。在第八进一步的方面中，本发明提供了核酸构建体，其包含：(a)编码融合蛋白质的核酸序列，该融合蛋白质包含(i)ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)。(b)编码包含蛋白酶切割位点的受体的核酸序列；和(c)编码包含含有itim的胞内域的受体的核酸序列。受体可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。适当地，在根据本发明的第八进一步的方面中的核酸构建体中，核酸序列(b)可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，其包含：(i)在跨膜域和激活性胞内域之间的蛋白酶切割位点；或(ii)经由蛋白酶切割位点融合至抑制性胞内域的激活性胞内域。在第九进一步的方面中，本发明提供了载体，其包含根据本发明第四进一步的方面中的核酸或根据本发明第五至第九进一步的方面中的核酸构建体。载体可以是逆转录病毒载体或慢病毒载体。在第十进一步的方面中，本发明提供了细胞，其包含根据本发明第一进一步的方面中的融合蛋白质或根据本发明第二或第三进一步的方面中的截短的蛋白质。在第十一进一步的方面，本发明提供了细胞，其包含(a)根据本发明第一进一步的方面中的包含ptpn6sh2结构域的融合蛋白质；或根据本发明第三进一步的方面中的截短的蛋白质；和(b)包含含有itim的胞内域的受体。细胞可以是免疫细胞，如t细胞或自然杀伤(nk)细胞。在第十二进一步的方面，本发明提供了包含融合蛋白质的细胞，该融合蛋白质包含(i)zap70或ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)和包含蛋白酶切割位点的受体。在第十三进一步的方面，本发明提供了细胞，其包含：(a)融合蛋白质，其包含(i)ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)(b)包含蛋白酶切割位点的受体；和(c)包含含有itim的胞内域的受体。受体可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。受体(b)可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，其包含：(i)在跨膜域和激活性胞内域之间的蛋白酶切割位点；或(ii)经由蛋白酶切割位点融合至抑制性胞内域的激活性胞内域。在第十四进一步的方面，本发明提供了细胞，其包含根据本发明第四进一步的方面中的核酸或根据本发明第五至第九进一步的方面中任一项的核酸构建体。在第十五进一步的方面中，本发明提供了药物组合物，其包含多个根据本发明第十至第十四进一步的方面中任一项的细胞。在第十六进一步的方面中，本发明提供了根据本发明第十五进一步的方面中的药物组合物，其用于治疗和/或预防疾病。在第十七进一步的方面中，本发明涉及治疗和/或预防疾病的方法，其包括向受试者施用根据第十五进一步的方面中的药物组合物的步骤。所述方法可以包括以下步骤：(i)从受试者分离含有t细胞或nk细胞的样品；(ii)用根据本发明第四至第九进一步的方面中任一项的核酸或根据本发明第十进一步的方面中的载体转导或转染所述t细胞或nk细胞；并且(iii)向受试者施用来自(ii)的t细胞或nk细胞。在第十八进一步的方面中，本发明涉及根据本发明第十五进一步的方面中的药物组合物在制备用于治疗和/或预防疾病的药物中的用途。疾病可以是癌症。在第十九进一步的方面中，本发明提供了试剂盒，其包含根据本发明第四进一步的方面中的核酸或根据本发明第五至第八进一步的方面中任一项的核酸构建体或根据本发明第九进一步的方面的载体。在第二十进一步的方面中，本发明涉及试剂盒，其包含根据本发明第十至第十四进一步的方面中任一项的细胞。在第二十一进一步的方面中，本发明涉及制备根据本发明第十至第十四进一步的方面中任一项的的细胞的方法，其包括向所述细胞导入：根据本发明第四至第八进一步的方面中任一项的核酸序列或根据本发明第九进一步的方面的载体。细胞可以来自从受试者分离的样品。本发明的更进一步的方面总结在以下段落中：a1.截短的蛋白质，其包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，但缺少激酶结构域。a2.根据段落a1的截短的蛋白质，其包含zap70sh2结构域但缺少zap70激酶结构域。b1.截短的蛋白质，其包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域，但缺少磷酸酶结构域b2.根据段落b1的截短的蛋白质，其包含ptpn6sh2结构域但缺少ptpn6磷酸酶结构域。b3.根据段落b1的截短的蛋白质，其包含shp-2sh2结构域但缺少shp-2磷酸酶结构域。c1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)磷酸酶结构域。c2.根据段落c1的融合蛋白质，其包含zap70sh2结构域。c3.根据段落c1或c2的融合蛋白质，其包含ptpn6或shp-2磷酸酶结构域。d1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)激酶结构域。d2.根据段落d1的融合蛋白质，其包含来自ptpn6或shp-2的sh2结构域。d3.根据段落d1或d2的融合蛋白质，其包含zap70激酶结构域。d4.根据段落d1或d2的融合蛋白质，其包含akt或jak激酶结构域。e1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。e2.根据段落e1的融合蛋白质，其包含来自zap70、ptpn6或shp-2的sh2结构域。e3.根据段落e1或e2的融合蛋白质，其中所述异源信号传导结构域来自通常不被含有itam或itim的受体激活的信号传导分子。e4.根据段落e1、e2或e3的融合蛋白质，其中所述异源信号传导结构域是共刺激性结构域。e5.根据段落e4的融合蛋白质，其包含cd28、ox40或41bb共刺激性结构域e6.根据段落e1、e2或e3的融合蛋白质，其中所述共刺激性结构域是抑制性结构域。e7.根据段落e6的融合蛋白质，其中所述抑制性结构域包含cd148或cd45的胞内域。e8.根据段落e6的融合蛋白质，其中所述异源信号传导结构域是或包含icos、cd27、btla、cd30、gitr或hvem的胞内域。f1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)含有itam的结构域。f2.根据段落f1的融合蛋白质，其包含zap70sh2结构域。f3.根据段落f1或f2的融合蛋白质，其中所述含有itam的结构域是或包含cd3-zeta的胞内域。g1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)含有itim的结构域。g2.根据段落g1的融合蛋白质，其包含来自ptpn6或shp-2的sh2结构域。g3.根据段落g1或g2的融合蛋白质，其中所述含有itim的结构域是或包含来自pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3的胞内域。h1.融合蛋白质，其包含(i)来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域。h2.根据段落h1的融合蛋白质，其包含来自zap70、ptpn6或shp-2的sh2结构域。h3.根据段落h1或h2的融合蛋白质，其中所述蛋白酶结构域是或包含烟草蚀刻病毒蛋白酶(tev)。i1.核酸序列，其编码根据段落a或b中任一项的截短的蛋白质，或根据段落c、d、e、f、g或h中任一项的融合蛋白质。j1.核酸构建体，其包含根据段落i的核酸序列和编码嵌合抗原受体的核酸序列。j2.核酸构建体，其包含根据段落i的核酸序列和编码具有蛋白酶切割位点的膜栓系转录因子的核酸序列。j3.核酸构建体，其包含根据段落i的核酸序列和编码包含细胞内蛋白酶切割位点的靶car的核酸序列。k1.载体，其包含根据段落i的核酸序列或根据段落j的核酸构建体。l1.细胞，其包含根据段落a或b中任一项的截短的蛋白质，或根据段落c、d、e、f、g或h中任一项的融合蛋白质。m1.细胞，其包含根据段落h中任一项的融合蛋白质和具有蛋白酶切割位点的膜栓系转录因子。m2.根据段落m1的细胞，其中在蛋白酶切割位点处的切割释放转录因子而导致靶基因的表达增加。m3.根据段落m2的细胞，其中所述靶基因编码细胞因子。m4.根据段落m3的细胞，其中所述细胞因子选自下组：il-2、il-7、il-15和il-12。m5.细胞，其包含根据段落h中任一项的融合蛋白质和包含细胞内蛋白酶切割位点的靶受体(car)。m6.根据权利要求m5的细胞，其中靶car包含激活性或共刺激性胞内域，并且在所述蛋白酶切割位点处的切割从所述靶car除去所述胞内域。m7.根据权利要求m5的细胞，其中靶car包含抑制性胞内域，并且在所述蛋白酶切割位点处的切割从所述靶car除去所述抑制性胞内域。m8.根据段落m7的细胞，其中所述抑制性胞内域包含cd148或cd45胞内域。m9.细胞，其包含根据段落h中任一项的融合蛋白质和两种car：包含含有itam的胞内域的激活性car；和如段落m5至m8中任一项所定义的靶car。m10.细胞，其包含根据段落h中任一项的融合蛋白质和两种car：包含含有itim的胞内域的抑制性car；和如段落m5至m8中任一项所定义的靶car。以上描述的本发明的方面能够例如通过表1中描述的机制而调节和改变t细胞信号传导途径。表1：信号调节的应用附图简述图1(a)-直接t细胞活化途径的图解。t细胞受体的激活导致itam的磷酸化。磷酸化的itam被zap70sh2结构域识别。识别后，zap70被募集到近膜区，并且其激酶结构域随后磷酸化lat。磷酸化的lat随后被grap、grb2和plc-γ的sh2结构域识别。(b)-直接t细胞抑制途径的图解。抑制性免疫受体(如pd1)的激活导致itim结构域的磷酸化。这些被ptpn6的sh2结构域识别。识别后，ptpn6被募集到近膜区，并且其磷酸酶结构域随后对itam去磷酸化，抑制了免疫激活。图2-阻断信号系统的图解-a)过表达不包含激酶结构域的截短的zap70。结果，它与全长zap70竞争itam并减少itam信号传导。(b)过表达不包含磷酸酶结构域的截短的ptpn6，其与全长ptpn6竞争并减少itim信号传导。图3-串扰信号系统的图解：(a)zap70sh2与ptpn6磷酸酶融合，因此此起到抑制itam磷酸化的作用；(b)ptpn6sh2与zap70激酶融合，导致响应抑制信号的矛盾性激活(paradoxicalactivation)。图4-放大信号系统的图解：(a)将具有cd3zeta胞内域的全长zap70附接至其氨基末端，从而组装了itam的级联。(b)将具有pd1胞内域的全长ptpn6附接至其氨基末端使得组装itim级联。图5-旁路信号系统的图解：(a)zap70与cd28胞内域融合；(b)zap70与41bb胞内域融合；(c)zap70与akt激酶融合；(d)ptpn6sh2域与41bb胞内域融合。图6-说明性转录信号系统的图解：a)zap-tev融合物与膜栓系转录因子共表达，该膜栓系转录因子可以通过切割其tev识别基序而从膜上释放。显示这与cd19car共表达。因此，在识别目标细胞上的cd19后，t细胞被激活，另外，转录因子变得活化。(b)使用ptpn6-tev融合物的备选系统。这里，car由带有itim的胞内域组成。因此，在car识别cd19后，转录因子变得活化，但这独立于t细胞激活。图7-去势信号系统的图解：显示了两种car-一种识别cd19并且是激活性的，以及一种识别cd33并且是抑制性的-这些特性仅供说明(a)andnot信号去势；这里，激活后的sh2-tev融合蛋白质被招募以激活itimcar。这导致itam从激活性car上切割，所述激活性car构建成tev切割位点连接跨膜域与itam结构域。因此，激活性car被抑制。(b)and信号去势：这里激活后的sh2-tev融合蛋白质被招募到itimcar。这导致磷酸酶结构域从激活性car释放，所述激活性car构建成磷酸酶经由tev切割结构域与其羧基末端连接。这导致释放组成型抑制，允许car在关联抗原(cognateantigen)的存在下激活。图8-构建了不同的sh2结构域与akt激酶结构域的几种融合物：zap-akt、grap-akt、grb-akt和plc-γ。图9-(a)用不同sh2/akt融合物转导的t细胞的磷酸化-akt染色，其用有丝分裂抗体okt3激活或不激活。(b)用zap-akt融合物、改善的zap-akt融合物(其中zap和akt经由柔性接头连接)，和对照zap-akt(其中r190k取代除去了zap结合至itam的能力)转导的t细胞的磷酸化-akt染色。用okt3刺激t细胞或不用okt3刺激t细胞。facs图覆盖于未转导的t细胞之上。图10-(a)用增加量的okt3激活的t细胞的磷酸化-akt印记。(b)未刺激的，用仅okt3刺激的或用okt3和il-2两者刺激的zap-akt或对照t细胞的显微镜检查。用仅okt3刺激的zap-aktt细胞与用okt3和il-2两者刺激的未转导的t细胞类似。图11-(a)直接tev转录开关(switch)的实现。将cd19car的胞内域替换为tev蛋白酶。还共表达了膜栓系vp16/gal4转录因子。荧光素酶报告物检测vp16/gal5的活性。(b)用zap-tev实现。标准cd19car与zap-tev的融合物以及膜栓系转录因子共表达。图12-暴露于cd19阴性(左)或cd19阳性(右)靶物后，基于zap-tev的转录开关和表达对照的t细胞的活性。通过添加荧光素酶后的光输出来测量活性。按顺序，测试的条件为：(a)acd19car与zap-tev共表达；(b)acd19car与无活性(r190k)共表达；(c)acd19car与zap-tev和膜栓系转录因子共表达；(d)与无活性(r190k)zap-tev共表达的acd19car与膜栓系转录因子共表达；(e)acd19car/tev融合物与膜栓系转录因子共表达；(f)组成性活化的gal4/vp16转录因子。图13-(a)car的一般架构：结合结构域识别抗原；间隔区从细胞表面提升结合结构域；跨膜结构域将蛋白质锚定在膜上并且胞内域传输信号。(b)至(d)：car胞内域的不同世代(generation)和排列：(b)初始设计通过fcεr1-γ或cd3ζ胞内域仅传输itam信号，而之后的设计顺式传输另外的(c)一种或(d)两种共刺激信号。图14-本发明的说明性蛋白质序列。图15-使用截短的shp-1(ptpn6)或截短的shp-2的pd-1信号阻断将pbmc细胞用以下共转导：pd1和仅car(fmc63)；或含有car和截短的shp-1，或car和截短的shp-2的双顺反子构建体。将这些细胞与用cd19，pdl1或两者转导的supt1细胞共培养48小时，并且通过elisa测量ifnγ释放。图16-使用shp-2sh2结构域与zap70激酶的融合物的信号劫持(hijack)将pbmc细胞与以下共转导：p1和仅car(fmc63)；或含有car和包含shp-2sh2结构域和zap70激酶的融合蛋白的双顺反子构建体。将这些细胞与cd19或pdl1转导的supt1细胞以1：1的比例共同培养24小时。通过elisa测量ifnγ释放(a)，并通过facs定量对supt1细胞的杀伤(b)。发明详述蛋白质本发明提供了包含sh2结构域的截短蛋白。本发明还提供了融合蛋白，其包含(i)sh2结构域；和(ii)异源结构域。sh2结构域可以来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质或来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质。结合itam的蛋白质的例子是zap70。结合itim的蛋白质的例子包括ptpn6和shp-2。因此，本发明的融合蛋白包含sh2结构域和至少一种不存在于sh2结构域衍生自的野生型蛋白中的另外的结构域。src同源性2(sh2)结构域细胞内信号传导通路由蛋白质的可逆性翻译后修饰(包括磷酸化，泛素化和乙酰化)来启动和控制。sh2域是作为衔接子(adaptro)的模块化蛋白结构域，并通过与其各自的蛋白质结合伴侣(通常为细胞表面受体)中的磷酸化肽结合来介导蛋白-蛋白相互作用。sh2结构域通常结合靶蛋白内较长的肽基序环境中的磷酸化的酪氨酸残基，并且sh2结构域代表已知的ptyr识别结构域的最大类别。尽管sh2结构域缺乏任何固有的催化活性，但它们通常偶联于独立的催化结构域，并因此响应于特定的输入信号，用于将这些催化结构域定位至特定亚细胞位置处或定位至适当底物、活化剂或抑制剂的附近。另外还可以发现sh2结构域与衔接子蛋白结构域连接并因此可以用于形成大的多蛋白复合物。zeta链相关蛋白激酶70(zap70)zap70是通常在t细胞和自然杀伤细胞表面膜附近表达的蛋白质。它是t细胞受体(tcr)的一部分，并在t细胞信号传导中起着关键的作用。其分子量为70kda，并由2个n末端sh2结构域和一个c末端激酶结构域组成。它是蛋白酪氨酸激酶家族的成员。t细胞激活中最早的步骤是通过tcr识别靶细胞上的肽mhc复合物。这一初始事件导致lck激酶与tcr复合物中cd3-zeta的胞质尾部的紧密关联。然后lck磷酸化cd3-zeta细胞质尾中的酪氨酸残基，其允许招募zap70。zap70是含有sh2的激酶，其在tcr接合后在t细胞激活中起关键作用。zap70中的串联sh2结构域与磷酸化的cd3结合，导致lck或其它zap70分子反式地将zap70磷酸化和活化。然后活化的zap70能够磷酸化下游膜蛋白，其中关键的膜蛋白是活化的t细胞接头(lat)蛋白质。lat是一种支架蛋白，并且在其多个残基上的磷酸化允许其与数种其它含有sh2结构域的蛋白质相互作用，所述其它含有sh2结构域的蛋白质包括grb2，plc-g和grap，它们其识别lat中的磷酸化的肽并向下游传递t细胞活化信号，最终导致一系列t细胞应答。该过程总结在图1中。人zap70蛋白具有uniprotkb登录号p43403。该序列的长度为619个氨基酸，如seqidno:1所示。zap70氨基酸序列(seqidno:1)mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaaca本发明的融合蛋白可以包含zap70sh2结构域。本发明的截短的蛋白质可以包含zap70sh2结构域或由zap70sh2结构域组成。在这方面，融合或截短的蛋白质可以包含seqidno:2所示的序列或由其组成。zap70完整sh2结构域(seqidno:2)mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpzap70在序列的n-末端在如seqidno.1所示的序列的残基10-102和163-254处具有两个sh2结构域。本发明的截短的蛋白或融合蛋白因此可以包含seqidno.3和4所示的序列中的一个或两个。zap70sh21(seqidno:3)ffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpczap70sh22(seqidno:4)wyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeac融合蛋白可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的seqidno:2、3或4的变体，条件是变体序列是具有所需性质的sh2结构域序列。换句话说，变体序列应该能够结合cd3-zeta细胞质尾部中的磷酸化酪氨酸残基，其允许招募zap70。序列比对方法在本领域中是公知的，并且使用合适的比对程序来完成。％序列同一性指当两个序列最佳对齐时，两序列中相同氨基酸或核苷酸残基的百分比。可使用标准算法诸如blast程序(在国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具(basiclocalalignmentsearchtoolatthenationalcenterforbiotechnologyinformation))使用默认参数确定核苷酸和蛋白质序列的同源性或同一性，这在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov是可公开获得的。用于确定序列同一性或同源性的其它算法包括：lalign(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/lalign/和http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/lalign/nucleotide.html)，amas(多比对序列分析(analysisofmultiplyalignedsequences)，在http://www.compbio.dundee.ac.uk/software/amas/amas.html)，fasta(http://www.ebi.ac.uk/tools/sss/fasta/)，clustalomega(http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalo/),sim(http://web.expasy.org/sim/),和embossneedle(http://www.ebi.ac.uk/tools/psa/emboss_needle/nucleotide.html)。在某些实施方案中，融合蛋白可以包含zap70sh2结构域和zap70激酶结构域。例如，融合蛋白可以包含如seqidno:1所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体。酪氨酸蛋白磷酸酶非受体类型6(ptpn6)ptpn6也称为含有src同源区2结构域的磷酸酶-1(shp-1)。它是蛋白酪氨酸磷酸酶家族的成员。ptpn6的n末端区域含有两个串联的sh2结构域，其介导ptpn6与其底物的相互作用。c末端区域含有酪氨酸蛋白磷酸酶结构域。ptpn6能够与许多抑制性免疫受体或含有itim的受体结合并传播信号。此类受体的例子包括但不限于pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1和kir3dl3。人ptpn6蛋白具有uniprotkb登录号p29350。该序列的长度为595个氨基酸，如seqidno:5所示。ptpn6氨基酸序列(seqidno:5)mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyyatrvnaadienrvlelnkkqesedtakagfweefeslqkqevknlhqrlegqrpenkgknryknilpfdhsrvilqgrdsnipgsdyinanyiknqllgpdenaktyiasqgcleatvndfwqmawqensrvivmttrevekgrnkcvpywpevgmqraygpysvtncgehdtteyklrtlqvspldngdlireiwhyqylswpdhgvpsepggvlsfldqinqrqeslphagpiivhcsagigrtgtiividmlmenistkgldcdidiqktiqmvraqrsgmvqteaqykfiyvaiaqfiettkkklevlqsqkgqeseygnityppamknahakasrtsskhkedvyenlhtknkreekvkkqrsadkekskgslkrk本发明的融合蛋白可以包含ptpn6sh2结构域。本发明的截短蛋白可以包含ptpn6sh2结构域或由ptpn6sh2结构域组成。在这方面，融合或截短的蛋白质可以包含seqidno:6所示的序列或由其组成。ptpn6sh2完整结构域(seqidno:6)mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyyptpn6在序列的n-末端在如seqidno.5所示的序列的残基4-100和110-213处具有两个sh2结构域。本发明的截短的蛋白或融合蛋白因此可以包含seqidno.3和4所示的序列中的一个或两个。ptpn6sh21(seqidno:7)wfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplptpn6sh22(seqidno.8)wyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy融合蛋白可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的seqidno:6、7或8的变体，条件是变体序列是具有所需性质的sh2结构域序列。换句话说，变体序列应该能够结合至少一种以下蛋白质胞质尾部中的磷酸化酪氨酸残基：pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3，其允许招募ptpn6。在某些实施方案中，融合蛋白可以包含ptpn6sh2结构域和ptpn6磷酸酶结构域。例如，融合蛋白可以包含如seqidno:5所示的序列或其具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的变体。shp-2shp-2(也称为ptpn11,ptp-1d和ptp-2c)是蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)家族的成员。与ptpn6相似，shp-2在其n端具有由两个串联的sh2域组成的结构域结构，随后是蛋白酪氨酸磷酸酶(ptp)结构域。在无活性状态下，n末端sh2结构域结合ptp结构域并阻断潜在的底物进入活性部位。因此，shp-2是自抑制的。在与靶磷酸化-酪氨酰残基结合后，n末端sh2结构域从ptp结构域释放，通过减轻自抑制来催化性地激活酶。人shp-2具有uniprotkb登录号p35235-1。该序列的长度为597个氨基酸，如seqidno:9所示。shp-2氨基酸序列(seqidno:9)mtsrrwfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqplnttrinaaeiesrvrelsklaettdkvkqgfweefetlqqqeckllysrkegqrqenknknryknilpfdhtrvvlhdgdpnepvsdyinaniimpefetkcnnskpkksyiatqgclqntvndfwrmvfqensrvivmttkevergkskcvkywpdeyalkeygvmrvrnvkesaahdytlrelklskvgqallqgntertvwqyhfrtwpdhgvpsdpggvldfleevhhkqesivdagpvvvhcsagigrtgtfividilidiirekgvdcdidvpktiqmvrsqrsgmvqteaqyrfiymavqhyietlqrrieeeqkskrkgheytnikyslvdqtsgdqsplppctptppcaemredsarvyenvglmqqqrsfr本发明的融合蛋白可以包含shp-2sh2结构域。本发明的截短的蛋白可以包含shp-2sh2结构域或由shp-2sh2结构域组成。在这方面，融合或截短的蛋白质可以包含shp-2的第一sh2结构域(如包含seqidno.9的氨基酸6-102)或第二sh2结构域(如包含shp-2的氨基酸112-216)或由其组成。融合或截短的蛋白质可以包含seqidno:10、11或12所示的序列或由其组成。shp-2第一sh2结构域(seqidno:10)wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplshp-2第二sh2结构域(seqidno.11)wfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqplshp-2两个sh2结构域(seqidno.12)wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqpl融合蛋白可以包含具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的seqidno:10,11或12的变体，条件是变体序列是能够结合含有itim的结构域的sh2结构域序列。例如变体序列可以能够结合以下蛋白质细胞质尾部中的磷酸化的酪氨酸残基：pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3。异源结构域如本文所用，术语“异源结构域”指不存在于以下的任何蛋白结构域：i)野生型zap70(参见seqidno:1)，其用于包含zap70sh2结构域的融合蛋白；ii)野生型ptpn6(参见seqidno:5)，其用于包含ptpn6sh2结构域的融合蛋白；或iii)野生型shp-2(参见seqidno.9)，其用于包含shp-2sh2结构域的融合蛋白。异源结构域可以是或衍生自(如部分)与zap70，shp-2或ptpn6不同的蛋白质。或者融合蛋白可以包含zap70sh2结构域和来自ptpn6的结构域(如ptpn6激酶结构域)的融合物。同样，融合蛋白可以包含ptpn6sh2结构域和来自zap70的结构域(如zap70激酶结构域)的融合物。放大信号本发明提供融合蛋白，其包含：来自itam结合蛋白的sh2结构域；和含有itam的结构域。本发明还提供融合蛋白，其包含：来自itim结合蛋白的sh2结构域；和含有itim的结构域。这些“放大”信号传导分子将放大免疫细胞(如t细胞)内的刺激性或抑制性信号。如图4所示，此类分子的存在将导致itam或itim的串接(concatenation)，这导致分别增强激活性或抑制性信号。在期望增加免疫细胞(例如car-t细胞)对抗原的敏感性的情况下，激活性信号的放大是有用的。例如，当靶细胞上的靶抗原以低水平表达时可以是这种情况。在希望减少或防止t细胞激活的情况下放大抑制性系统。wo2015/075469描述了一组“逻辑门(logicgate)”嵌合抗原受体对，当其由细胞(如t细胞)表达时，能够检测至少两种靶抗原a和b的特定表达模式。本申请中描述的“与非门(andnotgate)”包含一对car使得仅当抗原a而不是抗原b存在于靶细胞上时，t细胞才会触发。在该与非门中，一个car(识别抗原a)具有包含itam的激活性胞内域，而另一个car(识别抗原b)具有可以包含itim的抑制性胞内域。在单独存在抗原a的情况下，未连接(unligated)的抑制性car的存在不足以防止t细胞激活，因此发生激活。然而在两种抗原的存在下，形成具有高浓度的激活性和抑制性car两者的膜区域。由于两种胞内域是集中的，t细胞激活被阻止或减少。使用本发明的放大信号分子来放大抑制性信号可以用于与门(“andgate”)中，以减少或除去在两种抗原存在下发生的任何残留信号传导，即来自通过抑制性car不完全地抑制激活性car。含有itam的结构域在一个实施方案中，融合蛋白包含zap70sh2结构域和含有基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)的结构域。具有含有itam的结构域的全长zap70的融合物产生放大激活性免疫信号的结构。这里，融合蛋白被招募到磷酸化的itam免疫受体胞内域。zap70发挥正常功能以传播的信号，但也提供了另一组itam，该itam被磷酸化并招募更多的zap70。例如，这对增加信号强度可以是有用的，并可以增加对低密度抗原的敏感性。在一些实施方案中，融合物可以仅包括具有含itam的胞内域的zap70sh2结构域(例如融合物不含有zap70激酶结构域)。在其它实施方案中，zap70催化结构域(激酶结构域)与itam的比例可以变化以影响激活动力学，该动力学响应激活性受体与关联(cognate)靶物相互作用的动态。itam是四个氨基酸的保守序列，其在免疫系统的某些细胞表面蛋白质的细胞质尾部重复两次。该基序含有酪氨酸，其通过任何其它两个氨基酸与亮氨酸或异亮氨酸分隔开，产生签名yxxl/i。两个这些签名通常在分子尾部被6至8个氨基酸分隔开(yxxl/ix(6-8)yxxl/i)。itam对于免疫细胞中的信号传导是重要的。因此，它们被发现于重要细胞信号传导分子的尾部，如t细胞受体复合物的cd3和ζ-链，b细胞受体复合物的cd79-alpha和-beta链，以及某些fc受体。这些基序内的酪氨酸残基在受体分子与其配体相互作用后磷酸化，并形成参与细胞信号传导途径的其它蛋白质的停靠位点。已知数种蛋白质含有具有一个或多个itam基序的胞内域。此类蛋白质的例子包括cd3epsilon链，cd3gamma链和cd3delta链等。itam基序可以容易地被识别为被任何两个其它氨基酸分隔开的酪氨酸和亮氨酸或异亮氨酸，产生签名yxxl/i。通常，但不总是，两个这些基序在分子尾部被6至8个氨基酸分隔开(yxxl/ix(6-8)yxxl/i)。因此，本领域技术人员可以容易地找到包含一个或多个itam的现有蛋白质以传输激活性信号。此外，鉴于基序是简单的并且不需要复杂的二级结构，本领域技术人员可以设计含有人工itam的多肽来传递激活性信号(参见wo2000063372,其涉及合成的信号传导分子)。含有itam的结构域可以是或包含cd3-zeta胞内域。合适地，含有itam的结构域可以包含如seqidno:13所示的序列或其变体，该变体具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性并保留被磷酸化并招募zap70的能力。seqidno:13(cd3-zeta胞内域)rvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr例如，融合蛋白可以是或包含如seqidno:14所示的序列，其含有与cd3-zeta胞内域融合的zap70-sh2结构域。seqidno:14mrrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprsggggsggggsggggsggggsmpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaaca合适地，融合蛋白可以包含如seqidno:14所示序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。含有itim的结构域在一个实施方案中，融合蛋白包含ptpn6sh2结构域和含有基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)的结构域。具有含有itim的结构域的全长ptpn6的融合物产生放大抑制性免疫信号的结构。这里，融合蛋白被招募到磷酸化的itim免疫受体胞内域。ptpn6正常发挥功能以传播信号，但也提供了另一组itim，其磷酸化并招募更多的ptpn6。在一些实施方案中，融合物可以仅包括具有含有itim的胞内域的ptpn6sh2结构域(例如融合物不含有ptpn6磷酸酶结构域)。在其它实施方案中，ptpn6催化结构域(激酶结构域)与itim的比例可以变化以影响激活动力学，该动力学响应抑制性受体与关联靶物相互作用的动态。itim是保守的氨基酸序列(s/i/v/lxyxxi/v/l)，其存在于免疫系统的许多抑制性受体的细胞质尾部。在具有itim的抑制性受体与其配体相互作用后，它们的itim基序被src激酶的酶磷酸化，允许它们经由ptpn6sh2结构域和磷酸化的itim结构域之间的相互作用来招募ptpn6。含有itim的胞内域包括例如来自cd22、lair-1、杀伤抑制性受体家族(kir)、lilrb1、ctla4、pd-1、btla的那些。来自pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1和kir3dl3的itim胞内域分别如seqidno:15至24中所示。seqidno:15pdcd1胞内域csraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswplseqidno:16btla4klqrrwkrtqsqqglqenssgqsffvrnkkvrraplsegphslgcynpmmedgisyttlrfpemniprtgdaessemqrpppdcddtvtysalhkrqvgdyenvipdfpedegihyseliqfgvgerpqaqenvdyvilkhseqidno:17lilrb1lrhrrqgkhwtstqrkadfqhpagavgpeptdrglqwrsspaadaqeenlyaavkhtqpedgvemdtrsphdedpqavtyaevkhsrprremasppsplsgefldtkdrqaeedrqmdteaaaseapqdvtyaqlhsltlrreatepppsqegpspavpsiyatlaihseqidno:18lair1hrqnqikqgpprskdeeqkpqqrpdlavdvlertadkatvnglpekdretdtsalaagssqevtyaqldhwaltqrtaravspqstkpmaesityaavarhseqidno:19ctla4fllwilaavssglffysflltavslskmlkkrsplttgvyvkmpptepecekqfqpyfipinseqidno:20kir2dl1gnsrhlhvligtsvviipfaillffllhrwcankknavvmdqepagnrtvnredsdeqdpqevtytqlnhcvftqrkitrpsqrpktpptdiivytelpnaesrskvvscpseqidno:21kir2dl4giarhlhavirysvaiilftilpffllhrwcskkkenaavmnqepaghrtvnredsdeqdpqevtyaqldhciftqrkitgpsqrskrpstdtsvcielpnaepralspahehhsqalmgssrettalsqtqlassnvpaagiseqidno:22kir2dl5tgirrhlhiligtsvaiilfiilfffllhcccsnkknaavmdqepagdrtvnredsddqdpqevtyaqldhcvftqtkitspsqrpktpptdttmymelpnakprslspahkhhsqalrgssrettalsqnrvasshvpaagiseqidno:23kir3dl1kdprhlhiligtsvviilfilllffllhlwcsnkknaavmdqepagnrtansedsdeqdpeevtyaqldhcvftqrkitrpsqrpktpptdtilytelpnakprskvvscpseqidno:24kir3dl3kdpgnsrhlhvligtsvviipfaillffllhrwcankknavvmdqepagnrtvnredsdeqdpqevtyaqlnhcvftqrkitrpsqrpktpptdtsv含有itim的结构域可以是或包含pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3胞内域。合适地，含有itim的结构域可以包含seqidno:15至24中任一项所示的序列或其变体，该变体具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性并保留被src激酶磷酸化并放大抑制性免疫信号的能力。例如，融合蛋白可以是或包含如seqidno:25所示的序列，其含有与pd1胞内域融合的ptpn6-sh2结构域。seqidno:25mtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswplsggggsggggsggggsggggsmvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyyatrvnaadienrvlelnkkqesedtakagfweefeslqkqevknlhqrlegqrpenkgknryknilpfdhsrvilqgrdsnipgsdyinanyiknqllgpdenaktyiasqgcleatvndfwqmawqensrvivmttrevekgrnkcvpywpevgmqraygpysvtncgehdtteyklrtlqvspldngdlireiwhyqylswpdhgvpsepggvlsfldqinqrqeslphagpiivhcsagigrtgtiividmlmenistkgldcdidiqktiqmvraqrsgmvqteaqykfiyvaiaqfiettkkklevlqsqkgqeseygnityppamknahakasrtsskhkedvyenlhtknkreekvkkqrsadkekskgslkrk合适地，融合蛋白可以包含如seqidno:25所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。串扰信号(crosswiresignal)本发明提供了融合蛋白，其包含：来自itam结合蛋白的sh2结构域；和磷酸酶结构域。本发明还提供了融合蛋白，其包含：来自itim结合蛋白的sh2结构域；和激酶结构域。这些“串扰”信号传导分子将逆转免疫细胞(如t细胞)内的兴奋性或抑制性信号。当t细胞接受兴奋性信号时(例如在通过car识别靶抗原或通过tcr识别mhc:肽之后)，第一类串扰分子的存在将导致细胞将兴奋信号解读为抑制信号。抑制或修正t细胞激活在各种情况下可能是有用的，例如，它可以用于在靶细胞上靶抗原高水平表达情况下的car表达t细胞。它可以用于防止可以导致t细胞耗尽和/或激活诱导的细胞死亡的t细胞过度激活。防止t细胞过度活化或过快活化也可防止或减少car-t细胞治疗的病理性副作用，如细胞因子释放综合征(crs)。相反的情况是当t细胞接收到抑制性信号(例如在与pd1连接后)，且在第二类串扰分子的存在下导致细胞将抑制性信号解读为刺激性信号。减少或逆转t细胞抑制将帮助细胞克服敌对肿瘤微环境内的抑制性刺激，并且因此应当增加体内t细胞持续性和扩增。在一个实施方案中，融合蛋白包含ptpn6sh2结构域与和zap70激酶结构域。在另一个实施方案中，本发明的融合蛋白包含与ptpn6激酶结构域融合的zap70sh2结构域。在涉及与来自ptpn6的磷酸酶结构域融合的zap70sh2结构域的实施方案中，当t细胞接收到兴奋性信号时，其将该信号解读为抑制性信号，因为ptpn6磷酸酶结构域经由zap70sh2结构域招募到激活的itam。在涉及与来自zap70的激酶结构域融合的ptpn6sh2结构域的实施方案中，当t细胞接收到抑制性信号时，其将该信号解读为兴奋性信号，因为zap70激酶结构域经由ptpn6结构域招募到激活的itim。ptpn6sh2结构域和zap70激酶结构域之间的融合将导致野生型ptpn6竞争磷酸化的itim，其阻断抑制性信号，但另外将传输矛盾性的激活信号。这可以在肿瘤微环境中的克服检查点阻断信号中有应用。人zap70激酶、ptpn6磷酸酶和shp-2磷酸酶结构域的序列分别如seqidno:26、27和28所示。seqidno:26–zap70激酶结构域dpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaacaseqidno:27–ptpn6磷酸酶结构域fweefeslqkqevknlhqrlegqrpenkgknryknilpfdhsrvilqgrdsnipgsdyinanyiknqllgpdenaktyiasqgcleatvndfwqmawqensrvivmttrevekgrnkcvpywpevgmqraygpysvtncgehdtteyklrtlqvspldngdlireiwhyqylswpdhgvpsepggvlsfldqinqrqeslphagpiivhcsagigrtgtiividmlmenistkgldcdidiqktiqmvraqrsgmvqteaqykfiyvaiaqfiettkkklseqidno:28–shp-2磷酸酶结构域weefetlqqqeckllysrkegqrqenknknryknilpfdhtrvvlhdgdpnepvsdyinaniimpefetkcnnskpkksyiatqgclqntvndfwrmvfqensrvivmttkevergkskcvkywpdeyalkeygvmrvrnvkesaahdytlrelklskvgqallqgntertvwqyhfrtwpdhgvpsdpggvldfleevhhkqesimdagpvvvhcsagigrtgtfividilidiirekgvdcdidvpktiqmvrsqrsgmvqteaqyrfiymazap70激酶结构域、ptpn6磷酸酶结构域或shp-2磷酸酶结构域可以是或包含分别如seqidno:26，seqidno:27或seqidno:28所示的序列；或其变体，该变体具有至少80、85、90、95、98或99％的序列同一性并保留以与野生型激酶/磷酸酶结构域相同的方式磷酸化或去磷酸化下游蛋白的能力。包含与zap70激酶结构域融合的ptpn6sh2结构域的融合蛋白；包含与ptpn6激酶结构域融合的zap70sh2结构域的融合蛋白；和包含与zap70激酶结构域融合的shp-2sh2结构域的融合蛋白的实例分别如seqidno:29，seqidno:30和seqidno:61所示。seqidno:29–ptpn6sh2结构域融合:zap70激酶结构域mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyysggggsdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaacaseqidno:30–zap70sh2结构域融合:ptpn6磷酸酶结构域mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpsggggsggggsggggsggggsfweefeslqkqevknlhqrlegqrpenkgknryknilpfdhsrvilqgrdsnipgsdyinanyiknqllgpdenaktyiasqgcleatvndfwqmawqensrvivmttrevekgrnkcvpywpevgmqraygpysvtncgehdtteyklrtlqvspldngdlireiwhyqylswpdhgvpsepggvlsfldqinqrqeslphagpiivhcsagigrtgtiividmlmenistkgldcdidiqktiqmvraqrsgmvqteaqykfiyvaiaqfiettkkklseqidno.61–来自shp-2的双sh2结构域与zap70激酶结构域融合wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqplnttrinpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyysl融合蛋白可以是或包含如seqidno:29，seqidno:30或seqidno.61所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。异源信号传导结构域本融合蛋白可以包含(i)zap70，ptpn6或shp-2sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。如本文所用，术语“异源信号传导结构域”指在野生型zap70、ptpn6或shp-2蛋白中不存在的信号传导结构域。如此，当融合蛋白包含zap70sh2结构域时，其包含不是zap70激酶结构域的信号传导结构域。或者，当融合蛋白包含ptpn6sh2结构域时，其包含不是ptpn6磷酸酶结构域的信号传导结构域。旁路信号异源信号传导结构域可以来自通常不被含有itam的受体激活的信号传导分子。换言之，异源信号传导结构域可以来自在抗原与tcr结合之后不参与免疫信号1传播的信号分子。免疫信号1足以引发t细胞对同源靶细胞的杀伤，但不能充分激活t细胞以增殖和存活。在本发明的该方面的一个实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其包含(i)来自结合itam的蛋白质的sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。例如zap70与另一信号传导分子(通常不被含有itam的受体激活)之间的融合物可以会将信号从一个通路旁通(bypass)到另一个通路。一个例子是共刺激。zap70与cd28的胞内域之间的融合物可以传递cd28共刺激信号以及itam激活性信号。类似地，zap70与41bb或ox40的胞内域之间的融合物可以传递41bb或ox40共刺激信号。也可以招募其他途径，例如zap70和akt激酶结构域之间的融合物可以导致itam磷酸化后的akt信号传递。其他实例可以包括来自jak的激酶结构域。t细胞可将简单的抗原识别信号解读为传递共刺激信号或甚至细胞因子类型的信号。此类融合蛋白例如在以下方法中是有用的，该方法中t细胞的重复离体刺激可导致缺乏共刺激表面抗原的群体，且其具有受限的体内增殖能力，导致受限的持久性和效力。共刺激表面抗原的丧失导致t细胞仅通过tcr而激活，其已经与更高程度的激活诱导的细胞死亡相关联，该细胞死亡会对体内效力和持久性产生负面影响。这种效应可以通过表面表达的4-1bb和ox40的活化来逆转，这说明共刺激可以防止激活诱导的细胞死亡并且可以支持肿瘤特异性t细胞的更大扩增。在本发明的该方面的另一个实施方案中，本发明提供了融合蛋白，其包含(i)来自结合itim的蛋白质的sh2结构域；和(ii)异源信号传导结构域。例如，可以将ptpn6sh2结构域或shp-2sh2结构域与共刺激胞内域融合，使得t细胞将抑制信号解读为共刺激信号。异源性信号传导结构域可以例如来自cd28、41bb或ox40。cd28提供有效的共刺激信号-即免疫信号2，其触发t细胞增殖。cd28是cd80(b7.1)和cd86(b7.2)蛋白的受体。41bb(cd137)是属于tnf超家族的2型跨膜糖蛋白，其在活化的t细胞上表达。41bb的交联增强t细胞增殖，il-2分泌存活和细胞溶解活性。ox40(cd134)是在激活后24至72小时后表达的次级共刺激分子，其配体(ox40l)也不在静息抗原提呈细胞上表达，但在该细胞激活后在其上表达。ox40的表达依赖于t细胞的完全激活；没有cd28，ox40的表达被延迟并且低四倍水平。在最初的激活和增殖后，通过ox40的信号传导是延长的t细胞存活所必需的。cd28、41bb和ox40信号传导结构域(胞内域)分别如seqidno:31,32和33所示。seqidno:31–cd28胞内域mrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsseqidno:32–41bb胞内域mkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelseqidno:33–ox40胞内域mrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlaki异源信号传导结构域可以是或包含分别如seqidno:31；seqidno:32或seqidno:33所示的序列，或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。异源信号传导结构域可以是或包含抑制性信号传导结构域。例如，抑制性信号传导结构域可以包含cd148或cd45的胞内域。已显示cd148和cd45天然地作用于tcr信号传导上游的磷酸化酪氨酸。cd148是受体样蛋白酪氨酸磷酸酶，其通过干扰plcγ1和lat的磷酸化和功能负调节tcr信号传导。cd45存在于所有造血细胞上，是蛋白酪氨酸磷酸酶，其能够再次通过磷酸化plcγ1来调节信号转导和功能性应答。抑制性信号传导结构域可以包含受体样酪氨酸磷酸酶的全部部分。磷酸酶可以干扰参与t细胞信号传导的元件(如plcγ1和/或lat)的磷酸化和/或功能。抑制性信号传导结构域可以是或包含icos、cd27、btla、cd30、gitr或hvem的胞内域。抑制性信号传导结构域可以包含如seqidno:34至39所示的序列或具有至少80％序列同一性的其变体。seqidno:34-icos胞内域cwltkkkysssvhdpngeymfmravntakksrltdvtlseqidno:35-cd27胞内域qrrkyrsnkgespvepaepchyscpreeegstipiqedyrkpepacspseqidno:36-btla胞内域rrhqgkqnelsdtagreinlvdahlkseqteastrqnsqvllsetgiydndpdlcfrmqegsevysnpcleenkpgivyaslnhsvigpnsrlarnvkeapteyasicvrsseqidno:37-cd30胞内域hrracrkrirqklhlcypvqtsqpklelvdsrprrsstqlrsgasvtepvaeerglmsqplmetchsvgaayleslplqdaspaggpssprdlpeprvstehtnnkiekiyimkadtvivgtvkaelpegrglagpaepeleeeleadhtphypeqetepplgscsdvmlsveeegkedplptaasgkseqidno:38-gitr胞内域qlglhiwqlrsqcmwpretqlllevppstedarscqfpeeergersaeekgrlgdlwvseqidno:39-hvem胞内域cvkrrkprgdvvkvivsvqrkrqeaegeatviealqappdvttvaveetipsftgrspnh变体序列可以与seqidno:34至39具有至少80％、85％、90％、95％、98％或99％的序列同一性，条件是该序列提供有效的细胞内信号传导结构域。合适地，融合蛋白可以是或包含如seqidno:40至45所示的任何序列。(seqidno:40)-cd28胞内域与全长zap的氨基末端融合mrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrssggggsggggsggggsggggsmpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaaca(seqidno:41)-41bb胞内域与全长zap的氨基末端融合mkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelsggggsggggsggggsggggsmpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaaca(seqidno:42)-ox40胞内域与全长zap的氨基末端融合mrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakisggggsggggsggggsggggsmpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpqrridtlnsdgytpeparitspdkprpmpmdtsvyespysdpeelkdkklflkrdnlliadielgcgnfgsvrqgvyrmrkkqidvaikvlkqgtekadteemmreaqimhqldnpyivrligvcqaealmlvmemagggplhkflvgkreeipvsnvaellhqvsmgmkyleeknfvhrdlaarnvllvnrhyakisdfglskalgaddsyytarsagkwplkwyapecinfrkfssrsdvwsygvtmwealsygqkpykkmkgpevmafieqgkrmecppecppelyalmsdcwiykwedrpdfltveqrmracyyslaskvegppgstqkaeaaca(seqidno:43)-cd28胞内域与ptpn6sh2结构域的氨基末端融合mrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrssggggsggggsggggsggggsmvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy(seqidno:44)-41bb胞内域与ptpn6sh2结构域的氨基末端融合mkrgrkkllyifkqpfmrpvqttqeedgcscrfpeeeeggcelsggggsggggsggggsggggsmvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy(seqidno:45)-ox40胞内域与ptpn6sh2结构域的氨基末端融合mrdqrlppdahkppgggsfrtpiqeeqadahstlakisggggsggggsggggsggggsmvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpy合适地，融合蛋白可以包含如seqidno:40至45中任一项所示的序列，或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。激酶结构域异源信号传导结构域可以是激酶结构域。例如，异源信号传导结构域可以包含akt激酶结构域或jak激酶结构域。akt(也称为蛋白激酶b(pkb))，是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶，在诸如葡萄糖代谢、凋亡、细胞增殖、转录和细胞迁移的多种细胞过程中起着关键的作用。在tcr的激活后，t细胞分泌支持存活和增殖的il2。然而，这种分泌是短暂的，并且体外激活和扩增的t细胞依赖异外源性il2的存活。通过增加与tcr或car激活相关的itam磷酸化后的akt磷酸化，可降低或消除激活的t细胞对异源il2的依赖，并增强其增殖和存活。akt激酶结构域如seqidno:46所示。seqidno:46-akt激酶结构域aeemevslakpkhrvtmnefeylkllgkgtfgkvilvkekatgryyamkilkkevivakdevahtltenrvlqnsrhpfltalkysfqthdrlcfvmeyanggelffhlsrervfsedrarfygaeivsaldylhseknvvyrdlklenlmldkdghikitdfglckegikdgatmktfcgtpeylapevledndygravdwwglgvvmyemmcgrlpfynqdheklfelilmeeirfprtlgpeaksllsgllkkdpkqrlgggsedakeimqhrffagivwqhvyekklsppfkpqvtsetdtryfdeeftaqmititppdqddsmecvdserrphfpqfsysasgta异源信号传导结构域可以是或包含如seqidno:46所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体，条件是该序列提供有效的激酶结构域。例如，融合蛋白可以是或包含seqidno:47至49和62所示的任何序列，所述序列分别包含直接融合到akt激酶结构域的zap70-sh2结构域、经由接头融合到akt激酶结构域的zap70-sh2结构域、融合到akt激酶结构域的被突变为无功能的zap70-sh2结构域；以及融合到akt激酶结构域的双shp-2sh2结构域。seqidno:47-直接融合到akt激酶结构域的zap70-sh2结构域mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpaeemevslakpkhrvtmnefeylkllgkgtfgkvilvkekatgryyamkilkkevivakdevahtltenrvlqnsrhpfltalkysfqthdrlcfvmeyanggelffhlsrervfsedrarfygaeivsaldylhseknvvyrdlklenlmldkdghikitdfglckegikdgatmktfcgtpeylapevledndygravdwwglgvvmyemmcgrlpfynqdheklfelilmeeirfprtlgpeaksllsgllkkdpkqrlgggsedakeimqhrffagivwqhvyekklsppfkpqvtsetdtryfdeeftaqmititppdqddsmecvdserrphfpqfsysasgtaseqidno:48-经由接头融合到akt激酶结构域的zap70-sh2结构域mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpsggggsggggsggggsggggsaeemevslakpkhrvtmnefeylkllgkgtfgkvilvkekatgryyamkilkkevivakdevahtltenrvlqnsrhpfltalkysfqthdrlcfvmeyanggelffhlsrervfsedrarfygaeivsaldylhseknvvyrdlklenlmldkdghikitdfglckegikdgatmktfcgtpeylapevledndygravdwwglgvvmyemmcgrlpfynqdheklfelilmeeirfprtlgpeaksllsgllkkdpkqrlgggsedakeimqhrffagivwqhvyekklsppfkpqvtsetdtryfdeeftaqmititppdqddsmecvdserrphfpqfsysasgtaseqidno:49-融合到akt激酶结构域的被突变为无功能的zap70-sh2结构域mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllkprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpaeemevslakpkhrvtmnefeylkllgkgtfgkvilvkekatgryyamkilkkevivakdevahtltenrvlqnsrhpfltalkysfqthdrlcfvmeyanggelffhlsrervfsedrarfygaeivsaldylhseknvvyrdlklenlmldkdghikitdfglckegikdgatmktfcgtpeylapevledndygravdwwglgvvmyemmcgrlpfynqdheklfelilmeeirfprtlgpeaksllsgllkkdpkqrlgggsedakeimqhrffagivwqhvyekklsppfkpqvtsetdtryfdeeftaqmititppdqddsmecvdserrphfpqfsysasgtaseqidno.62-融合到akt激酶结构域的双shp-2sh2结构域wfhpnitgveaenllltrgvdgsflarpsksnpgdftlsvrrngavthikiqntgdyydlyggekfatlaelvqyymehhgqlkekngdvielkyplncadptserwfhghlsgkeaeklltekgkhgsflvresqshpgdfvlsvrtgddkgesndgkskvthvmircqelkydvgggerfdsltdlvehykknpmvetlgtvlqlkqplnttrinaeemevslakpkhrvtmnefeylkllgkgtfgkvilvkekatgryyamkilkkevivakdevahtltenrvlqnsrhpfltalkysfqthdrlcfvmeyanggelffhlsrervfsedrarfygaeivsaldylhseknvvyrdlklenlmldkdghikitdfglckegikdgatmktfcgtpeylapevledndygravdwwglgvvmyemmcgrlpfynqdheklfelilmeeirfprtlgpeaksllsgllkkdpkqrlgggsedakeimqhrffagivwqhvyekklsppfkpqvtsetdtryfdeeftaqmititppdqddsmecvdserrphfpqfsysasgta融合蛋白可以包含如seqidno:47至49或62中任一项所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。janus激酶(jak)是细胞内非受体酪氨酸激酶家族，其通过jak-stat途径转导细胞因子介导的信号。jak家族的四个成员是：janus激酶1(jak1)；janus激酶2(jak2)；janus激酶3(jak3)；和酪氨酸激酶2(tyk2)。seqidno:50–含有jak2结构域的激酶rnedlifneslgqgtftkifkgvrrevgdygqlhetevllkvldkahrnysesffeaasmmsklshkhlvlnygvcvcgdenilvqefvkfgsldtylkknkncinilwklevakqlawamhfleentlihgnvcaknillireedrktgnppfiklsdpgisitvlpkdilqeripwvppecienpknlnlatdkwsfgttlweicsggdkplsaldsqrklqfyedrhqlpapkwaelanlinncmdyepdfrpsfraiirdlnslftpdyelltendmlpnmrigalgfsgafedrdptqfeerhlkflqqlgkgnfgsvemcrydplqdntgevvavkklqhsteehlrdfereieilkslqhdnivkykgvcysagrrnlklimeylpygslrdylqkhkeridhikllqytsqickgmeylgtkryihrdlatrnilvenenrvkigdfgltkvlpqdkeyykvkepgespifwyapeslteskfsvasdvwsfgvvlyelftyieksksppaefmrmigndkqgqmivfhliellknngrlprpdgcpdeiymimtecwnnnvnqrpsfrdlalrvdqirdnm蛋白酶结构域本发明还提供了融合蛋白，其包含(i)来自蛋白质的sh2结构域，该蛋白质结合含有itam或itim的蛋白质，和(ii)蛋白酶结构域。蛋白酶结构域可以是能够在特定识别序列处切割的任何蛋白酶。因此，蛋白酶结构域可以是任何蛋白酶，其能够通过在特定靶序列处的切割将单个靶多肽分离成两个不同的多肽。蛋白酶结构域可以是烟草蚀刻病毒(tev)蛋白酶结构域。tev蛋白酶是高度序列特异性的半胱氨酸蛋白酶，其是胰凝乳蛋白酶样蛋白酶。其对其靶切割位点是非常特异的，并因此经常用于体外和体内融合蛋白的受控切割。共有tev切割位点为enlyfq\s(其中‘\’表示切割的肽键)。哺乳动物细胞如人类细胞不表达内源性tev蛋白酶。相应的，tev切割识别位点如seqidno:51所示。seqidno:51–tev切割位点enlyfqstev蛋白酶结构域如seqidno:52所示。seqidno:52slfkgprdynpisstichltnesdghttslygigfgpfiitnkhlfrrnngtllvqslhgvfkvkntttlqqhlidgrdmiiirmpkdfppfpqklkfrepqreericlvttnfqtksmssmvsdtsctfpssdgifwkhwiqtkdgqcgsplvstrdgfivgihsasnftntnnyftsvpknfmelltnqeaqqwvsgwrlnadsvlwgghkvfmskpeepfqpvkeatqlmnelvysq相应的，蛋白酶结构域可以是或包含如seqidno:52所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体，条件是该序列提供有效的蛋白酶功能。例如，融合蛋白可以是或包含如seqidno:53或54所示的序列，该序列分别含有与tev蛋白酶序列融合的zap70-sh2结构域或与tev蛋白酶序列融合的ptpn6-sh2结构域。seqidno:53mpdpaahlpffygsisraeaeehlklagmadglfllrqclrslggyvlslvhdvrfhhfpierqlngtyaiaggkahcgpaelcefysrdpdglpcnlrkpcnrpsglepqpgvfdclrdamvrdyvrqtwklegealeqaiisqapqvekliattahermpwyhssltreeaerklysgaqtdgkfllrprkeqgtyalsliygktvyhylisqdkagkycipegtkfdtlwqlveylklkadgliyclkeacpnssasnasgaaaptlpahpstlthpsggggsggggsggggsggggsslfkgprdynpisstichltnesdghttslygigfgpfiitnkhlfrrnngtllvqslhgvfkvkntttlqqhlidgrdmiiirmpkdfppfpqklkfrepqreericlvttnfqtksmssmvsdtsctfpssdgifwkhwiqtkdgqcgsplvstrdgfivgihsasnftntnnyftsvpknfmelltnqeaqqwvsgwrlnadsvlwgghkvfmskpeepfqpvkeatqlmnelvysqseqidno:54mvrwfhrdlsgldaetllkgrgvhgsflarpsrknqgdfslsvrvgdqvthiriqnsgdfydlyggekfatltelveyytqqqgvlqdrdgtiihlkyplncsdptserwyhghmsggqaetllqakgepwtflvreslsqpgdfvlsvlsdqpkagpgsplrvthikvmceggrytvggletfdsltdlvehfkktgieeasgafvylrqpyysggggsslfkgprdynpisstichltnesdghttslygigfgpfiitnkhlfrrnngtllvqslhgvfkvkntttlqqhlidgrdmiiirmpkdfppfpqklkfrepqreericlvttnfqtksmssmvsdtsctfpssdgifwkhwiqtkdgqcgsplvstrdgfivgihsasnftntnnyftsvpknfmelltnqeaqqwvsgwrlnadsvlwgghkvfmskpeepfqpvkeatqlmnelvysq融合蛋白可以包含如seqidno:53或54所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。融合蛋白的sh2结构域和异源结构域可以通过接头分开，以在空间上分开sh2结构域和异源结构域。转录信号包含如前节所述的蛋白酶的融合蛋白可以与具有蛋白酶切割位点的膜栓系蛋白(membrane-tetheredprotein)在细胞中共表达。在蛋白酶位点处的膜栓系蛋白的切割将释放该蛋白的膜远端部分。膜栓系蛋白例如可以是膜栓系转录因子。当发生切割时，转录物从其栓系物上释放并自由转运到细胞核。zap70sh2或ptpn6sh2结构域与蛋白酶结构域之间的融合将分别导致在itam或itim磷酸化后蛋白酶的膜近端招募。itam或itim结构域的磷酸化导致将分别与蛋白酶结构域融合的zap70sh2或ptpn6sh2招募到膜近端区域。这导致转录因子从其栓系物上切割并转移到细胞核。这可能有很多应用：例如，激活后，t细胞可以被编程以表达起到阻止t细胞分化作用的转录因子。例如，激活后t细胞可以被编程以表达细胞因子，如可能起到刺激t细胞增殖和存活作用的il2、il7或il15，或可以将敌对肿瘤微环境转化为更有利于肿瘤免疫排斥的il12。具体而言，提供了细胞，其共表达：(i)包含来自结合磷酸化的itam的蛋白质的sh2结构域的融合蛋白；和(ii)膜栓系转录因子其中当所述转录因子从膜栓系物上释放时，该转录因子增加细胞中il2，il7和/或il15的表达。还提供了细胞，其共表达：(i)包含来自结合磷酸化的itim的蛋白质的sh2结构域的融合蛋白；和(ii)膜栓系转录因子其中当所述转录因子从膜栓系物上释放时，该转录因子增加细胞中il12的表达。蛋白酶识别位点蛋白酶识别位点可以是能够使融合蛋白的蛋白酶结构域在膜栓系物和转录因子之间特异性切割膜栓系转录因子的任何氨基酸序列。例如，在一个实施方案中，蛋白酶结构域是tev蛋白酶结构域并且蛋白酶识别位点是tev蛋白酶识别位点。膜栓系物(membranetether)膜栓系物可以是能够将转录因子和蛋白酶识别位点定位在膜近端处的任何序列，信号或结构域。例如，膜栓系物可以是myrsitylation信号或跨膜域。合适地，跨膜域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是由几个疏水性残基组成的alpha螺旋。任何跨膜蛋白的跨膜域均可用于提供跨膜部分。任何跨膜蛋白的跨膜域可以用于提供本发明的跨膜部分。本领域技术人员可以使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)确定蛋白的跨膜域的存在和跨度。此外，考虑到蛋白的跨膜域是相对简单的结构，即预测形成足够长度的疏水alpha螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工设计的tm结构域(us7052906b1描述了合成跨膜组分)。跨膜域可以来源于cd28，其产生良好的受体稳定性。转录因子转录因子可以是任何转录因子，其选择为在相关itam或itim基序磷酸化后刺激所需的应答。转录因子可以是天然的或人工的。人工转录因子可以来源于例如talen、锌指组装物或crispr/cas9，后者与指导mrna共表达。优选地，转录因子将含有核定位信号以在蛋白酶结构域切割后帮助其转运至核酸酶。例如，核酸序列(ii)(其编码包含膜栓系转录因子的蛋白质，该膜栓系转录因子包含：(i)膜栓系物；(ii)蛋白酶识别位点；和(iii)转录因子)可以编码蛋白质，该蛋白质由如seqidno:55所示序列组成或包含该序列，其中seqidno:55所示序列含有rqr8结构域；cd4-endotox1跨膜域，tev蛋白酶识别位点和vp16-gal4转录因子。seqidno:55mgtsllcwmalcllgadhadacpysnpslcsggggselptqgtfsnvstnvspakptttacpysnpslcsggggspaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdmalivlggvaglllfiglgiffcvrcrhrrrqaermaqikrvvsekktaqaphrfqktcspisggggsenlyfqmpkkkrkvapptdvslgdelhldgedvamahadalddfdldmlgdgdspgpgftphdsapygaldmadfefeqmftdalgideyggsgggsmqilvasdatmkllssieqacdicrlkklkcskekpkcakclknnwecryspktkrspltrahltevesrlerleqlfllifpredldmilkmdslqdikalltglfvqdnvnkdavtdrlasvetdmpltlrqhrisatssseessnkgqrqltv适当地，所述蛋白质可以包含如seqidno:55所示的序列；或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。受体本发明还提供了核酸构建体，其包含(a)编码根据本发明第一方面的包含ptpn6sh2结构域的融合蛋白的核酸序列，或编码根据本发明的第三方面的截短的蛋白质的核酸序列；和(b)编码包含含有itim的胞内域的受体的核酸序列。去势信号(castrationsignal)包含上述蛋白酶的融合蛋白可以与包含细胞内蛋白酶切割位点的靶受体在细胞中共表达。靶受体在蛋白酶位点处的切割将释放靶受体的细胞内膜远端部分。靶受体可以是例如t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。受体可以包含位于蛋白质的细胞内部分末端处的激活性或共刺激性胞内域。然后，在蛋白酶切割位点处切割从靶car除去激活性或共刺激性胞内域，减少或阻止靶受体介导的t细胞激活。或者，靶受体可以包含位于蛋白质的细胞内部分末端的抑制性胞内域。然后，在蛋白酶切割位点处的切割从靶car除去抑制性胞内域，“开通(switching-on)”靶受体介导的t细胞活化的潜能。抑制性胞内域例如可以包含cd148或cd45胞内域或来自蛋白质的含有itim的胞内域，所述蛋白质如pd1、pdcd1、btla4、lilrb1、lair1、ctla4、kir2dl1、kir2dl4、kir2dl5、kir3dl1或kir3dl3。例如，靶受体可以包含如seqidno:56所示序列，其包含含有来自pd-1的itim胞内域的针对cd33的car。seqidno:56mavptqvlgllllwltdarcdiqmtqspsslsasvgdrvtitcrasediyfnlvwyqqkpgkapklliydtnrladgvpsrfsgsgsgtqytltisslqpedfatyycqhyknypltfgqgtkleikrsggggsggggsggggsggggsrsevqlvesggglvqpggslrlscaasgftlsnygmhwirqapgkglewvssislnggstyyrdsvkgrftisrdnakstlylqmnslraedtavyycaaqdaytggyfdywgqgtlvtvssmdpatttkpvlrtpspvhptgtsqpqrpedcrprgsvkgtgldfacdiyvgvvggllgslvllvwvlavicsraargtigarrtgqplkedpsavpvfsvdygeldfqwrektpeppvpcvpeqteyativfpsgmgtssparrgsadgprsaqplrpedghcswpl适当地，蛋白质可以包含如seqidno:56所示序列；或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。当受体包含跨膜域和激活性胞内域之间的蛋白酶切割位点时，去势信号融合蛋白可用来抑制受体。例如，可以构建第一car，其中其胞内域通过蛋白酶切割位点与跨膜域分开。识别不同抗原的第二car可包含含有itim的胞内域。第二受体对关联抗原的识别将导致将去势信号融合蛋白招募到膜，并且随后在蛋白酶识别位点处切割。此类切割将使激活性胞内域与第一受体相分离，并阻止来自所述受体的激活和信号传播。这将导致“与非(andnot)”型逻辑门，其中只有当第一个car被单独激活时才会传输持续的信号(即，当第一个car结合其关联抗原但第二个car不结合其关联抗原时)。例如，此类“逻辑门”可能是有用的，因为单个抗原的存在(或不存在)有效地描述癌症是相对罕见的，其可导致缺乏特异性。靶向在正常细胞上表达的抗原导致靶向肿瘤外毒性(on-target,off-tumourtoxicity)。在一些癌症中，通过存在一种抗原(通常是组织特异性抗原)和不存在另一种存在于正常细胞上的抗原来最好地定义肿瘤。例如，急性骨髓性白血病(aml)细胞表达cd33。正常干细胞表达cd33，但也表达cd34，而aml细胞通常是cd34阴性的。仅靶向cd33来治疗aml与显著的毒性相关，因为其消耗正常的干细胞。然而，特异性靶向cd33阳性但不是cd34阳性的细胞将避免这种相当大的脱靶(off-target)毒性。表2中显示了用于此类“与非”门的潜在抗原对。表2例如，包含在跨膜域和激活性胞内域之间处的蛋白酶切割位点的受体可以是如seqidno:57所示的序列，其含有具有可切割的cd3-zeta胞内域的针对cd19的car。seqidno:57mslpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitkaggggsggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdifwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrcrhrrrqaermaqikrvvsekktaqaphrfqktcspisggggsenlyfqmrrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalppr适当地，所述蛋白质可以包含如seqidno:57所示的序列或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。其中受体包含经由蛋白酶切割位点与抑制胞内域融合的激活性胞内域，去势信号融合蛋白可用于激活人工信号传导结构域。例如，可以构建第一car，其中其胞内域包含经由蛋白酶切割位点与抑制性胞内域融合的激活性胞内域。识别不同的抗原的第二car可以包含含有itim的胞内域。第二受体对关联抗原的识别将导致将去势信号融合蛋白招募至膜并随后从第一受体的激活性胞内域上切割抑制性胞内域。从激活性胞内域上切割和分离抑制性胞内域将允许抗原结合后的第一car的激活并因此经由第一受体激活信号传导。这将导致“与”型car逻辑门，其中只有当第一和第二受体被激活时才会发生有效的信号传导。例如，此类“逻辑门”是有用的，因为大多数癌症不能基于单一抗原与正常组织区分开来。因此，发生相当大的“靶向肿瘤外”毒性，由此正常组织被治疗破坏。对于一些癌症来说，靶向两种癌症抗原的存在可以比靶向一种更有选择性并因此更有效。例如，b-慢性淋巴细胞性白血病(b-cll)是目前通过靶向cd19来治疗的常见白血病。这治疗淋巴瘤，但也消耗整个b细胞部分，使得治疗有相当的毒性作用。b-cll具有不同寻常的表型，因为cd5和cd19是共表达的。通过仅靶向表达cd5和cd19的细胞，有可能显著降低靶向肿瘤外毒性。表3中显示了用于此类“与”逻辑门的潜在抗原对表3癌症类型抗原慢性淋巴细胞白血病cd5,cd19神经母细胞瘤alk,gd2胶质瘤egfr,波形蛋白多发性骨髓瘤bcma,cd138肾细胞癌碳酸酐酶ix,g250t-allcd2,n-钙粘蛋白前列腺癌psma,hepsin(或其他)例如，包含经由蛋白酶切割位点融合到抑制性胞内域的激活性胞内域的受体可以是如seqidno:58所示的序列；该序列含有具有cd3-zeta胞内域和可切割cd148的针对cd19的car。seqidno:58mslpvtalllplalllhaarpdiqmtqttsslsaslgdrvtiscrasqdiskylnwyqqkpdgtvklliyhtsrlhsgvpsrfsgsgsgtdysltisnleqediatyfcqqgntlpytfgggtkleitkaggggsggggsggggsggggsevklqesgpglvapsqslsvtctvsgvslpdygvswirqpprkglewlgviwgsettyynsalksrltiikdnsksqvflkmnslqtddtaiyycakhyyyggsyamdywgqgtsvtvssdptttpaprpptpaptiasqplslrpeacrpaaggavhtrgldfacdifwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprenlyfqmavfgcifgalvivtvggfifwrkkrkdaknnevsfsqikpkksklirvenfeayfkkqqadsncgfaeeyedlklvgisqpkyaaelaenrgknrynnvlpydisrvklsvqthstddyinanympgyhskkdfiatqgplpntlkdfwrmvweknvyaiimltkcveqgrtkceeywpskqaqdygditvamtseivlpewtirdftvkniqtseshplrqfhftswpdhgvpdttdllinfrylvrdymkqsppespilvhcsagvgrtgtfiaidrliyqienentvdvygivydlrmhrplmvqtedqyvflnqcvldivrsqkdskvdliyqnttamtiyenlapvttfgktngyia适当地，受体可以包含如seqidno:58所示的序列；或具有至少80、85、90、95、98或99％序列同一性的其变体。阻断信号本发明提供了截短的蛋白质，其包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的激活基序(itam)结合的蛋白质的sh2结构域，但缺少激酶结构域。例如，截短的蛋白可以包含zap70sh2结构域但缺少zap70激酶结构域。换而言之，本发明提供了截短的蛋白质，其：(i)包含如seqidno:2所示的序列，但不包含如seqidno:26所示的序列。zap70sh2结构域的过表达导致与全长/野生型zap70的竞争。由于截短的zap70不能传播信号，信号传递随着野生型zap70和截短蛋白之间的比率成比例地降低。这对于降低t细胞激活的强度，例如防止可以导致t细胞耗竭、活化诱导的细胞死亡以临床上可能导致细胞因子风暴(cytokinestorms)的t细胞过度激活可以是有用的。本发明还提供了截短的蛋白质，其包含来自与磷酸化的基于免疫受体酪氨酸的抑制基序(itim)结合的蛋白质的sh2结构域，但缺少磷酸酶结构域。例如，截短的蛋白质可以包含ptpn6sh2结构域但缺少ptpn6磷酸酶结构域。换而言之，本发明提供了截短的蛋白质，其：(i)包含如seqidno:6所示的序列，但不包含如seqidno:27所示的序列。在这种情况下，itim信号传导可以随着野生型ptpn6和截短蛋白之间的比率成比例地降低。这可以有助于减少抑制性信号，如pd1信号。当t细胞靶向过表达pdl1(或类似的抑制性受体)以逃避免疫排斥的肿瘤时，这可以是有用的。上述阻断信号或串扰信号的使用相对于通常用抗体阻断单个配体/受体相互作用(例如pd-l1/pd1)的传统免疫检查点阻断方法提供了显著的优势。如上所述，抑制性免疫受体类型包含许多具有随t细胞状态而波动的冗余和表达模式的成员。抗体或重组配体/受体的使用可以有效地阻断一种抑制性受体，但不会影响其他传输的抑制信号。个别抑制性受体的基因组编辑(mengeretal,cancerres.2016apr15；76(8):2087-93)具有类似的限制。个别抑制性受体与共刺激结构域之间融合的策略也受到类似的限制(liuetal,cancerres.2016mar15；76(6):1578-90)。本发明的方法将阻断(并取决于策略重新解释)经由itim传送的抑制性信号。因此调制了整个类别的抑制性信号。在odorizzi和wherry(2012)j.immunol.188:2957-2965的表ii中提供了通过itim发信号的抑制性受体的列表。它们包括：pd1、btla、2b4、ctla-4、gp49b、lair-1、pir-b、pecam-1、cd22、siglec7、siglec9、klrg1、ilt2、cd94-nkg2a和cd5。核酸一方面，本发明提供了编码根据本发明的融合蛋白或截短的蛋白的核酸。如本文所用，术语“多核苷酸”、“核苷酸”和“核酸”旨在是彼此同义的。本领域的技术人员将理解由于遗传密码的简并性，许多不同的多核苷酸和核酸可以编码相同的多肽。另外，本领域的技术人员应当理解使用常规技术，可以制备核苷酸取代，其不影响由此处所述的多核苷酸编码的多肽序列，以反映多肽将在其中表达的任意特定宿主生物中的密码子选择。根据本发明的核酸可以包括dna或rna。它们可以是单链的或双链的。它们也可以是在它们之中包括合成的或修饰的核苷酸的多核苷酸。对寡核苷酸的一些不同类型的修饰是本领域已知的。这些包括膦酸甲酯和硫代磷酸酯骨架，在分子的3’和/或5’末端的吖啶(acridine)或聚赖氨酸链的添加。为了如本文所述的用途的目的，应当理解可以通过本领域可用的任意方法修饰多核苷酸。为了提高感兴趣的多核苷酸的体内活性或寿命可以进行此类修饰。术语“变体”、“同源物”或“衍生物”关于核苷酸序列包括来自序列或对序列的一个(或多个)核酸的任意取代，变异，修饰，置换，缺失或添加。核酸构建体一方面，本发明提供了将本发明的截短的蛋白或融合蛋白质与另一种蛋白质共表达的核酸构建体。核酸构建体可以包含：编码本发明的截短的蛋白或融合蛋白的核酸序列；和编码另一种蛋白质的核酸。本发明提供了将本发明的截短蛋白或融合蛋白质与嵌合抗原受体共表达的核酸构建体。核酸构建体可以包含：(i)编码本发明的截短的蛋白或融合蛋白的核酸序列；和(ii)编码嵌合抗原受体的核酸。嵌合抗原受体(car)可以是包含含有itam的胞内域(如cd3zeta)的激活性car。car可以是包含“连接关闭(ligation-off)”胞内域的抑制性car，如wo2015/075469中所述，该car可以包含来自受体样酪氨酸磷酸酶(如cd148或cd45)的全部或部分胞内域。car可以是包含“连接开启(ligation-on)”胞内域的抑制性car，如wo2015/075469中所述，其可以包含itim结构域。本发明的融合蛋白和截短的蛋白可以与表达两种或更多种car的“逻辑门”组合的细胞一起使用。或(or)门包含两种激活性car，如wo2015/075468中所述。和(and)门包含激活性car和“连接关闭(igation-off)”抑制性car，如wo2015/075469中所述。因此，本发明提供了核酸构建体，其包含：(i)编码本发明的截短的蛋白或融合蛋白的核酸序列；(ii)第一嵌合抗原受体(car)；和(iii)第二嵌合抗原受体。参照本发明的转录信号方面，这里提供了核酸构建体，其包含(i)编码包含sh2结构域和蛋白酶结构域的融合蛋白的核酸序列；和(ii)编码膜栓系转录因子的核酸序列，该膜栓系转录因子包含：膜栓系物；蛋白酶识别位点；和转录因子。参照本发明的去势信号方面，这里提供了核酸构建体，其包含(i)编码包含sh2结构域和蛋白酶结构域(如tev结构域)的融合蛋白的核酸序列；和(ii)编码包含蛋白酶切割位点的受体的核酸序列。例如，本发明提供了核酸构建体，其包含：(a)编码融合蛋白的核酸序列，所述融合蛋白包含(i)ptpn6sh2结构域；和(ii)蛋白酶结构域(如tev结构域)；(b)编码包含蛋白酶切割位点的受体的核酸序列；和(c)编码包含含有itim的胞内域的受体的核酸序列。受体可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)。适当地，由核酸序列(b)编码的蛋白质可以是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，其包含(i)跨膜结构域和激活性胞内域之间的蛋白酶切割位点；或(ii)经由蛋白酶切割位点融合到抑制性胞内域的激活性胞内域。在本发明的核酸构建体生产独立的多肽例如当其共表达本发明的融合蛋白和car的情况下，其还可以包含使两种蛋白质能够表达的核酸序列。例如，其可以包含编码两个核酸序列之间的切割位点的序列。切割位点可以是自切割的，使得当产生新生多肽时，它立即被切割成两种蛋白质，而不需要任何外部切割活性。各种自切割位点是已知的，包括口蹄疫病毒(fmdv)2a自切割肽，其具有以下示出的序列：seqidno:59raegrgslltcgdveenpgp或seqidno:60qctnyallklagdvesnpgp共表达序列可以是内部核糖体进入序列(ires)。共表达序列可以是内部启动子。嵌合抗原受体(car)在图13中示意性显示的car是嵌合的i型跨膜蛋白质，其将胞外抗原识别域(结合剂)连接至胞内信号传导域(胞内域)。结合物通常为来源于单克隆抗体(mab)的单链可变片段(scfv)，但它可以是基于包含抗体样抗原结合位点的其他形式。为将结合物与膜分离并允许它具有合适的方向，间隔域通常是必需的。常用的间隔域是igg1的fc。取决于抗原，更紧凑的间隔区可以足够，例如来自cd8α的茎部和甚至是仅igg1的铰链。跨膜域将蛋白质锚定在细胞膜中，并将间隔区连接至胞内域。早期的car设计具有来源于fcεr1或cd3ζ的γ链的细胞内部分的胞内域。因此，这些第一代受体传输免疫信号1，其足以触发相关靶细胞的t细胞杀死，但未能充分激活t细胞以增殖和存活。为了克服此限制，已构建了复合胞内域:t细胞共刺激分子的胞内部分与cd3ζ的胞内部分的融合导致了可在抗原识别后同时传输激活和共刺激信号的第二代受体。最常使用的共刺激域是cd28的共刺激域。这提供最有效的共刺激信号-即触发t细胞增殖的免疫信号2。也已经描述了包括tnf受体家族胞内域的一些受体，例如密切相关的传输存活信号的ox40和41bb。甚至现在已经描述了更强大的第三代car，其具有能够传输激活，增殖和存活信号的胞内域。使用例如逆转录病毒载体可以将car编码核酸转移到t细胞。可使用慢病毒载体。通过这种方式可产生用于过继性细胞转移的大量的癌特异性t细胞。当car结合靶抗原时，这导致活化信号传输到表达所述car的t细胞上。因此，car指导t细胞的针对表达靶抗原的肿瘤细胞的特异性和细胞毒性。因此，car通常包含：(i)抗原结合域；(ii)间隔区；(iii)跨膜域；和(iii)包含信号传导域或与信号传导域相关的胞内域。抗原结合域抗原结合域是car的识别抗原的部分。众多的抗原结合域是本领域公知的，包括基于抗体，抗体模拟物和t细胞受体的抗原结合位点的那些抗原结合域。例如，抗原结合域可以包含：由单克隆抗体衍生的单链可变片段(scfv)；靶抗原的天然配体；具有针对靶标的足够亲和性的肽；单域抗体；人工单结合剂诸如darpin(设计的锚蛋白重复蛋白)；或t细胞受体衍生的单链。抗原结合域可包含不基于抗体的抗原结合位点的域。例如，抗原结合域可包含基于蛋白质/肽的域，所述蛋白质/肽为肿瘤细胞表面受体的可溶性配体(例如可溶性肽，如细胞因子或趋化因子)；或膜锚定配体或者受体的胞外域，对于所述配体或者受体，结合对对应物表达在肿瘤细胞上。抗原结合结构域可以基于抗原的天然配体。抗原结合结构域可以包含来自组合文库的亲和肽或从头设计的亲和蛋白/肽。间隔区结构域car包含间隔区序列以连接抗原结合域与跨膜域并且在空间上分离来自胞内域的抗原结合域。柔性间隔区允许抗原结合域在不同方向上定向以促进结合。在需要种car的本发明的方面中，第一和第二car可以包含不同的间隔区分子。例如，间隔区序列可以例如包含igg1fc区，igg1铰链或人cd8茎或小鼠cd8茎。间隔区可以备选地包含备选的接头序列，其具有与gg1fc区，igg1铰链或cd8茎相似的长度和/或域间距性质。可以改变人igg1间隔区以除去fc结合基序。上面提到的所有间隔域都是同源二聚体。然而，机制不限于使用同源二聚体受体并也应当适用于单体受体，只要间隔区足够刚性即可。此类间隔区的例子为cd2或截短的cd22。由于car通常是同源二聚体(参见图13a)，交叉配对可能导致异源二聚体嵌合抗原受体。由于各种原因，这是不希望的，例如：(1)靶细胞上的表位可能不处于相同的“水平”使得交叉配对的car可以只能与一个抗原结合；(2)来自两种不同scfv的vh和vl可以互换并且要么不能识别靶标，要么更糟糕地识别意想不到的和不可预测的抗原。对于如上描述的“与”和“与非”门，为了避免交叉配对但与共同定位足够相似，第一car的间隔区可以与第二car的间隔区充分不同。可以使用成对的直系同源间隔区序列。例子是鼠和人cd8茎部，或者可选地是单体的间隔区结构域--如cd2的胞内域。下表中示出了共定位的间隔区对的示例：跨膜域跨膜域是car的跨越膜的序列。跨膜域可以是在膜中热力学稳定的任何蛋白质结构。这通常是由几个疏水性残基构成的螺旋。可以将任何跨膜蛋白质的跨膜域用于提供本发明的跨膜部分。蛋白质的跨膜域的存在和跨度可以通过本领域的技术人员使用tmhmm算法(http://www.cbs.dtu.dk/services/tmhmm-2.0/)来确定。此外，考虑到蛋白质的跨膜域是相对简单的结构，即预测形成足够长的疏水alpha螺旋以跨越膜的多肽序列，也可以使用人工设计的tm域(us7052906b1描述了合成的跨膜组分)。跨膜域可以源自cd28，其提供了良好的受体稳定性。激活性胞内域胞内域是car的信号传输部分。它可以是car细胞内结构域的一部分或与之相关联。在抗原识别后，受体聚簇，天然cd45和cd148被排除在突触外，并且将信号传输到细胞。最常用的胞内域组分是含有3个itam的cd3-zeta的胞内域。这在结合抗原后将激活信号传输到t细胞。cd3-zeta可能不能提供完全有能力(competent)的激活信号，并且可能需要额外的共刺激信号。例如，可以将嵌合cd28和ox40与cd3-zeta一起用于传输增殖/存活信号，或全部三种可以一起使用。在car包含及活性胞内域的情况下，它可以仅包含cd3-zeta胞内域，cd3-zeta胞内域与cd28或ox40的胞内域，或cd28胞内域和ox40和cd3-zeta胞内域。任何含有itam基序的胞内域都可以作为本发明中的激活性胞内域。本文描述了含有itam基序的合适的胞内域。抑制性胞内域在上面称为“与”门的实施方案中，第一car可以包含经由蛋白酶切割位点融合到抑制性胞内域的激活性胞内域。使得在不存在第二car的激活的情况下，抑制性胞内域抑制通过第一car的t细胞激活。激活第二car后，第二car的胞内域中的itim被磷酸化并且ptpn6/磷酸酶结构域融合蛋白被招募到膜。这导致第一car在激活性胞内域和抑制性胞内域之间处的切割，因此使t细胞激活。当处于相同胞内域时，抑制性胞内域可以包含抑制通过激活性car的t细胞信号传导的任何序列。抑制胞内域可以是或包含酪氨酸磷酸酶，如受体样酪氨酸磷酸酶。抑制性胞内域可以是或包含当与car的激活性胞内域共定位时能够抑制tcr信号传导的任何酪氨酸磷酸酶。抑制性胞内域可以是或包含对于磷酸化itam具有足够快的催化速率的任何酪氨酸磷酸酶，所述磷酸化的itam当与car的激活性胞内域共定位时能够抑制tcr信号传导。载体本发明还提供载体，或载体的试剂盒，其包括根据本发明的一个或多个核酸序列或构建体。此类载体可以用于将核酸序列或构建体导入宿主细胞中，使得其表达由核酸序列或构建体编码的蛋白质。载体可以是例如质粒或病毒载体，如逆转录病毒载体或慢病毒载体，或基于转座子的载体或合成的mrna。载体可以能够转染或转导t细胞。细胞本发明还涉及免疫细胞，所述细胞包含本发明的融合蛋白、截短的蛋白质、核酸和/或核酸构建体。细胞可以是细胞溶解免疫细胞。细胞溶解免疫细胞可以是t细胞或t淋巴细胞，其是在细胞介导的免疫中起中心作用的淋巴细胞类型。通过细胞表面上的t细胞受体(tcr)的存在，可以将它们与其它淋巴细胞，如b细胞和天然杀伤细胞(nk细胞)区分。存在多种类型的t细胞，如下文总结的。辅助t辅助细胞(th细胞)在免疫过程中协助其它白细胞，包括b细胞成熟成为浆细胞和记忆b细胞，和细胞毒性t细胞和巨噬细胞的激活。th细胞在它们的表面上表达cd4。当抗原提呈细胞(apc)表面上的mhcii类分子将肽抗原呈递至th细胞时，它们变得激活。可以将这些细胞分化成几个亚型的一种，包括th1、th2、th3、th17、th9，或tfh，其分泌不同的细胞因子以促进不同类型的免疫应答。细胞溶解t细胞(tc细胞，或ctl)破坏病毒感染的细胞和肿瘤细胞，并也牵连在移植排斥中。ctl在它们表面上表达cd8。这些细胞通过结合与mhci类联合的抗原识别它们的靶标，所述mhci类存在于所有有核细胞的表面上。通过由调节t细胞分泌的il-10、腺苷和其它分子，cd8+细胞可以失活为无变应性状态，其防止自身免疫性疾病，如实验性自身免疫性脑脊髓炎。记忆t细胞是抗原特异性t细胞的子集，其在感染已经解决之后长期持续。它们在再次暴露于其同源(cognate)抗原后迅速扩增为大量效应t细胞，从而为免疫系统提供了针对过去感染的“记忆”。记忆t细胞包括三种亚型：中央记忆t细胞(tcm细胞)和两种类型的效应记忆t细胞(tem细胞和temra细胞)。记忆细胞可以是cd4+或cd8+。记忆t细胞通常表达细胞表面蛋白cd45ro。调节t细胞(treg细胞)，以前称为抑制t细胞，对于免疫耐受的维持是重要的。它们主要的作用是关闭t细胞介导的免疫朝向免疫反应的结束和抑制逃脱胸腺中的阴性选择过程的自身反应t细胞。已经描述了两类主要的cd4+treg细胞--天然存在的treg细胞和适应性treg细胞。天然存在的treg细胞(也称为cd4+cd25+foxp3+treg细胞)在胸腺中产生，并已经与形成中的t细胞和已经使用tslp激活的髓样(cd11c+)以及浆细胞样(cd123+)树突细胞两者之间的相互作用相连。可以通过称为foxp3的细胞内分子的存在，将天然发生的treg细胞与其它t细胞区分。foxp3基因的突变可以阻止调节性t细胞的发育，导致致命的自身免疫病ipex.适应性treg细胞(也称为tr1细胞或th3细胞)可以在正常免疫应答期间起源。自然杀伤细胞(或nk细胞)是一种构成先天免疫系统的一部分的细胞溶解细胞。nk细胞以不依赖mhc的方式提供对来自病毒感染细胞的固有信号的快速应答。nk细胞(属于固有淋巴样细胞组)定义为大颗粒淋巴细胞(lgl)并构成第三种细胞，其与产生b和t淋巴细胞的共同淋巴样前体细胞区分。已知nk细胞在骨髓、淋巴结、脾、扁桃体和胸腺中分化并成熟，然后它们在那里进入循环。本发明的细胞可以是上述任意细胞类型。可以离体从患者自身的外周血(第一方)，或在来自供体外周血的造血干细胞移植物的背景(第二方)中，或来自无关联供体的外周血(第三方)创建表达本发明的分子的t或nk细胞。或者，表达本发明的分子的t或nk细胞可以来源于可诱导祖细胞或胚胎祖细胞离体分化为t或nk细胞。或者，可以使用保留了其溶解功能并可以起治疗剂作用的永生化的t细胞系。在所有这些实施方案中，通过许多方法的一种导入编码car的dna或rna生成car细胞，所述方法包括使用病毒载体转导，使用dna或rna转染。本发明的细胞可以是来自受试者的离体t或nk细胞。t或nk细胞可以来自外周血单核细胞(pbmc)样品。在使用本发明的核酸转导之前，可以激活和/或扩增t或nk细胞，例如通过使用抗cd3单克隆抗体处理。本发明的t或nk细胞可以通过以下制成：(i)从受试者或以上列出的其它来源分离含有t或nk细胞的样品；和(ii)使用根据本发明的一种或多种核酸序列转导或转染t或nk细胞。接着，可以纯化t细胞或nk细胞，例如基于抗原结合多肽的抗原结合域的表达选择。本发明还提供了包含本发明的融合蛋白或截短的蛋白和嵌合抗原受体(car)的细胞。嵌合抗原受体(car)可以是包含含有itam的胞内域(例如cd3zeta)的激活性car。car可以是包含“连接关闭(ligation-off)”胞内域的抑制性car，如wo2015/075469中所述，所述抑制性car可以包含来自受体样酪氨酸磷酸酶(如cd148或cd45)的全部或部分胞内域。car可以是包含“连接开启(ligation-on)”胞内域的抑制性car，如wo2015/075470中所述，所述抑制性car可以包含itim结构域。本发明的融合蛋白和截短的蛋白可以与表达两种或更多种car的“逻辑门”组合的细胞一起使用。或(or)门包含两种激活性car，如wo2015/075468中所述。和(and)门包含激活性car和“连接关闭(ligation-off)”抑制性car,如wo2015/075469中所述。andnot包含激活性car和“连接开启”抑制性car，如wo2015/075470中所述。因此，本发明提供了细胞，其包含：(i)编码本发明的截短蛋的白或融合蛋白的核酸序列；(ii)第一嵌合抗原受体(car)；和(iii)第二嵌合抗原受体。参照本发明的转录信号方面，这里提供了细胞，其包含(i)包含sh2结构域和蛋白酶的融合蛋白；和(ii)膜栓系转录因子，其包含：膜栓系物；蛋白酶识别位点；和转录因子。参照本发明的去势信号方面，这里提供了细胞，其包含(i)包含sh2结构域和蛋白酶的融合蛋白；和(ii)包含蛋白酶切割位点的受体。受体可以例如是t细胞受体(tcr)或嵌合抗原受体(car)，其包含(i)在跨膜域和激活性胞内域之间的蛋白酶切割位点；或(ii)经由蛋白酶切割位点融合到抑制性胞内域的激活性胞内域。组合物本发明还涉及含有多个本发明的细胞的药物组合物。药物组合物可另外包含药学上可接受的载体，稀释剂或赋形剂。药物组合物可任选包含一种或多种其它药物活性多肽和/或化合物。此类制剂可以例如是适合于静脉内输注的形式。治疗方法本发明的细胞可以能够杀死靶细胞，例如癌细胞。本发明的细胞可用于感染(如病毒感染)的治疗。本发明的细胞也可以用于控制病原性免疫应答，例如，自身免疫性疾病，变态反应和移植物抗宿主排斥。本发明的细胞可以用于治疗癌性疾病，如膀胱癌，乳腺癌，结肠癌，子宫内膜癌，肾癌(肾细胞)，白血病，肺癌，黑素瘤，非霍奇金淋巴瘤，胰腺癌，前列腺癌和甲状腺癌。本发明的细胞可用于治疗：口腔和咽的癌症，包括舌癌、口腔癌和咽癌；消化系统的癌症，其包括食管癌，胃癌和结肠直肠癌；肝脏和胆道系统的癌症，其包括肝细胞癌和胆管癌；呼吸系统的癌症，其包括支气管癌和咽癌；骨和关节的癌症，其包括骨肉瘤；皮肤癌，其包括黑素瘤；乳腺癌；生殖道的癌症，其包括在女性中的子宫癌，卵巢癌和宫颈癌，以及在男性中的前列腺癌和睾丸癌；肾道的癌症，其包括肾细胞癌，尿道或膀胱的移行细胞癌；脑癌，其包括胶质瘤，多形性胶质母细胞瘤和髓母细胞瘤(medullobastomas)；内分泌系统的癌症，包括甲状腺癌，肾上腺癌和与多发性内分泌腺新生物综合征相关的癌症；淋巴瘤，其包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤；多发性骨髓瘤和浆细胞瘤；急性和慢性白血病，髓样或淋巴性白血病；以及其他的未指明位点的癌症，包括神经母细胞瘤。用本发明的细胞进行的治疗可以帮助防止在标准方法中经常发生的肿瘤细胞的逃逸或释放。现在将通过实施例进一步描述本发明，所述实施例意在用于协助本领域普通技术人员中实施本发明，并且不是意在以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1：将t细胞激活途径征用于(subjugation)增强的或非生理性信号测试了参与早期t细胞信号激活的一些sh2结构域以确定t细胞激活信号是否可以被征用(subjugate)或“劫持”，使得当t细胞被激活时，可以调制或重新传输信号。发明人通过将akt的激酶结构域连接到来自zap70，grap，grb2和plcγ的sh2结构域而产生了数种嵌合akt构建体(图8)。在未转导的(nt)t细胞中，在用okt3处理以诱导tcr的交联和活化后，可检测到非常低水平的内源性akt的磷酸化水平(图10b：上图)。然而，在表达zap-akt构建体的细胞中，观察到显著水平的磷酸化-akt(图10b：下图)。活化t细胞的接头(lat)是zap70的下游靶物，并且通过数种含有sh2的蛋白(如grb2，grap和plcγ)结合。预计来自这些lat结合物中的每个的sh2结构域也将允许劫持来自cd3-zeta的激活信号。但是，事实并非如此。当akt激酶结构域连接至来自grb2，grap或plcγ的sh2结构域时，没有观察到比ntt细胞观察到的更高水平的akt激酶结构域的tcr-依赖性磷酸化(图9a)。这说明了该t细胞信号传导劫持系统特别需要来自诸如zap70或酪氨酸蛋白磷酸酶非受体6型(ptpn6)的非常早期的t细胞信号传导分子的串联sh2结构域。实施例2：转录控制将tetv蛋白酶融合到zap70sh2结构域。膜结合的转录因子也如下克隆：与vp16/gal4转录因子框内克隆rqr8，其通过tev切割位点分开。该融合蛋白允许在tev切割时释放vp16/gal4转录因子(其含有核定位信号)。这些蛋白质均在还表达cd19特异性嵌合抗原受体的t细胞中表达。为了证明需要zap70-tev方法，该转录因子也与用tev替换了其胞内域的cd19car共表达(图11)。将t细胞暴露于cd19阴性和阳性靶物。通过响应于galv/vp16的萤光素酶基因盒来测量转录激活。只有在标准cd19car与zap-tev和膜栓系转录因子共表达的条件下，才导致cd19识别后的选择性转录激活。直接与tev融合的cd19car导致组成型转录激活(图12)。实施例3：使用截短的shp-1(ptpn6)或截短的shp-2的pd-1信号阻断如下表所示转导pbmc细胞：将细胞与用cd19，pdl1或两者转导的supt1细胞共培养48小时，并通过elisa测量ifnγ释放。结果示于图15。supt1靶细胞上存在pdl1导致ifnγ释放减少。与仅表达car的那些pbmc相比，用表达car和截短的shp-1或截短的shp-2构建体的pbmc增加了ifnγ的释放。这说明截短的shp-1和shp-2构建体成功地抑制了来自靶细胞的pdl1抑制性信号。实施例4：使用shp-2sh2结构域与zap70激酶的融合物的pd-1信号劫持如下表所示转导pbmc细胞：将细胞与用cd19或pdl1转导的supt1细胞以1:1的比例共培养24小时。通过elisa测量ifnγ释放(图16a)。与car+pd1转导的t细胞相比，在car-shp2.zap70+pd1转导的t细胞与pdl1supt1靶细胞的共培养物中观察到ifn-γ生产的增加。还进行了细胞毒性测定，其中通过facs来定量supt1细胞的杀伤(图16b)。在pdl1阳性靶细胞与car-shp2.zap70+pd1转导的t细胞的共培养物中观察到对pdl1supt1靶物几乎完全杀伤。相反，用car+pd1的单独构建体没有看到杀伤。这说明用zap70的激酶结构域替换shp2的磷酸酶结构域成功地将抑制性pd1信号转化为激活性信号。因此，shp-2-zap激酶融合蛋白成功地劫持了抑制性pdl1-pd1信号并将其转变为t细胞激活信号。上述说明书中提及的所有出版物通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下，本发明的所述方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员将是显而易见的。虽然已经结合具体的优选实施例描述了本发明，但是应当理解，所要求保护的本发明不应被不适当地限于这些具体实施例。实际上，对于分子生物学，细胞生物学或相关领域的技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求的范围内。序列表<110>ucl商务股份有限公司<120>细胞<130>p106294pct<150>gb1509413.9<151>2015-06-01<160>63<170>patentinversion3.5<210>1<211>619<212>prt<213>智人<400>1metproaspproalaalahisleuprophephetyrglyserileser151015argalaglualaglugluhisleulysleualaglymetalaaspgly202530leupheleuleuargglncysleuargserleuglyglytyrvalleu354045serleuvalhisaspvalargphehishispheproilegluarggln505560leuasnglythrtyralailealaglyglylysalahiscysglypro65707580alagluleucysgluphetyrserargaspproaspglyleuprocys859095asnleuarglysprocysasnargproserglyleugluproglnpro100105110glyvalpheaspcysleuargaspalametvalargasptyrvalarg115120125glnthrtrplysleugluglyglualaleugluglnalaileileser130135140glnalaproglnvalglulysleuilealathrthralahisgluarg145150155160metprotrptyrhisserserleuthrarggluglualagluarglys165170175leutyrserglyalaglnthraspglylyspheleuleuargproarg180185190lysgluglnglythrtyralaleuserleuiletyrglylysthrval195200205tyrhistyrleuileserglnasplysalaglylystyrcysilepro210215220gluglythrlyspheaspthrleutrpglnleuvalglutyrleulys225230235240leulysalaaspglyleuiletyrcysleulysglualacysproasn245250255serseralaserasnalaserglyalaalaalaprothrleuproala260265270hisproserthrleuthrhisproglnargargileaspthrleuasn275280285seraspglytyrthrprogluproalaargilethrserproasplys290295300proargprometprometaspthrservaltyrgluserprotyrser305310315320aspproglugluleulysasplyslysleupheleulysargaspasn325330335leuleuilealaaspilegluleuglycysglyasnpheglyserval340345350argglnglyvaltyrargmetarglyslysglnileaspvalalaile355360365lysvalleulysglnglythrglulysalaaspthrgluglumetmet370375380argglualaglnilemethisglnleuaspasnprotyrilevalarg385390395400leuileglyvalcysglnalaglualaleumetleuvalmetglumet405410415alaglyglyglyproleuhislyspheleuvalglylysarggluglu420425430ileprovalserasnvalalagluleuleuhisglnvalsermetg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