增强木糖的微藻代谢的制作方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2015年7月13日提交的美国临时申请号62/191,983和2016年6月24日提交的美国临时申请号62/354,444的优先权权益，所述临时申请以引用的方式整体并入本文。
发明背景
微生物的异养发酵是生成高价值油和生物质产品的有效方式。在某些培养条件下，微生物合成可被提取并用于生产燃料(例如,生物柴油、生物喷气燃料等)和营养脂质(例如，多不饱和脂肪酸如dha、epa和dpa)的细胞内油。由于高多不饱和脂肪酸(pufa)和蛋白质含量，一些微生物的生物质具有巨大营养价值，并且可用作动物饲料的营养补充剂。破囊壶菌是可用于此类发酵过程以产生脂质的真核单细胞微生物。使用破囊壶菌的异养发酵将生长培养基中提供的有机碳转化成脂质，所述脂质在发酵过程结束时从生物质中收获。但是，现有微生物发酵主要使用昂贵的碳水化合物(如葡萄糖)作为碳源。
发明概述
本文提供重组微生物，所述重组微生物具有编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中编码所述木糖异构酶的所述核酸是外源核酸。任选地，所述重组微生物包含至少一个编码木酮糖激酶的核酸序列和/或至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。所提供的重组微生物能够在作为碳源的木糖上生长。
附图简述
图1是木糖代谢途径的示意图。
图2是示出在葡萄糖饥饿循环期间野生型onc-t18中木糖异构酶的表达的图。
图3是示出在葡萄糖饥饿循环期间野生型onc-t18中推定木酮糖激酶的表达的图。
图4是示出α-微管蛋白ble-异构酶质粒构建体的示意图。
图5是示出α-微管蛋白hygro-xylb质粒构建体的示意图。
图6是示出具有α-微管蛋白启动子、ble序列、2a序列、木糖异构酶序列和α-微管蛋白终止子的核酸构建体的示意图。
图7是用于探测重组onc-t18菌株“6”和“16”内的木糖异构酶his-标记的基因的dna印迹的图像。
图8是示出重组onc-t18菌株中木糖异构酶his标记的基因插入的数量的qpcr测定的图。
图9是用于探测含有木糖异构酶和木酮糖激酶两者(在图中称为“7-3”和“7-7”)的重组onc-t18菌株内的xylb基因的dna印迹的图像。
图10是重组7-3和7-7onc-t18菌株中xylb基因插入的数量的qpcr测定的图。
图11是示出重组onc-t18菌株“6”和“16”中木糖异构酶基因转录物的表达的图。
图12是示出野生型onc-t18和重组onc-t18菌株“6”和“16”中的体外木糖异构酶活性的图。
图13是示出仅编码木糖异构酶的重组onc-t18菌株“16”以及编码木糖异构酶和木酮糖激酶的重组onc-t18菌株“7-3”和“7-7”的体外组合木糖异构酶和木酮糖激酶活性的图。
图14a和14b是示出重组onc-t18菌株“16”(正方形)中的木糖摄取改善和木糖醇产生降低的图。野生型(wt)菌株由菱形表示。
图15a和15b是示出重组onc-t18菌株“16”(正方形)以及重组onc-t18菌株“7-3”(三角形)和“7-7”(星号)中的木糖使用改善和木糖醇产生降低的图。野生型(wt)菌株由菱形表示。
图16是示出在用重组onc-t18菌株“16”和重组onc-t18菌株“7-7”进行葡萄糖:木糖发酵期间木糖醇积聚的图。
图17是用于转化onc-t18的构建体的不同型式的示意图。
图18是示出来自大肠杆菌(seqidno:20)的xylb序列与大肠杆菌xylb的密码子优化型式(seqidno:5)的比对的图。
图19a、19b和19c是示出在包含木糖异构酶、木酮糖激酶和糖转运蛋白gxs1的菌株中的木糖使用(图19a)、葡萄糖使用(图19b)和制备的木糖醇百分比(图19c)的图。wt是野生型；isohisxylb“7-7”含有木糖异构酶和xylb序列，36-2、36-9和36-16是含有gxs1、木糖异构酶和xylb序列(木酮糖激酶)的转化体。
图20a和20b是示出在木糖(菱形)和木酮糖(正方形)情况下，温度孵育对来自t18(图20a)和大肠杆菌(图20b)的异构酶活性的影响的图。
图21a和21b是示出在木糖(菱形)和木酮糖(正方形)情况下，来自t18(图21a)和大肠杆菌(图21b)的异构酶的剂量依赖性的图。
图22a和22b是示出用木糖异构酶(“16”(正方形)，“b”(x)和“6”(十字形))工程化的t18b菌株中的木糖使用(图22a)和降低的木糖醇产生(图22b)的图。图22c(木糖)和22d(木糖醇产生)示出在4天(灰色)和7天(黑色)时相对于野生型(菱形)表示的相同数据。
图23a和23b是示出用木糖异构酶“16”工程化的t18b菌株(正方形)和工程化为表达木糖异构酶和木酮糖激酶“7-7”(x)和“7-3”(三角形)的菌株中的木糖使用和木糖醇产生降低的图。图23c(木糖)和23d(木糖醇产生)示出在9天(灰色)和11天(黑色)时相对于野生型(菱形)的相同数据。
图24是示出工程化以在发酵中表达木糖异构酶和木酮糖激酶“7-7”的t18b菌株中提高的木糖使用和降低的木糖醇产生的图。
野生型菌株由菱形和虚线表示，并且菌株“7-7”由圆圈表示。
图25是示出α-微管蛋白asptx-neo和α-微管蛋白gxs1-neo构建体的示意图。
图26a是用于探测用木糖转运蛋白gxs1工程化的“7-7”t18b菌株内的gxs1基因的dna印迹的图像。图26b是用于探测用木糖转运蛋白asptx工程化的“7-7”t18b菌株内的asptx基因的dna印迹的图像。
图27a是示出用木糖异构酶、木酮糖激酶和gxs1转运蛋白(三角形)或asptx转运蛋白(圆圈)工程化的t18菌株中木糖的使用的图。菌株“7-7”由菱形表示。图27b是3种修饰的菌株中的每一种的木糖醇产生与木糖使用的比率的条形图。图27c是示出相对于菌株“7-7”的木糖使用的条形图。图27d是示出相对于菌株“7-7”制备的木糖醇产生的条形图。
图28是示出野生型(wt)(菱形)、isohis菌株“16”(正方形)、菌株“7-7”(x)和转运蛋白菌株gxs1(星号)以及asptx(三角形)在含有木糖作为唯一碳源的培养基中的生长的图。
图29a是示出在wt(正方形)、菌株“7-7”(三角形)以及转运蛋白菌株gxs1(星号)和asptx(十字形)的生长期间含有葡萄糖和木糖的替代原料中的剩余葡萄糖的图。图29b是示出当wt(正方形)、菌株“7-7”(三角形)以及转运蛋白菌株gxs1(星号)和asptx(十字形)在含有葡萄糖和木糖的替代原料上生长时随时间推移剩余的木糖和产生的木糖醇的图。
发明详述
微生物如破囊壶菌编码木糖代谢所需的基因。然而，微生物的先天代谢途径产生大量的糖醇木糖醇，其被分泌并潜在阻碍微生物的生长(参见图14，wt)。此外，螯合到木糖醇中的碳原子是在此过程(即脂质产生)中转移离开目标产物的原子。在自然界中，存在两种木糖代谢途径，即木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径和木糖异构酶/木酮糖激酶途径(图1)。破囊壶菌具有编码在两种途径中均有活性的蛋白质的基因；然而，当在木糖培养基中生长时，前者途径似乎是占优势的，如由木糖醇的积聚所证明。在其他生物体中，已经显示木糖醇的积聚是由于木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径所需的氧化还原辅因子不平衡所致。由于异构酶/激酶途径不依赖于氧化还原辅因子，所以异构酶基因的过度表达除去木糖转化为木酮糖中的辅因子依赖性。如本文所示，onc-t18的转录组学研究显示其木糖异构酶和推定木酮糖激酶基因大多在葡萄糖饥饿期间表达(图2和图3)；而编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的推定鉴定的基因是组成型表达的。为了在所有生长阶段增加异构酶和激酶的表达，微生物被工程化以包含onc-t18异构酶基因和大肠杆菌木酮糖激酶基因(xylb)，以使得它们处于组成型表达的启动子和终止子(例如α-微管蛋白启动子和终止子)的控制下。任选地，所述基因可处于诱导型启动子和/或终止子的控制下。
所提供的重组微生物经由整合的转基因拷贝的数目展示对目标基因表达的量的控制水平。如下面的实施例所示，携带八(8)个转基因拷贝的重组onc-t18菌株(iso-his#16)展示比具有所述转基因的单个拷贝的菌株(iso-his#6)更高水平的木糖异构酶转录物表达、酶活性和木糖代谢。当iso-his#16被进一步修饰以并入xylb基因时，观察到类似的现象。与单一插入相比，xylb基因的多个拷贝赋予更高的酶活性和木糖代谢生产率。因此，出人意料地是，不仅需要重新创建木糖代谢途径，而且需要用必需转基因的多个拷贝如此做。未预料到破囊壶菌基因组可容纳多个转基因拷贝并保持活力；因此，出人意料在转化体菌株中观察到表达水平的这种变化。然而，如本文所提供，可通过在具有针对特定途径(例如，木糖途径)的代谢工程化优化的特定表达水平“定制”的转基因拷贝数的转化体菌株之中进行选择来间接地产生允许转基因的受控表达水平的重组微生物。
本文提供编码参与木糖代谢的一种或多种基因的核酸。本申请提供重组微生物、用于制备所述微生物的方法，以及使用能够代谢木糖的微生物产生油的方法。具体地说，本文提供编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸和多肽以用于将微生物修饰为能够代谢木糖和/或在作为唯一碳源的木糖上生长。因此，提供了编码木糖异构酶的核酸。所述核酸序列对于微生物可以是内源的或异源的。木糖异构酶的示例性核酸序列包括但不限于来自梨囊鞭菌属、链球菌属和破囊壶菌的那些。例如，编码木糖异构酶的示例性核酸序列包括但不限于seqidno:2和seqidno:15；并且木糖异构酶的示例性多肽序列包括但不限于seqidno:16。木酮糖激酶的示例性核酸序列包括但不限于来自大肠杆菌、梨囊鞭菌属、酵母属和毕赤酵母属的那些。例如，编码木酮糖激酶的示例性核酸序列包括但不限于seqidno:5、seqidno:17、seqidno:18、seqidno:19和seqidno:20。编码糖转运蛋白(例如木糖转运蛋白)的示例性核酸序列包括但不限于来自曲霉属的那些、gfx1、gxs1和sut1。例如，编码木糖转运蛋白的示例性核酸序列包括但不限于seqidno:21、seqidno:22、seqidno:23和seqidno:24。
如本文所用，核酸是指脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物和互补物。所述术语包括呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。所述术语涵盖含有已知核苷酸类似物或修饰的主链残基或键联的核酸，所述核酸是合成的、天然存在的以及非天然存在的，它们具有与参考核酸相似的结合性质，并且它们以与参考核苷酸相似的方式进行代谢。所述类似物的实例包括但不限于硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、磷酸甲酯、手性磷酸甲酯、2-o-甲基核糖核苷酸、肽-核酸(pna)。除非另外指出，否则可使用核酸序列的保守修饰的变体(例如简并密码子取代)和互补序列来代替本文所述的特定核酸序列。具体地说，简并密码子取代可通过产生其中一个或多个选择的(或所有)密码子的第三位置被混合型碱基和/或脱氧肌苷残基取代的序列来实现(batzer等人,nucleicacidres.19:5081(1991)；ohtsuka等人,j.biol.chem.260:2605-2608(1985)；rossolini等人,mol.cell.probes8:91-98(1994))。术语核酸可与基因、cdna、mrna、寡核苷酸以及多核苷酸互换使用。
当核酸置于与另一个核酸序列的功能关系中时，所述核酸被“可操作地连接”。例如，如果编码前序列或分泌前导序列的dna表达为参与多肽分泌的前蛋白，则所述dna可操作地连接至编码多肽的dna；如果启动子或增强子影响序列的转录，则所述启动子或增强子可操作地连接至编码序列；或如果核糖体结合位点被定位以便于翻译，则所述核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。一般来说，可操作地连接是指所连接的dna序列是彼此邻近的，并且在分泌前导序列的情况下，是连续的并且处于阅读框中。然而，增强子不必是连续的。例如，可操作地连接至第二核酸序列的核酸序列直接或间接地共价连接至所述第二序列，但是任何有效的三维缔合是可以接受的。单一核酸序列可以可操作地连接至多个其他序列。例如，单一启动子可引导多个rna种类的转录。连接可通过连接于适宜的限制位点处来达成。如果所述位点不存在，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
在两个或更多个核酸或多肽序列的背景下，术语相同或同一性百分比是指如使用下文所述的blast或blast2.0序列比较算法与默认参数参数或通过人工比对和目视检查所测量(参见例如，ncbi网站等)，两个或更多个序列或子序列相同或具有指定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸(即，当比较和比对相对于比较窗或指定区的最大对应性时，相对于指定区具有约60％同一性，优选65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高同一性)。此类序列然后被认为是“基本上相同的”。这一定义也指或者可适用于测试序列的补体。所述定义还包括具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的那些序列。如下文所述，优选的算法可对空位等做出解释。优选地，同一性存在于至少约25个氨基酸或核苷酸长度的区域上，或更优选地存在于50-100个氨基酸或核苷酸长度的区域上。
对于序列比较，通常一个序列充当参考序列，测试序列与所述参考序列进行比较。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。优选地，可使用默认程序参数或可指定替代参数。然后序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
如本文所用的比较窗口包括涉及多个连续位置中的任一个区段，所述连续位置选自由20至600、通常约50至约200、更通常约100至约150组成的组，其中在两个序列最佳对比之后，可将一个序列与相同数目的连续位置的参考序列进行比较。比对用于比较的序列的方法是本领域中熟知的。可以例如通过smith和waterman,adv.appl.math.2:482(1981)的局部同源性算法；通过needleman和wunsch,j.mol.biol.48:443(1970)的同源性比对算法；通过pearson和lipman,proc.nat’l.acad.sci.usa85:2444(1988)的相似性搜索方法；通过这些算法(威斯康辛遗传学软件包中的gap、bestfit、fasta和tfasta,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wi)的计算机实现；或通过手动比对和目测检查(参见，例如currentprotocolsinmolecularbiology(ausubel等人编著1995增刊))来进行用于比较的序列的最佳比对。
适合用于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法的优选实例是blast算法和blast2.0算法，其分别描述于altschul等人,nuc.acidsres.25:3389-3402(1977)和altschul等人,j.mol.biol.215:403-410(1990)中。使用blast和blast2.0与本文描述的参数来确定核酸或蛋白质的序列同一性百分比。用于执行blast分析的软件是通过国家生物技术信息中心可公开获得的。这种算法包括首先通过鉴定查询序列中选定长度(w)的短词来鉴定高评分序列对(hsp)，所述短词在与数据库序列中具有相同长度的词比对时匹配或满足某些正值的阈值分数t。t被称为邻近字串分数阈值(altschul等人，同上)。这些初始邻近字串命中充当种子来启动搜索，以寻找含有它们的较长hsp。只要累积比对分值可增加，则字串命中在两个方向上沿每个序列延伸。对于核苷酸序列，使用参数m(一对匹配残基的奖励分数；总是>0)和n(对于错配残基的罚分；总是<0)来计算累积分数。对于氨基酸序列，使用评分矩阵来计算累积分数。当：累积的比对分数从它的最大达到值降低了数量x；由于累积一个或多个负得分的残基比对使累积分数趋于0或0以下；或者到达任一序列的末端时，停止所述字串命中在每个方向上的延伸。blast算法参数w、t、以及x决定比对的灵敏度和速度。期望值(e)表示不同比对的数量，所述比对的分数等于或高于在随机数据库搜索中预期发生的分数。blastn程序(对于核苷酸序列)使用的默认值是字长(w)为11，期望值(e)为10，m＝5，n＝-4并且进行两条链的比较。对于氨基酸序列，blastp程序使用的默认值是字长为3，期望值(e)为10和blosum62评分矩阵(参见henikoff和henikoff,proc.natl.acad.sci.usa89:10915(1989))，比对(b)为50，期望值(e)为10，m＝5，n＝4，以及两条链的比较。
如本文所用的术语多肽通常具有其在本领域公认的具有至少三个氨基酸的聚合物的含义并且意图包括肽和蛋白质。然而，所述术语也用于指特定功能类别的多肽，例如像去饱和酶、延长酶等。对于每个所述类别，本公开提供了所述多肽的已知序列的数个实例。然而，本领域的普通技术人员应了解，术语多肽意图足够普遍地不仅涵盖具有本文中(或在本文所提及的参考资料或数据库中)所列出的完整序列的多肽，而且还涵盖代表所述完整多肽的功能性片段(即保留至少一种活性的片段)的多肽。此外，本领域的普通技术人员了解到，蛋白质序列通常容许在不破坏活性的情况下的一些取代。因此，保留活性并且与相同类别的另一种多肽共有至少约30％-40％总序列同一性、通常大于约50％、60％、70％或80％，并且进一步通常在一个或多个高度保守区中包括至少一个具有更高同一性、通常大于90％或甚至95％、96％、97％、98％或99％的区，通常涵盖至少3-4个并且通常高达20个或更多个氨基酸的任何多肽涵盖在如本文所用的相关术语多肽之内。本领域的技术人员可通过分析本文所描述的各种多肽的序列来确定具有相似性和/或同一性的其他区。正如本领域的技术人员所知，各种策略是已知的，并且用于执行氨基酸或核苷酸序列的比较以便评估同一性和/或相似性程度的工具是可获得的。这些策略包括例如手动比对、计算机辅助的序列比对以及其组合。许多用于执行序列比对的算法(所述算法通常由计算机实施)是可广泛获得的，或可由本领域的技术人员来产生。代表性算法包括例如，smith和waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.,1981,2:482)；needleman和wunsch的同源性比对算法(j.mol.biol.,1970,48:443)；pearson和lipman的搜索相似性的方法(proc.natl.acad.sci.(usa),1988,85:2444)；和/或这些算法的计算机实现(例如，威斯康辛遗传学软件包发布7.0版中的gap、bestfit、fasta和tfasta,geneticscomputergroup,575sciencedr.,madison,wis.)。容易获得的并入此类算法的计算机程序包括例如blastn、blastp、空位blast、pileup、clustalw等。当利用blast和空位blast程序时，可使用相应程序的默认参数。或者，实践者可取决于他的或她的实验要求和/或其他要求而使用非默认参数(参见例如，网址：urlwww.ncbi.nlm.nih.gov)。
如上所述，编码木糖转运蛋白、木酮糖激酶和木糖异构酶的核酸可连接至启动子和/或终止子。启动子和终止子的实例包括但不限于微管蛋白启动子和终止子。作为举例，启动子是微管蛋白启动子，例如α-微管蛋白启动子。任选地，所述启动子与seqidno:25或seqidno:26至少80％相同。任选地，所述终止子是微管蛋白终止子。任选地，所述终止子与seqidno:27、seqidno:28或seqidno:30至少80％相同。
如本文所用，术语启动子、启动子元件和调控序列是指可调控可操作地连接至启动子的所选多核苷酸序列的表达并且影响细胞中的所选多核苷酸序列的表达的多核苷酸。如本文所用的术语破囊壶菌属(thraustochytrium)启动子是指在破囊壶菌属细胞中起作用的启动子。在一些实施方案中，启动子元件是编码序列的位置5'中的非翻译区(utr)或包含编码序列的位置5'中的非翻译区(utr)。5'utr形成mrna转录物的一部分并且因此是真核生物体中蛋白质表达的主要部分。转录之后，5'utr可在转录水平和翻译水平上调控蛋白质表达。
如本文所用，术语终止子是指阻止用于成熟的靶标的表达(例如添加polya尾)的或赋予可操作地连接至细胞中的终止子的所选多核苷酸序列mrna稳定性的多核苷酸。终止子序列可在基因中处于终止密码子的下游。如本文所用的术语破囊壶菌属终止子是指在破囊壶菌属细胞中起作用的终止子。本文还提供了包含编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸序列以及启动子、终止子、选择性标记、2a肽或其任何组合的核酸构建体。作为举例，提供第一核酸构建体，所述第一核酸构建体包含启动子、选择性标记、编码2a肽的核酸序列、编码木糖异构酶的核酸序列和终止子。还提供第二核酸构建体，所述第二核酸构建体包含启动子、选择性标记、编码2a肽的核酸序列、编码木酮糖激酶的核酸序列和终止子。进一步提供第三核酸构建体，所述第三核酸构建体包含启动子、编码木糖转运蛋白的核酸序列、编码2a肽的核酸序列、选择性标记和终止子。这些构建体是示例性的，并且编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸序列可包于在相同或不同启动子控制下的相同构建体上。任选地，编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸序列中的每个是在同一构建体上，并且被2a多肽序列隔开，例如如在seqidno:6中所示。因此，作为举例，核酸构建体可包含微管蛋白启动子、由编码seqidno:6的核酸序列隔开的编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸序列、微管蛋白终止子和选择性标记。任选地，所述选择性标记是ble基因。任选地，所述选择性标记包含seqidno:29。
如本文所用的短语选择性标记是指编码允许选择的产物(多肽)的核苷酸序列(例如基因)，或基因产物(例如多肽)本身。术语选择性标记在本文中是如同本领域中对其普遍理解的那样来使用，并且是指在细胞或生物体内的存在可在某些限定的培养条件(选择性条件)下赋予所述细胞或生物体显著的生长或存活优势或劣势的标记。例如，所述条件可以是存在或不存在特定化合物或特定环境条件，如增加的温度、增加的辐射、在无标记时存在毒性化合物等。存在或不存在这样一种或多种化合物或一种或多种环境条件被称为选择性条件或多个选择性条件。“生长优势”是指相对于另外的相同细胞或生物体活力增强(例如具有生长优势的细胞或生物体相对于另外的相同细胞，平均具有增加的寿命)、增殖速率(在本文中也称为生长速率)增加或两者。一般来说，相较于缺乏生长优势的另外的相同细胞群体，具有生长优势的细胞群体将展现较少的死亡或不能存活的细胞和/或较大的细胞增殖速率。尽管通常选择性标记将赋予细胞生长优势，但是某些选择性标记赋予细胞生长劣势，例如它们使细胞对某些化合物或环境条件的有害效应比不表达标记的另外的相同细胞更加敏感。抗生素抗性标记是一类能够用于选择表达标记的细胞的选择性标记的非限制性实例。在适当浓度的抗生素(选择性条件)存在下，这样的标记赋予表达标记的细胞生长优势。因此，表达抗生素抗性标记的细胞能够在抗生素存在下存活和/或增殖，而不表达抗生素抗性标记的细胞不能在抗生素存在下存活和/或无法增殖。
选择性标记的实例包括常见的细菌抗生素，如但不限于氨苄青霉素、卡那霉素和氯霉素，以及已知的在微藻类中起作用的选择性化合物；实例包括rrns和aada(氨基糖苷类3'-腺苷酰转移酶)，rrns和aada可从大肠杆菌质粒r538-1中分离出来，并且在大肠杆菌和一些微藻类中分别赋予对壮观霉素和链霉素的抗性(hollingshead和vapnek,plasmid13:17-30,1985；meslet-cladière和vallon,eukaryotcell.10(12):1670-82011)。另一个实例是赋予对红霉素的抗性的23srna蛋白rrnl(newman,boynton等人,genetics,126:875–8881990；roffey,golbeck等人,proc.natlacad.sci.usa,88:9122–91261991)。另一个实例是ble，其是赋予对博来霉素的抗性的从印度斯坦链异壁菌(streptoalloteichushindustanus)中分离的富含gc的基因(stevens,purton等人,mol.gen.genet.,251:23-301996)。aph7是又一个实例，其是赋予对潮霉素b的抗性的吸水链霉菌来源的氨基糖苷磷酸转移酶基因(berthold,schmitt等人,protist153(4):401-4122002)。另外的实例包括：aphviii，一种在大肠杆菌和一些微藻类中赋予巴龙霉素抗性的龟裂链霉菌来源的viii型氨基糖苷3'-磷酸转移酶(sizova,lapina等人,gene181(1-2):13-181996；sizova,fuhrmann等人,gene277(1-2):221-2292001)；nat和sat-1，其编码来自诺尔斯氏链霉菌的诺尔丝菌素乙酰转移酶和来自大肠杆菌的链霉素乙酰转移酶，其赋予对诺尔丝菌素的抗性(zaslavskaia,lippmeier等人,journalofphycology36(2):379-386,2000)；neo，一种氨基糖苷3'-磷酸转移酶，其赋予对氨基糖苷的抗性；卡那霉素、新霉素和类似物g418(hasnain,manavathu等人,molecularandcellularbiology5(12):3647-3650,1985)；以及cry1，一种赋予对吐根碱的抗性的核糖体蛋白s14(nelson,savereide等人,molecularandcellularbiology14(6):4011-4019,1994)。
其他选择性标记包括营养标记，也被称为自养标记或营养缺陷标记。这些包括基于光合生物体内的光合活性的恢复而施加选择的光能自养标记。光合自养标记包括但不限于，atpb、tsca、petb、nifh、psaa和psab(boynton,gillham等人,science240(4858):1534-15381988；goldschmidt-clermont,nucleicacidsresearch19(15):4083-4089,1991；kindle,richards等人,pnas,88(5):1721-1725,1991；redding,macmillan等人,emboj17(1):50-60,1998；cheng,day等人,biochemicalandbiophysicalresearchcommunications329(3):966-975,2005)。替代或另外的营养标记包括arg7，其编码精氨基琥珀酸裂解酶，这是精氨酸生物合成中的关键步骤(debuchy,purton等人,emboj8(10):2803-2809,1989)；nit1，其编码氮代谢所必需的硝酸还原酶(fernández,schnell等人,pnas,86(17):6449-6453,1989)；thi10，其是硫胺素生物合成所必需的(ferris,genetics141(2):543-549,1995)；以及nic1，其催化烟酰胺生物合成中的重要步骤(ferris,genetics141(2):543-549,1995)。所述标记通常是在生物合成途径中起作用以产生细胞生长或存活所需的化合物的酶。一般来说，在非选择性条件下，所需化合物存在于环境中或通过替代途径在细胞中产生。在选择性条件下，需要其中涉及标记的生物合成途径起作用以产生化合物。
如本文所用的短语选择剂是指可对细胞或细胞群体引入选择性压力以有利于或对抗携带选择性标记的细胞或细胞群体的试剂。例如，选择剂是抗生素并且选择性标记是抗生素抗性基因。任选地，博来霉素被用作选择剂。
可用所提供的编码参与木糖代谢的基因的核酸和含有所述核酸的核酸构建体转化的合适的微生物包括但不限于藻类(例如，微藻类)、真菌(包括酵母)、细菌或原生生物。任选地，所述微生物包括破囊壶菌目(orderthraustochytriales)的破囊壶菌(thraustochytrids)，更具体地说，破囊壶菌属(genusthraustochytrium)的破囊壶菌目(thraustochytriales)。任选地，所述微生物群体包括如美国专利号5,340,594和5,340,742中所描述的破囊壶菌目(thraustochytriales)，所述专利以引用的方式整体并入本文。所述微生物可以是破囊壶菌(thraustochytrium)种，诸如美国专利号8,163,515中所描述的以atcc登录号pta-6245(即，onc-t18)保藏的破囊壶菌(thraustochytrium)种，所述专利以引用的方式整体并入本文。因此，所述微生物可具有与seqidno:1至少95％、96％、97％、98％、99％、99.1％、99.2％、99.3％、99.4％、99.5％、99.6％、99.7％、99.8％、99.9％或更高(例如，包括100％)相同的18srrna序列。
在本领域中，微藻类被公认为代表多样化的一组生物体。出于本文件的目的，术语微藻类将被用来描述来源于水环境和/或陆地环境(一些蓝藻细菌是居住在陆地/土壤)的单细胞微生物。水环境从海洋环境延伸至淡水湖和河流，并且还包括含盐的环境如江口和河口。微藻类可以是光合作用的；任选地，微藻类是异养的。微藻类可具有真核生物性质或具有原核生物性质。微藻类可以是非运动性的或运动性的。
如本文所用的术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目的任何成员，其包括破囊壶菌科。被描述为破囊壶菌的菌株包括以下生物体：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(种类：属种，阿迪门多(arudimentale)、金黄色(aureum)、碧席考拉(benthicola)、格罗波(globosum)、金尼(kinnei)、动孢(motivum)、多基底增殖(multirudimentale)、厚皮(pachydermum)、普罗弗(proliferum)、罗斯(roseum)、斯托特(striatum))、吾肯氏壶菌属(ulkenia)(种类：属种，埃摩拜迪(amoeboidea)、科格尼斯(kerguelensis)、米钮塔(minuta)、普罗弗达(profunda)、雷迪安(radiate)、塞仑(sailens)、赛卡瑞那(sarkariana)、斯佐凯(schizochytrops)、维格斯(visurgensis)、优克尼斯(yorkensis))、裂殖壶菌属(schizochytrium)(种类：属种，黄金石斛(aggregatum)、黎姆萘瑟(limnaceum)、芒格(mangrovei)、迷你藻(minutum)、欧托(octosporum))、日本壶菌属(japonochytrium)(种类：属种，麦尼(marinum))、不动壶菌属(aplanochytrium)(种类：属种，海罗迪(haliotidis)、科格仑斯(kerguelensisi)、普罗弗达(profunda)、斯托凯
如本文所用的术语转化是指将外源或异源核酸分子(例如载体或重组核酸分子)引入到接受细胞或微生物中的方法。外源或异源核酸分子可以或可以不被整合到(即共价连接至)构成宿主细胞或微生物的基因组的染色体dna中。例如，外源或异源多核苷酸可维持在附加型元件(如质粒)上。或者或另外，外源或异源多核苷酸可变得整合到染色体中以使得其通过染色体复制由子代细胞遗传。用于转化的方法包括但不限于磷酸钙沉淀；ca2+处理；接受细胞与含有重组核酸的细菌原生质体融合；用含有重组核酸的脂质体处理接受细胞；deae葡聚糖；使用聚乙二醇(peg)进行的融合；电穿孔；磁穿孔(magnetoporation)；生物射弹递送；逆转录病毒感染；脂转染；以及直接将dna微量注射到细胞中。
如对于细胞所使用的术语转化的是指已对细胞进行如本文所述的转化，以使得所述细胞携带外源或异源遗传物质(例如重组核酸)。术语转化的也可以或可替代地用于指含有外源或异源遗传物质的微生物、微生物菌株、组织、生物体等。
如本文对于将核酸引入到细胞或生物体中所用的术语引入意图具有其最广泛的含义并且涵盖例如通过转化方法(例如氯化钙介导的转化、电穿孔、粒子轰击)引入，并且还涵盖通过包括转导、缀合和交配的其他方法引入。任选地，利用载体来将核酸引入到细胞或生物体中。
在本文所描述的方法中使用的所述微生物可产生多种脂质化合物。如本文所用，术语脂质包括磷脂、游离脂肪酸、脂肪酸的酯、三酰基甘油、固醇和固醇酯、类胡萝卜素、叶黄素(例如，含氧类胡萝卜素(oxycarotenoids))、碳氢化合物以及本领域的普通技术人员已知的其他脂质。任选地，所述脂质化合物包括不饱和脂质。所述不饱和脂质可包括多不饱和脂质(即，含有至少2个不饱和碳-碳键(例如，双键)的脂质)或高度不饱和脂质(即，含有4个或更多个不饱和碳-碳键的脂质)。不饱和脂质的实例包括ω-3和/或ω-6多不饱和脂肪酸，诸如二十二碳六烯酸(即，dha)、二十碳五烯酸(即，epa)以及其他天然存在的不饱和、多不饱和以及高度不饱和化合物。
本文提供经工程化以表达用于代谢c5碳糖(如木糖)的多肽的重组微生物。具体地说，提供一种重组微生物，其具有编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝，其中所述编码木糖异构酶的核酸是外源核酸。任选地，所述重组微生物包含编码木糖异构酶的核酸序列的两个或更多个拷贝。任选地，所述重组微生物还含有编码木糖异构酶的内源核酸序列的一个或两个拷贝。举例来说，所述重组微生物可含有编码木糖异构酶的内源核酸序列的一个或两个拷贝和编码木糖异构酶的外源核酸序列的一个拷贝。任选地，所述重组微生物包含编码木糖异构酶的核酸序列的三个拷贝，一个是外源引入的并且另外两个是内源的。当关于细胞、核酸、多肽、载体等使用时，术语重组表示所述细胞、核酸、多肽、载体等已经通过实验室方法进行了修饰或是实验室方法的结果并且是非天然存在的。因此，例如，重组微生物包括通过实验室方法(例如用于将核酸引入到微生物中的转化方法)产生或修饰的微生物。重组微生物可包含在所述微生物的天然(非重组)形式中不存在的核酸序列，或者可包含已被修饰(例如与非天然启动子连接)的核酸序列。
如本文所用，术语外源的是指人工引入到细胞或生物体中和/或不天然存在于它所存在的细胞中的物质，如核酸(例如，包含调控序列和/或基因的核酸)或多肽。换言之，诸如核酸或多肽的物质来源于其所引入的细胞或生物体的外部。外源核酸可具有与天然存在于细胞中的核酸相同的核苷酸序列。例如，破囊壶菌细胞可被工程化以包含具有破囊壶菌或破囊壶菌属调控序列的核酸。在具体实例中，内源破囊壶菌或破囊壶菌属调控序列可操作地连接至在天然条件下不涉及调控序列的基因。尽管破囊壶菌或破囊壶菌属调控序列可天然地存在于宿主细胞中，但根据本公开所引入的核酸是外源的。外源核酸可具有不同于天然存在于细胞中的任何核酸的核苷酸序列。例如，外源核酸可以是异源核酸，即来自不同物种或生物体的核酸。因此，外源核酸可具有与天然存在于源生物体中的核酸相同的核酸序列，但是所述源生物体不同于将外源核酸引入到其中的细胞。如本文所用，术语内源的是指为细胞所天然具有的核酸序列。如本文所用，术语异源的是指不为细胞所天然具有，即来自与细胞不同的生物体的核酸序列。术语外源和内源或异源不是相互排斥的。因此，核酸序列可以是外源的和内源的，这意味着核酸序列可被引入到细胞中，但是具有与天然存在于细胞中的核酸的序列相同或相似的序列。类似地，核酸序列可以是外源的和异源的，这意味着核酸序列可被引入到细胞中，但是具有不为细胞所天然具有的序列，例如来自不同生物体的序列。
如上所述，所提供的重组微生物含有编码木糖异构酶的核酸序列的至少两个拷贝。所提供的微生物任选地还含有至少一个编码木酮糖激酶的核酸序列。任选地，所述重组微生物包含至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。编码木糖异构酶、木酮糖激酶和/或木糖转运蛋白的核酸序列任选地是外源核酸序列。任选地，编码木糖异构酶的核酸序列是内源核酸序列。任选地，编码木酮糖激酶和/或木糖转运蛋白的核酸序列是异源核酸。任选地，所述微生物含有编码木糖异构酶的核酸序列的至少两个拷贝、编码木酮糖激酶的核酸序列的至少两个拷贝和至少一个编码木糖转运蛋白的核酸序列。任选地，编码木糖异构酶的异源核酸序列与seqidno:2至少90％相同。任选地，编码木酮糖激酶的异源核酸序列与seqidno:5至少90％相同。如上所述，任选地，编码木糖转运蛋白的核酸是异源核酸。任选地，由异源核酸编码的木糖转运蛋白是来自中间假丝酵母(candidaintermedia)的gxs1。任选地，编码木糖转运蛋白的异源核酸序列与seqidno:23至少90％相同。
所提供的重组微生物不仅含有编码参与木糖代谢的基因的核酸序列，而且它们可包含此类序列的多个拷贝。因此，所述微生物包含编码木糖异构酶的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。任选地，所述微生物包含编码木酮糖激酶的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。任选地，所述微生物包含编码木糖转运蛋白的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。
在所提供的微生物中，核酸(例如木糖异构酶、木酮糖激酶或木糖转运蛋白)可以可操作地连接至启动子和/或终止子。任选地，编码木糖异构酶的外源核酸序列可操作地连接至启动子。任选地，编码木酮糖激酶的核酸序列和/或编码木糖转运蛋白的核酸序列也可操作地连接至启动子。任选地，所述启动子是微管蛋白启动子。任选地，所述启动子与seqidno:25或seqidno:26至少80％相同。任选地，编码木糖异构酶的外源核酸序列包含终止子。任选地，编码木酮糖激酶的核酸序列包含终止子。任选地，编码木糖转运蛋白的核酸序列包含终止子。任选地，所述终止子是微管蛋白终止子。任选地，所述终止子与seqidno:27、seqidno:28或seqidno:30至少80％相同。
所提供的微生物可包含选择性标记以确认目标基因的转化。因此，所述微生物还可包含选择性标记。任选地，所述选择性标记是抗生素抗性基因。任选地，所述抗生素是博莱霉素、潮霉素b、卡那霉素或新霉素。任选地，所述微生物是破囊壶菌属或裂殖壶菌属微生物。任选地，所述微生物是onc-t18。
所提供的微生物具有相对于野生型微生物的显著特征。例如，所述重组微生物可具有与非重组对照(或野生型)微生物相比增加的木糖转运活性、与非重组对照(或野生型)微生物相比增加的木糖异构酶活性、与非重组对照(或野生型)微生物相比增加的木酮糖激酶活性、或这些活性的任何组合。任选地，所述重组微生物以木糖作为唯一碳源生长。
还提供了制备所述重组微生物的方法。因此，提供一种制备重组木糖代谢微生物的方法，所述方法包括提供一种或多种核酸构建体，所述核酸构建体包含编码木糖异构酶的核酸序列、编码木酮糖激酶的核酸序列和编码木糖转运蛋白的核酸序列；用所述一种或多种核酸构建体转化所述微生物；以及分离出包含编码所述木糖异构酶的核酸序列的至少两个或更多个拷贝的微生物。任选地，所述方法还包括分离出包含编码所述木酮糖激酶的核酸序列的至少两个拷贝的微生物。任选地，所述方法包括分离出包含木糖转运蛋白的至少一个拷贝的微生物。任选地，所述一种或多种核酸构建体还包含选择性标记。
在所提供的方法中，编码木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的核酸序列可位于相同或不同的构建体上。任选地，所述方法包括提供包含编码木糖异构酶的核酸序列的第一核酸构建体、包含编码木酮糖激酶的核酸序列的第二核酸构建体和包含编码木糖转运蛋白的核酸序列的第三核酸构建体。任选地，所述第一、第二和第三核酸构建体包含相同的选择性标记。任选地，所述第一核酸构建体包含启动子、选择性标记、编码2a肽的核酸序列、编码木糖异构酶的核酸序列和终止子。任选地，所述第二核酸构建体包含启动子、选择性标记、编码2a肽的核酸序列、编码木酮糖激酶的核酸序列和终止子。任选地，所述第三核酸构建体包含启动子、编码木糖转运蛋白的核酸序列、编码2a肽的核酸序列、选择性标记和终止子。如上所述，选择性标记包括但不限于抗生素抗性基因。任选地，所述抗生素是博莱霉素、潮霉素b、卡那霉素或新霉素。用于构建体的启动子包括但不限于微管蛋白启动子。任选地，所述启动子与seqidno:25或seqidno:26至少80％相同。用于构建体的终止子包括但不限于微管蛋白终止子。任选地，所述终止子与seqidno:27、seqidno:28或seqidno:30至少80％相同。
在所提供的方法中，所述分离的重组微生物可包含木糖异构酶、木酮糖激酶和木糖转运蛋白的一个或多个拷贝。任选地，所述分离的重组微生物包含编码木糖异构酶的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。任选地，所述木糖异构酶是内源木糖异构酶或异源木糖异构酶。任选地，编码木糖异构酶的核酸序列与seqidno:2至少90％相同。任选地，所述分离的重组微生物包含编码木酮糖激酶的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。任选地，所述木酮糖激酶是异源木酮糖激酶。任选地，编码木酮糖激酶的核酸序列与seqidno:5至少90％相同。任选地，所述分离的重组微生物包含编码木糖转运蛋白的核酸序列的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40个拷贝。任选地，所述木糖转运蛋白是异源木糖转运蛋白。任选地，所述木糖转运蛋白是来自中间假丝酵母的gxs1。任选地，编码木糖转运蛋白的核酸序列与seqidno:23至少90％相同。任选地，所述微生物是破囊壶菌属或裂殖壶菌属微生物。任选地，所述微生物是onc-t18。
如上所述，所述分离的重组微生物可具有与对照非重组微生物相比增加的木糖转运活性、与对照非重组微生物相比增加的木糖异构酶活性、与对照非重组微生物相比增加的木酮糖激酶活性或其任何组合。任选地，所述分离的重组微生物以木糖作为唯一碳源生长。
如本文所述，对照或标准对照是指充当参考(通常是已知参考)以用于与测试样品、测量或值进行比较的样品、测量值或值。例如，可将测试微生物(例如用编码用于代谢木糖的基因的核酸序列转化的微生物)与已知的正常(野生型)微生物(例如标准对照微生物)进行比较。标准对照也可代表从微生物群体(例如，标准对照微生物)收集的平均测量值或值，所述微生物群体在作为唯一碳源的木糖上不生长或生长不良或者不具有木糖异构酶活性、木酮糖激酶活性和/或木糖转运活性或具有最低水平的木糖异构酶活性、木酮糖激酶活性和/或木糖转运活性。技术人员将认识到，可设计标准对照以用于评估任何数量的参数(例如，rna水平、多肽水平、特定细胞类型等)。
本文还提供了使用重组微生物产生油的方法。所述方法包括提供重组微生物，其中所述微生物在作为唯一碳源的木糖上生长，以及在合适的条件下在培养基中培养所述微生物以产生所述油。任选地，所述油包含甘油三酯。任选地，所述油包含α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸或其组合。任选地，所述方法还包括分离出所述油。
所提供的方法包括根据本领域中已知的方法培养微生物的附加步骤或者可与所述附加步骤结合使用。例如，破囊壶菌(例如，破囊壶菌属)可根据美国专利公布2009/0117194或2012/0244584中所描述的方法进行培养，关于所述方法的每个步骤或其中使用的组合物，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
微生物在生长培养基(medium)(也称为培养基(culturemedium))中生长。多种培养基中的任一种可适用于培养本文所描述的微生物。任选地，所述培养基为所述微生物供给各种营养组分，包括碳源和氮源。用于破囊壶菌培养物的培养基可包含多种碳源中的任一种。碳源的实例包括脂肪酸、脂质、甘油、三甘油、碳水化合物、多元醇、氨基糖以及任一种生物质或废物流。脂肪酸包括，例如，油酸。碳水化合物包括但不限于葡萄糖、纤维素、半纤维素、果糖、右旋糖、木糖、乳果糖、半乳糖、麦芽三糖、麦芽糖、乳糖、糖原、明胶、淀粉(玉米或小麦)、乙酸盐、m-肌醇(例如，源自玉米浆)、半乳糖醛酸(例如，源自果胶)、l-岩藻糖(例如，源自半乳糖)、龙胆二糖、葡糖胺、α-d-葡萄糖-1-磷酸(例如，源自葡萄糖)、纤维二糖、糊精、α-环糊精(例如，源自淀粉)以及蔗糖(例如，来自糖蜜)。多元醇包括但不限于麦芽糖醇、赤藓糖醇以及阿东糖醇。氨基糖包括但不限于n-乙酰基-d-半乳糖胺、n-乙酰基-d-葡糖胺以及n-乙酰基-β-d-甘露糖胺。
任选地，本文所提供的微生物在增加生物质和/或目标化合物(例如，油或总脂肪酸(tfa)含量)的产生的条件下进行培养。例如，破囊壶菌通常在盐水培养基中培养。任选地，破囊壶菌可在具有约0.5g/l至约50.0g/l的盐浓度的培养基中培养。任选地，破囊壶菌在具有约0.5g/l至约35g/l(例如，约18g/l至约35g/l)的盐浓度的培养基中培养。任选地，本文所描述的破囊壶菌可在低盐条件下生长。例如，破囊壶菌可在具有约0.5g/l至约20g/l(例如，约0.5g/l至约15g/l)的盐浓度的培养基中培养。所述培养基任选地包含nacl。任选地，所述培养基包含天然或人造海盐和/或人造海水。
所述培养基可包含含非氯化物的钠盐作为钠源。适用于根据本发明方法的非氯化物钠盐的实例包括但不限于苏打灰(碳酸钠和氧化钠的混合物)、碳酸钠、碳酸氢钠、硫酸钠以及其混合物。参见，例如，美国专利号5,340,742和6,607,900，所述专利各自的全部内容以引用的方式并入本文。例如，总钠的很大一部分可由非氯化物盐供给，以使得培养基中的总钠的小于约100％、75％、50％或25％由氯化钠供给。
破囊壶菌培养物的培养基可包含多种氮源中的任一种。示例性氮源包括铵溶液(例如，nh4的h2o溶液)、铵盐或胺盐(例如，(nh4)2so4、(nh4)3po4、nh4no3、nh4ooch2ch3(nh4ac))、蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物、麦芽提取物、鱼粉、谷氨酸钠、大豆提取物、酪蛋白氨基酸以及酒糟。氮源在合适的培养基中的浓度通常在约1g/l与约25g/l之间且包括约1g/l和约25g/l的范围内。
所述培养基任选地包含磷酸盐，诸如磷酸钾或磷酸钠。培养基中的无机盐和微量营养物质可包括硫酸铵、碳酸氢钠、原钒酸钠、铬酸钾、钼酸钠、亚硒酸、硫酸镍、硫酸铜、硫酸锌、氯化钴、氯化铁、氯化锰、氯化钙以及edta。可包括维生素，如吡哆醇盐酸盐、盐酸硫胺素、泛酸钙、对氨基苯甲酸、核黄素、烟酸、生物素、叶酸和维生素b12。
在适当时，可使用酸或碱和/或使用氮源将培养基的ph调整至介于3.0与10.0之间且包括3.0和10.0。任选地，可对所述培养基进行灭菌。
通常用于培养微生物的培养基是液体培养基。然而，用于培养微生物的培养基可以是固体培养基。除如本文所讨论的碳源和氮源之外，固体培养基可含有提供结构支撑并且/或者允许所述培养基呈固体形式的一种或多种组分(例如，琼脂或琼脂糖)。
任选地，对所得的生物质进行巴氏灭菌，以使存在于生物质中的不合需要的物质失活。例如，可对生物质进行巴氏灭菌，以使降解化合物的物质失活。生物质可存在于发酵培养基中，或者从发酵培养基中分离用于巴氏灭菌步骤。巴氏灭菌步骤可通过将生物质和/或发酵培养基加热至高温来进行。例如，可将生物质和/或发酵培养基加热至约50℃至约95℃(例如，约55℃至约90℃或约65℃至约80℃)的温度。任选地，可将生物质和/或发酵培养基加热约30分钟至约120分钟(例如，约45分钟至约90分钟，或约55分钟至约75分钟)。可使用合适的加热手段来进行巴氏灭菌，例如像通过直接蒸汽注入。
任选地，不执行巴氏灭菌步骤。换言之，本文教导的方法任选地缺乏巴氏杀菌步骤。
任选地，可根据各种方法收获生物质，包括本领域的技术人员当前已知的那些方法。例如，可使用例如离心(例如，用固体喷射离心机)或过滤(例如交叉流过滤)来从发酵培养基收集生物质。任选地，收获步骤包括使用用于加速收集细胞生物质的沉淀剂(例如磷酸钠或氯化钙)。
任选地，用水洗涤生物质。任选地，可将生物质浓缩至约20％固体。例如，可将生物质浓缩至约5％至约20％固体、约7.5％至约15％固体或约固体至约20％固体，或所列范围内的任何百分比。任选地，可将生物质浓缩至约20％固体或更少、约19％固体或更少、约18％固体或更少、约17％固体或更少、约16％固体或更少、约15％固体或更少、约14％固体或更少、约13％固体或更少、约12％固体或更少、约11％固体或更少、约10％固体或更少、约9％固体或更少、约8％固体或更少、约7％固体或更少、约6％固体或更少、约5％固体或更少、约4％固体或更少、约3％固体或更少、约2％固体或更少或约1％固体或更少。
所提供的方法任选地包括从生物质或微生物中分离出多不饱和脂肪酸。可使用各种方法中的一种或多种来进行多不饱和脂肪酸的分离，包括本领域的技术人员当前已知的那些方法。例如，分离多不饱和脂肪酸的方法在美国专利号8,163,515中进行了描述，所述专利以引用的方式整体并入本文。任选地，在分离多不饱和脂肪酸之前，不对培养基进行灭菌。任选地，灭菌包括增加温度。任选地，由微生物产生并且通过所提供的方法分离的多不饱和脂肪酸是中链脂肪酸。任选地，所述一种或多种多不饱和脂肪酸选自由以下各项组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸以及其组合。
包含根据本文所述的方法产生的多不饱和脂肪酸(pufa)和其他脂质的油可用于利用其生物学、营养学或化学特性的各种应用中的任一种。因此，所提供的方法任选地包括从阈值体积的收获部分中分离出油。任选地，所述油用于产生燃料，例如生物燃料。任选地，所述油可用于药物、食物补充剂、动物饲料添加剂、化妆品等中。根据本文所描述的方法所产生的脂质还可用作在产生其他化合物中的中间体。
举例来说，由使用所提供的方法培养的微生物产生的油可包含脂肪酸。任选地，所述脂肪酸选自由以下各项组成的组：α亚麻酸、花生四烯酸、二十二碳六烯酸、二十二碳五烯酸、二十碳五烯酸、γ-亚麻酸、亚油酸、亚麻酸以及其组合。任选地，所述油包含甘油三酯。任选地，所述油包含选自由以下各项组成的组的脂肪酸：棕榈酸(c16:0)、肉豆蔻酸(c14:0)、棕榈油酸(c16:1(n-7))、顺式-十八碳烯酸(c18:1(n-7))、二十二碳五烯酸(c22:5(n-6))、二十二碳六烯酸(c22:6(n-3))以及其组合。
任选地，可将根据本文所描述的方法产生的脂质并入到最终产品(例如，食物或饲料补充剂、婴儿配方食品、药物、燃料等)中。其中可并入脂质的合适的食物或饲料补充剂包括饮品诸如牛奶、水、运动饮料、能量饮料、茶、以及果汁；甜食诸如糖果、果冻和饼干；含脂肪的食物和饮品诸如乳制品；经加工的食物产品诸如软米(或粥)；婴儿配方食品；早餐谷物等。任选地，可将一种或多种所产生的脂质并入到膳食补充剂，例如像维生素或复合维生素中。任选地，根据本文所描述的方法产生的脂质可包含在膳食补充剂中，并且任选地可直接并入到食物或饲料(例如，食物补充剂)的组分中。
可将通过本文所描述的方法产生的脂质并入到其中的饲料的实例包括宠物食物，诸如猫食；狗食；用于水族箱鱼、养殖鱼或甲壳类动物等的饲料；用于农场饲养动物(包括牲畜和水产养殖的鱼类或甲壳类动物)的饲料。可将根据本文所描述的方法产生的脂质并入到其中的食物或饲料材料优选地对于作为预期接受者的生物是可口的。这种食物或饲料材料可具有对于食物材料当前已知的任何物理性质(例如固体、液体、柔软的)。
任选地，可将所产生的化合物(例如，pufa)中的一种或多种并入到营养食品或药物产品中。此类药物的实例包括各种类型的片剂、胶囊、可饮用剂等。任选地，所述营养食品或药物适于局部施用。剂型可包括例如，胶囊、油、颗粒剂、浓缩细粒剂(granulasubtilae)、散剂(pulveres)、片剂、丸剂、锭剂等。
可将根据本文所描述的方法产生的油或脂质与多种其他剂中的任一种组合并入到本文所描述的产品中。例如，此类化合物可与一种或多种粘合剂或填充剂、螯合剂、色素、盐、表面活性剂、保湿剂、粘度调节剂、增稠剂、软化剂、芳香剂、防腐剂等或其任何组合进行组合。
公开了材料、组合物以及组分，所述材料、组合物以及组分可用于所公开的方法和组合物、可与所公开的方法和组合物结合使用、可用于制备所公开的组合物，或者是所公开的方法和组合物的产品。本文公开了这些和其他材料，并且应了解当公开这些材料的组合、子集、相互作用、群组等时，虽然可未明确公开这些化合物的每个不同个别和共同组合以及排列的特定提及，但是其各自在本文中具体地涵盖和描述。例如，如果公开并讨论了方法并且讨论了可对包括所述方法的多个分子进行的多种修改，除非明确地相反指示，否则明确涵盖了所述方法的每一种组合和排列以及可能的修改。同样地，也具体地涵盖并公开了这些分子的任何子集或组合。这个概念适用于本公开的所有方面，包括但不限于使用所公开的组合物的方法中的步骤。因此，如果存在可进行的多个附加步骤，则应理解，这些附加步骤中的每一个可与所公开的方法的方法步骤的任何具体方法步骤或组合一起进行，并且每种此类组合或组合的子集都具体地涵盖并应视为得到公开。
本文所引用的出版物以及引用这些出版物所涉及到的材料特此以引用的方式明确地整体并入。
以下实施例意图进一步说明本文所描述的方法和组合物的某些方面，并且不意图限制权利要求书的范围。
实施例
实施例1.通过重组破囊壶菌进行的c5碳代谢
在自然界中，存在两种木糖代谢途径，即木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径和木糖异构酶/木酮糖激酶途径(图1)。onc-t18编码来自两种途径的基因，并且如上所述，木糖还原酶/木糖醇脱氢酶途径是占优势的，如在木糖培养基中生长时木糖醇的积累所证明。由于异构酶/激酶途径不依赖于氧化还原辅因子，所以onc-t18的异构酶基因的过度表达除去木糖转化为木酮糖中的辅因子依赖性。如在图2和3中所示，使用onc-t18的转录组学研究显示其木糖异构酶和推定木酮糖激酶基因大多在葡萄糖饥饿期间表达；而编码木糖还原酶和木糖醇脱氢酶的推定鉴定的基因是组成型表达的。
在酵母invsc1中his-标记和过度表达后，将t18异构酶通过金属-亲和色谱法纯化。作为阳性对照，将来自大肠杆菌菌株w3110的his标记的xyla过度表达并从大肠杆菌菌株bl21(de3)plyss中纯化。通过标准的bradford测定来确定纯化的蛋白质的蛋白质浓度。在5mmmgatp、50mmhepes(ph7.4)、10mmmgcl2中使用5μg蛋白质和0.75g/l木糖或木酮糖来测定温度对t18异构酶和大肠杆菌异构酶的活性的影响。将反应物在10℃、25℃、30℃、37℃、50℃、60℃和80℃下孵育过夜。通过在95℃下热灭活5分钟来终止反应。通过hplc对反应进行分析，并且相对于标准曲线从峰下面积确定存在的糖的浓度。在37℃和37℃以上的温度下，t18异构酶在木糖和木酮糖两者上均具有更高活性(图20a)。这与大肠杆菌异构酶相反，大肠杆菌异构酶在25℃与30℃之间的温度下具有更高活性(图20b)。
通过将增加蛋白质浓度的异构酶与0.75g/l木糖或木酮糖在5mmmgatp、50mmhepes(ph7.4)、10mmmgcl2中一起孵育来测定剂量依赖性。将反应物在30℃(大肠杆菌)或50℃(t18)下孵育过夜，然后通过在95℃下热灭活5分钟来停止反应。通过hplc对反应进行分析，并且相对于标准曲线从峰下面积确定存在的糖的浓度。观察到t18异构酶对木糖和木酮糖二者的剂量依赖性(图21a和21b)。
此实施例描述了使用破囊壶菌onc-t18来源的(onc-t18)α-微管蛋白启动子来在破囊壶菌属物种(包括onc-t18)中表达内源和/或异源木糖代谢转基因。但是，正如全文所论述，可使用其他调控要素。图4和5分别示出含有木糖异构酶基因和木酮糖激酶基因的质粒的构建体。如本文所述，木糖代谢转基因存在于宿主基因组内的多个(≥8)拷贝中。在onc-t18的情况下，与野生型(wt)细胞相比，经修饰的生物体表现出增加的木糖代谢。例如，经修饰以表达内源木糖异构酶基因(seqidno:2)的菌株(菌株iso-his#16)以及经修饰以表达内源木糖异构酶基因(seqidno:2)和木酮糖激酶基因(seqidno：5)的菌株(iso-his+xylb，菌株7-7)均使用比wt菌株多40％的木糖。与wt菌株相比，iso-his#16和7-7将更少木糖转化为木糖醇，分别少40％和420％。图4和5中示出用于转化onc-t18的构建体。使用如由biorad的生物射弹pds-1000/he颗粒递送系统(hercules，ca)所描述的标准生物弹射法方案产生了onc-t18转化体。简言之，用2.5μg线性化质粒dna(ecori，37℃，过夜)包覆0.6μm金颗粒。使用所述包覆的金颗粒来轰击先前铺有1ml的od600为1.0的onc-t18细胞的平板。轰击参数包括使用1350或1100psi的氦气压力，目标距离为3cm或6cm。在过夜恢复后，将细胞从平板上洗掉并接种在含有选择抗生素(zeo250μg/ml和hygro400μg/ml)的培养基上。将平板在25℃下孵育1周以鉴定抗性菌落。通过pcr和dna印迹筛选所得到的转化体。
使用标准方案进行dna印迹。简言之，将大约20μg的基因组dna用总体积为50μl的40单位的bamhi限制酶在37℃下消化过夜。使用地高辛(dig)dna分子量标记ii(roche,basel,switzerland)，将7.2μg的每种消化的样品在1.0％琼脂糖凝胶上在50v下运行大约1.5小时。通过将凝胶浸入250mmhcl中15分钟来使dna在凝胶中脱嘌呤。通过在含有0.5mnaoh和1.5mnacl(ph7.5)的溶液中孵育、两次15分钟洗涤来使凝胶进一步变性。然后通过在0.5mtris-hcl(ph7.5)中孵育、两次15分钟洗涤来中和反应物。最后，将凝胶在20x盐水-柠檬酸钠(ssc)缓冲液中平衡15分钟。使用标准转移设备将dna转移至带正电荷的尼龙膜上。使用uvstratalinker在120,000μj的曝光下使dna固定至所述膜。使用pcrdig探针合成试剂盒(roche,basel,switzerland)产生dna印迹探针以根据制造商的说明书产生dig标记的探针。将固定至尼龙膜的dna与20ml的digeasyhyb溶液(digeasyhybgranules,roche,basel,switzerland)预杂交。通过向300μl的ddh2o中加入40μl的ble-探针反应混合物来使dig标记的探针变性，并在99℃下孵育5分钟。然后将所述溶液添加至20mldig杂交溶液中以产生探针溶液。然后将探针溶液添加至dna固定的尼龙膜并在53℃下孵育过夜。第二天，将所述膜在2xssc、0.1％sds中在室温下洗涤两次。将所述膜在0.1xssc、0.1％sds中在68℃下进一步洗涤两次，每次15分钟。为了检测，使用dig洗涤和封闭缓冲液组(roche，basel，switzerland)根据制造商的说明书来洗涤并封闭膜。使用来自dig核酸检测试剂盒(roche,basel,switzerland)的抗dig-ap缀合抗体进行检测。将2μl抗体溶液添加至20ml检测溶液中并与所述膜在室温下孵育30分钟。然后将印迹浸入用所述试剂盒提供的洗涤缓冲液中。cdp-star(roche,basel,switzerland)用于可视化。将10μl的cdp-star溶液在1ml检测溶液中在膜上孵育，将所述膜覆盖在“片材保护”塑料层中以将溶液保持在膜上。立即使用chemidoc成像系统(bioradlaboratories,hercules,ca)检测信号。
将密码子优化的ble基因在t18bα-微管蛋白启动子和终止子元件的控制下进行克隆(图6)。以在表达的蛋白质的n-末端上添加六组氨酸标签(iso-his)的这样一种方式从t18b克隆了异构酶基因。通过在酵母中过度表达和纯化组氨酸标记的蛋白质来证实木糖异构酶的酶活性。通过克隆ble基因下游的基因和2a序列，在α-微管蛋白启动子和终止子的控制下克隆了异构酶基因(以及引入的六组氨酸标签)(图4和图6)。用此质粒(palphtb-b2g-hisiso)进行的t18b的生物射弹转化产生了博莱霉素抗性转化体。从此程序获得了许多转化体菌株。这些菌株中的两个被示为含有转基因的一个拷贝的实施例#6和含有转基因的八个拷贝的实施例#16(图7)。
通过pcr和dna印迹分析证实了iso-his转基因在t18b基因组内的插入(图7)。定性地，这些数据表明在菌株#6中存在转基因的单个拷贝，并且在菌株#16中在单个位点处存在多个多联转基因拷贝。通过基因组dna上的qpcr确定了iso-his转基因插入的确切数量(图8)。这些数据表明在菌株#6中存在转基因的一个拷贝，并且在菌株#16中存在转基因的八个拷贝(图8)。为了测试拷贝数的增加是否与表达水平的增加相关，从wt、iso-his#6和iso-his#16t18b细胞中分离了mrna并进行qrt-pcr。图11示出与含有转基因的单个拷贝的菌株#6相比，在含有转基因的8个拷贝的菌株#16细胞中iso-his转录物的显著增加的表达。在wt细胞中无可检测到的iso-his转录物(图11)。为了评估增加的mrna表达是否与增加的异构酶酶活性相关，从wt、iso-his#6和iso-his#16细胞收获细胞提取物。与菌株#6和wt细胞相比，在菌株#16细胞中观察到增强的异构酶酶活性(图12)。最后，在木糖消减测定(图14)中检查菌株#16代谢木糖的能力，并与wt细胞进行比较。这些烧瓶发酵展示代谢木糖的能力并量化转化为木糖醇的木糖的量。因此，图14示出与wt细胞相比，iso-his菌株#16中木糖代谢的增加以及显著更少的木糖醇产生。
对于烧瓶测定，将细胞在培养基中生长2至3天。将团块在不含糖的培养基2(9g/lnacl、4g/lmgso4、100mg/lcacl2、5mg/lfecl3、20g/l(nh4)2so4、0.86g/lkh2po4、150μg/l维生素b12、30μg/l生物素、6mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l氯化钴(ii)、3mg/l氯化锰)中洗涤两次。然后，将含有20g/l葡萄糖和50g/l木糖的基本培养基用洗涤的细胞接种至0.05的od600。在不同的时间点采集样品，并通过hplc分析上清液中剩余的糖的量。如图22a、22b、22c和22d中所示，在木糖异构酶基因拷贝数增加的情况下，当与wt相比时达40％更多的木糖使用多和木糖醇产生的20％减少。
然后使用iso-his菌株#16作为亲本菌株用于第二轮转化以引入大肠杆菌xylb基因。在潮霉素(hygro)选择下引入此基因。将来自pchlamy_3(2a序列)的hygro基因和t18b密码子优化的w3110大肠杆菌xylb基因在t18bα-微管蛋白启动子和终止子元件的控制下克隆以用于在t18biso-his#16中表达(图5)。通过在酵母中过度表达和纯化组氨酸标记的蛋白质、然后与木糖和木酮糖进行酶反应证实了大肠杆菌木酮糖激酶与t18b异构酶协同作用的体外能力。用xylb质粒(pjb47)对t18biso-his菌株#16进行的生物射弹转化产生hygro和zeo抗性转化体。通过pcr和dna印迹分析证实了hygro-2a-xylb基因在t18b基因组内的插入(图9)。定性地，这些数据表明在菌株#7-3中存在转基因的单个拷贝，并且在菌株#7-7中在单个位点处存在多个多联转基因拷贝。通过基因组dna分离物上的qpcr确定了xylb基因插入的数量(图10)。图10示出菌株7-7中转基因的十六个插入和菌株7-3中的一个拷贝。为了确定转基因的多个拷贝是否在体外赋予增强的木糖代谢，进行了细胞提取物测定并对细胞提取物代谢木糖的能力进行了分析(图13)。通过基于烧瓶的木糖消减测定检查了转化体细胞代谢木糖的能力(图15)。在此实验中，wt细胞消耗最少量的木糖并且制成最多的木糖醇。菌株iso-his#16、7-3和7-7都消耗相似量的木糖；然而，仅7-7(含有xylb转基因的多拷贝)未制成大量木糖醇。最后，在含有葡萄糖和木糖的培养基中的5l发酵容器中对菌株iso-his#16和7-7进行了测试。在七十七(77)小时的发酵过程中，菌株iso-his#16将大约8％的木糖转化为木糖醇，而菌株7-7将大约2％的木糖转化为木糖醇。图16示出在这种发酵中的木糖醇积聚。
对于烧瓶测定，将细胞在培养基中生长2至3天。将团块在不含糖的培养基中洗涤两次。将含有20g/l:50g/l葡萄糖:木糖的培养基用洗涤的细胞接种至0.05的od600。在不同的时间点采集样品，并通过hplc分析上清液中剩余的糖的量。如图23a、23b、23c和23d中所示，当与wt相比时，使用达50％更多的木糖并且在过度表达木糖异构酶和木酮糖激酶两者的菌株中观察到木糖醇的80％减少。
为了进一步分析这些菌株，将所述菌株在并行的5lsartorius发酵罐中生长。初始培养基含有20g/l葡萄糖和50g/l木糖以及其他基础培养基组分。将两种培养物保持在28℃和5.5ph下，在720rpm下恒定混合并且在1lpm的环境空气下恒定曝气。向培养物进料葡萄糖16小时，随后8小时饥饿期。使这种循环完成3次。在饥饿期间，每0.5小时取得10ml样品。通过hplc在这些样品中定量葡萄糖、木糖和木糖醇浓度。定期取得更大的50ml样品以用于进一步生物质和油含量定量。葡萄糖进料速率与葡萄糖消耗速率匹配，葡萄糖消耗速率通过在培养物废气中检测到的co2进行量化。如图24中所示，在这些条件下，7-7菌株比wt使用达52％更多的木糖。
通过dna印迹分析，观察到菌株iso-his#16含有异构酶转基因的八个(8)插入(图8)。这种出人意料的多重插入使得相对于携带单个拷贝(图11)的菌株，异构酶基因表达增加以及异构酶体外活性增加(图12)。与携带异构酶转基因的单个拷贝的菌株相比，菌株iso-his#16展示提高的木糖生产率(图14)。
类似地，在iso-his+xylb转化体中，所述克隆中的一个(iso-his+xylb7-7)也具有xylb基因的多重插入(图10)，这使得细胞内的木糖异构酶和木酮糖激酶两者的体外活性增加(图13)。这种克隆能够使用比亲本菌株iso-his#16同样多或更多的木糖，同时产生显著更少的木糖醇(图15)。此外，在木糖存在下，iso-his+xylb7-7比wt产生更多的生物质。这两种菌株表明，不仅异构酶和激酶基因的存在是重要的，而且插入的数量也同样重要。
为了进一步优化含有iso-his和xylb“7-7”的菌株，将此菌株用木糖转运蛋白进行转化。图17示出用于转化的示例性构建体。待使用的木糖转运蛋白的实例包括但不限于at5g17010和at5g59250(拟南芥)、gfx1和gxs1(假丝酵母属)、asptx(曲霉属)和sut1(毕赤酵母属)。选择gxs1(seqidno:23)用于转化。结果在图19a、19b和19c中示出。含有gxs1的转化体36-2、36-9和36-16比7-7和wt菌株使用更多的木糖。它们还使用葡萄糖慢于wt和7-7菌株。所述数据表明含有gxs1的菌株在早期阶段中使用木糖和葡萄糖两者。此外，由含gxs1的菌株制成的木糖醇的百分比低于wt和7-7菌株两者。
为了进一步分析糖转运蛋白对木糖代谢的影响，在7-7菌株(isohis+xylb)中引入了来自曲霉属(an11g01100)的密码子优化的木糖转运蛋白asptx和来自假丝酵母的gxs1。图25示出α-微管蛋白asptx-neo和α-微管蛋白gxs1-neo构建体。使用如由biorad的生物射弹pds-1000/he颗粒递送系统所描述的标准生物弹射法方案产生了t18转化体。简言之，用2.5μg线性化质粒dna(ecori，37℃，过夜)包覆0.6μm金颗粒。使用所述包覆的金颗粒来轰击先前铺有1ml的od600为1.0的t18细胞的wd平板。轰击参数包括使用1350或1100psi的氦气压力，目标距离为3cm或6cm。在过夜恢复后，将细胞从平板上洗掉并接种在含有选择抗生素(g418，2mg/ml)的培养基上。将平板在25℃下孵育1周以鉴定抗性菌落。通过pcr和dna印迹筛选所得到的转化体(图26)。
使用标准方案进行dna印迹。简言之，将大约20μg的基因组dna用总体积为50μl的40单位的bamhi限制酶在37℃下消化过夜。使用地高辛(dig)dna分子量标记ii(roche)，将7.2μg的每种消化的样品在1.0％琼脂糖凝胶上在50v下运行大约1.5小时。通过将凝胶浸入250mmhcl中15分钟来使dna在凝胶中脱嘌呤。通过在含有0.5mnaoh和1.5mnacl(ph7.5)的溶液中孵育、两次15分钟洗涤来使凝胶进一步变性。然后通过在0.5mtris-hcl(ph7.5)中孵育、两次15分钟洗涤来中和反应物。最后，将凝胶在20x盐水-柠檬酸钠(ssc)缓冲液中平衡15分钟。使用标准转移设备将dna转移至带正电荷的尼龙膜(roche)上。使用uvstratalinker在120,000μj的曝光下使dna固定至所述膜。使用pcrdig探针合成试剂盒(roche)产生dna印迹探针以根据制造商的说明书产生dig标记的探针。将固定至尼龙膜的dna与20ml的digeasyhyb溶液(digeasyhybgranules,roche)预杂交。通过向300μl的ddh2o中加入40μl的ble-探针反应混合物来使dig标记的探针变性，并在99℃下孵育5分钟。然后将所述溶液添加至20mldig杂交溶液中以产生探针溶液。然后将探针溶液添加至dna固定的尼龙膜并在53℃下孵育过夜。第二天，将所述膜在2xssc、0.1％sds中在室温下洗涤两次。将所述膜在0.1xssc、0.1％sds中在68℃下进一步洗涤两次，每次15分钟。为了检测，使用dig洗涤和封闭缓冲液组(roche)根据制造商的说明书来洗涤并封闭膜。使用来自dig核酸检测试剂盒(roche)的抗dig-ap缀合抗体进行检测。将2μl抗体溶液添加至20ml检测溶液中并与所述膜在室温下孵育30分钟。然后将印迹浸入用所述试剂盒提供的洗涤缓冲液中。cdp-star(roche)用于可视化。将10μl的cdp-star溶液在1ml检测溶液中在膜上孵育，将所述膜覆盖在“片材保护”塑料层中以将溶液保持在膜上。立即使用chemidoc成像系统检测信号。
对于烧瓶测定，将细胞在培养基中生长2至3天。将团块在不含糖的培养基2(9g/lnacl、4g/lmgso4、100mg/lcacl2、5mg/lfecl3、20g/l(nh4)2so4、0.86g/lkh2po4、150μg/l维生素b12、30μg/l生物素、6mg/l盐酸硫胺素、1.5mg/l氯化钴(ii)、3mg/l氯化锰)中洗涤两次。然后，将含有20g/l葡萄糖和20g/l木糖的培养基2用洗涤的细胞接种至0.05的od600。如图27a、27b、27c和27d中所示，与亲本菌株7-7相比，木糖异构酶、木酮糖激酶和任一木糖转运蛋白的表达使得使用达71％更多的木糖且产生少40％的木糖醇。
对于烧瓶测定，将细胞在培养基中生长2至3天。将团块在盐水中洗涤两次。然后，将含有60g/l木糖代替葡萄糖的培养基用洗涤的细胞接种至0.05的od600。在不同的时间点采集样品，并通过hplc分析上清液中剩余的糖的量。图28示出含有木糖作为主要碳源的培养基中的t18生长需要过度表达异构酶和激酶两者。这种背景下的转运蛋白的表达并未显著增加这种培养基中的木糖使用。
在含有来自替代原料的碳的培养基中观察到t187-7和转运蛋白菌株的增强的木糖使用。对于烧瓶测定，将细胞在培养基中生长2至3天。将团块在0.9％盐水溶液中洗涤两次。将含有20g/l葡萄糖:50g/l木糖作为实验室级葡萄糖以及来自林业替代原料的葡萄糖和木糖的组合的培养基2用洗涤的细胞接种至0.05的od600nm。在不同的时间点采集样品，并通过hplc分析上清液中剩余的糖的量。如图29a和29b中所示，在含有来自替代原料的糖的培养基中，编码转运蛋白的t187-7菌株比野生型或t187-7使用更多的木糖。
序列表
<110>玛拉可再生能源公司(mararenewablescorporation)
<120>增强木糖的微藻代谢
<130>095523-1010533(014wo1)
<150>62/191,983
<151>2015-07-13
<150>62/354,444
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<170>siposequencelisting1.0
<210>1
<211>1723
<212>dna
<213>破囊壶菌属(thraustochytriumsp.)
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<213>破囊壶菌属(thraustochytriumsp.)
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<213>梨囊鞭菌属(piromycessp.)
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<213>变铅青链霉菌(streptomyceslividans)
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<213>梨囊鞭菌属(piromycessp.)
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<213>酵母属(saccharomycessp.)
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<213>破囊壶菌属(thraustochytriumsp.)
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<223>合成构建体(syntheticconstruct)
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