经皂苷增强的酵母自溶的方法与流程

相关申请

本申请要求2015年6月23日提交的美国临时申请号61/183,207的权益，其通过引用整体并入本文。

发明领域

本发明通常涉及用于生产酵母产品的方法。更特别地，本发明涉及这样的方法，所述方法引入皂苷以有意地破坏和损伤酵母细胞壁从而选择性地提高酵母提取物调味剂、酵母细胞壁产品和皂苷发酵产品的产量。

发明背景

面包酵母(酿酒酵母(saccharomycescerevisiae))是几千年来用于面包制作、酿酒和酿造的一种酵母。通常，面包酵母能够使用糖(诸如例如蔗糖、果糖、葡萄糖、麦芽糖和海藻糖)生长，并且因此能够是其中这些糖容易获得的方法的可行产品。其中这种糖容易获得以用于消费的一个具体应用是在甜菜加工设施中，甜菜糖(蔗糖)和糖蜜的初级产品和二级产品分别在其中被生产并且容易获得以供养面包酵母。

当被提供给传统的酵母消费者(诸如用于生产发酵面团产品或发酵饮料)时，令人满意的面包酵母处于压缩形式或乳液(cream)形式。在这些压缩形式或乳液形式中，面包酵母的细胞壁足够坚固使得酵母细胞壁保持稳定，从而耐受热、冷和渗透胁迫。

虽然生产压缩的或乳状的面包酵母对于传统的发酵用途是有利的，但是可以存在其它酵母应用，其中具有坚固的细胞壁可能不利于加工结果。因此，对于其中需要细胞壁产品或酵母提取物调味剂的方法，开发用于选择性地生产具有弱化的或不太牢固的细胞壁的面包酵母的方法将是有益的。

发明概述

本发明的方法通过选择性引入升高水平的皂苷来解决生产具有弱化的或不太牢固的细胞壁的酵母细胞的需求。皂苷，即在许多植物中发现的杀真菌剂，是已知在水溶液中具有其絮凝性质的一组两亲性糖苷。当在发酵过程中添加或添加到酵母乳中时，皂苷和酵母/酵母乳之间的代谢活性导致例如在酵母自溶期间rna和游离氨基氮(fan)释放的增加，因而这表明细胞壁膜的损伤和/或弱化。通过向酵母乳中添加皂苷，可以提高细胞壁组分和酵母提取物的产量和/或生产率。在甜菜加工设施的情况下，在蔗糖生产过程中包含在加工流中的皂苷是容易获得的，并且能够在不需要任何额外的采购或购置成本的情况下在发酵过程中引入或者引入到乳状酵母中。除了生产细胞壁组分和酵母提取物之外，皂苷和酵母/酵母乳之间的活性导致皂苷代谢物的形成。

在一方面，本发明涉及提高酵母细胞壁组分和酵母提取物的产量的方法。通常，该方法可以包括在发酵过程中添加皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中添加皂苷。由于发酵罐和酵母乳中酵母与皂苷之间的代谢相互作用，可以提高酵母细胞自溶过程中rna释放的量和/或速率。rna释放的增加表明酵母细胞壁膜的破坏和/或弱化。rna释放量或速率的增加对应于酵母自溶产品产量的提高。从酵母细胞壁组分和提取物中生产例如蛋白质水解物、食品调味成分(诸如5’核苷酸10％i&g)、碱性酵母提取物和β葡聚糖的代表性制造商可以观察到这些酵母自溶产品的增加的产量。除了生产酵母细胞壁组分和酵母提取物之外，皂苷和酵母/酵母乳之间的活性导致皂苷代谢物的形成。

在另一个方面，本发明是使用在农业加工(例如甜菜加工)过程中分离的皂苷产品以选择性地生产和/或提高酵母细胞壁组分和酵母提取物的量和生产率的方法。该方法可以利用分离的皂苷提取物或含有皂苷的干燥植物材料。皂苷可以是经加工的或自然存在的。该方法可以包括在发酵过程中添加皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中添加皂苷。除了生产酵母细胞壁组分和酵母提取物之外，皂苷和酵母/酵母乳之间的活性导致皂苷代谢物的形成。

在又一个方面，本发明可以包括有意地生长具有受损和/或弱化的酵母细胞壁膜的酵母的方法。该方法可以包括在发酵过程中添加皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中添加皂苷。该方法可以进一步包括增加酵母细胞壁组分和酵母提取物的生产率和/或产量。该方法可以包括在厌氧或好氧条件下进行步骤。该方法可以进一步包括皂苷代谢物的形成。

在另一个方面，本发明可以包括通过在发酵过程中引入皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中引入皂苷来增加酵母细胞壁组分和酵母提取物的生产率和/或产量的方法。能够作为皂苷处理的靶标的酵母菌种可以包括例如以下的菌株：酿酒酵母(saccharomycescerevisiae)(面包酵母和啤酒酵母)、脆壁克鲁维酵母(kluyveromycesfragilis)和假丝酵母(candida)菌株(诸如产朊假丝酵母(candidautilis))及其组合，德尔布酵母(saccharomycesdelbruekii)，罗氏酵母(saccharomycesrosei)，微球酵母(saccharomycesmicroellipsodes)，卡尔酵母(saccharomycescarlsbergensis)，粟酒裂殖酵母(schizosaccharomycespombe)，乳酸克鲁维酵母(kluyveromyceslactis)，多孢克鲁维酵母(kluyveromycespolysporus)，白色假丝酵母(candidaalbicans)，阴沟假丝酵母(candidacloacae)，热带假丝酵母(candidatropicalis)，季也蒙假丝酵母(candidaguilliermondii)，温奇汉逊酵母(hansenulawingei)，阿尼汉逊酵母(hansenulaarni)，亨氏汉逊酵母(hansenulahenricii)，美洲汉逊酵母(hansenulaamericana)及其组合。另外，皂苷和酵母/酵母乳之间的代谢活性导致皂苷代谢物的形成。

本发明的各个代表性实施方案的上述概述不旨在描述发明的每一个所示的实施方案或每个实施。相反，可选择和描述某些实施方案，使得本领域技术人员能够领会和理解本发明的原理和实践。下面的详细描述中的附图更具体地例证了这些实施方案。

附图的简要说明

结合所附附图考虑本发明的各个实施方案的下述详细描述可完全地理解本发明，其中：

图1显示了随时间的光密度(od)，其用于测量发酵过程中皂苷对酵母培养物生长的影响。

图2表明了与对照相比，在30℃发酵2小时的情况下将皂苷添加到酵母乳中的样品的增加的rna释放。

图3显示了对应于图2所示样品的rna的浓度比。

图4显示了通过测量游离氨基氮，经皂苷增强的面包酵母自溶。

图5显示了通过在24小时测量游离氨基氮，在50℃经皂苷增强的自溶。

图6显示了通过在48小时测量游离氨基氮，在50℃经皂苷增强的自溶。

虽然本发明适用于各种修改和替代形式，但是其详细情况已经通过附图中的实例示出，并且将被详细描述。然而，应当理解的是其意图不是将发明限制于所描述的特定实施方案。相反地，其意图是涵盖落入由所附权利要求书限定的发明的精神和范围内的所有修改、等同物和替代物。

附图的详细说明

根据本发明的代表性实施方案的方法能够用于选择性地提高酵母细胞壁组分和酵母提取物的生产率和/或产量。通常，该方法涉及在发酵(分批发酵、补料分批发酵或连续发酵)过程中选择性地添加皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中选择性地添加皂苷，由此酵母和皂苷之间的代谢活性导致了受损的和/或弱化的酵母细胞壁膜。受损的/弱化的酵母细胞壁膜通常由所得自溶产物中rna的存在增加来表示。所得自溶产物中rna的存在增加表明酵母自溶产物(包括细胞壁、调味剂和提取物产品)的存在增加。能够作为本发明皂苷处理的靶标的代表性酵母菌种可以包括例如以下的菌株：酿酒酵母(面包酵母和啤酒酵母)、脆壁克鲁维酵母和假丝酵母菌株(诸如产朊假丝酵母)及其组合，德尔布酵母，罗氏酵母，微球酵母，卡尔酵母，粟酒裂殖酵母，乳酸克鲁维酵母，多孢克鲁维酵母，白色假丝酵母，阴沟假丝酵母，热带假丝酵母，季也蒙假丝酵母，温奇汉逊酵母，阿尼汉逊酵母，亨氏汉逊酵母，美洲汉逊酵母及其组合。除了生产酵母细胞壁产品之外，皂苷和酵母/酵母乳之间的活性导致皂苷代谢物的形成。

皂苷是一种两亲性糖苷，其常常在各种植物物种(包括甜菜)中发现并具有杀真菌性质。当在各种应用中使用甜菜糖时，已经发现皂苷的存在由于其絮凝物性质而是不利的。例如，当在生产低ph碳酸软饮料的饮料工业中使用的甜菜糖中存在皂苷时，例如，所得饮料可以由于絮凝而遭受质量问题(混浊)。

北达科他州瓦佩顿(wahpeton)的明尼苏达-达科塔农民合作社(minn-dakfarmerscooperative)是一家甜菜加工厂，其加工甜菜以回收蔗糖。除甜菜糖之外，明尼苏达-达科塔还有一间酵母车间，其利用来自精炼过程的副产品糖蜜来生产面包酵母。在生产面包酵母中，明尼苏达-达科塔已经鉴定了其中压缩酵母的生产受到损害的某些条件，这导致传统上认为是不可接受的“粘性(gummy)”酵母产品。对于传统的面包酵母消费者，诸如制备面团产品的商业面包房和制造发酵饮料的酿酒厂，粘性稠度被认为是质量差的。然而，所得的酵母产品的粘性稠度指示细胞壁膜损伤，这对酵母细胞壁产品和酵母提取物的其它使用者可以是有利的。因此，明尼苏达-达科塔已经发现了可重复的方法，所述方法通过在发酵过程中向酵母培养物中选择性地引入皂苷或在酵母自溶之前向酵母乳中选择性地引入皂苷来有意地提高酵母细胞壁产品和酵母提取物的产量。另外，在明尼苏达-达科塔的甜菜糖加工的加工流中存在皂苷提供了便宜且容易获得的机制，用于在现有酵母生产设施中选择性地提高酵母细胞壁产品和酵母提取物的产量和/或生产率。

在发酵过程中添加皂苷

为了生产面包酵母，基于碳的能量来源对于酵母繁殖是必需的。传统上，发酵过程已经进行，目的是生长最终呈现适于在烘焙工业中使用的压缩形式的酵母。在以下实施例中，有意地将皂苷作为能量来源的组分或作为能量来源的补充物在发酵期间添加到酵母培养物中，以确定皂苷对酵母细胞发育的影响。

在整个以下实施例中，所有实验中使用的酵母是从明尼苏达-达科塔酵母公司(minn-dakyeastcompany)生产发酵罐中获得的原代生长的面包酵母。对所有酵母样品测试产气(gassing)和热休克稳定性，以验证酵母样品的健康和活力。只有高质量、稳定的酵母被用于实验。实施例1和2在实验室烧瓶内进行，而14升的newbrunswickscientificcompanymicroferm发酵罐被用作实施例3和4的自溶反应器。microferm具有温度和ph控制，搅拌器通过3，6-叶桨轮式叶轮以400rpm旋转。在整个实施例中控制工艺变量(包括混合、ph和温度)。

实施例1

制备三个样品，其中酵母培养物在烧瓶中繁殖。每个样品的能量来源是甜菜糖蜜，主要包括蔗糖、葡萄糖和果糖。通常，甜菜糖蜜可作为甜菜加工的副产品获得。

在样品1中，将甜菜糖蜜在不经过预处理/过滤的情况下直接提供到烧瓶中。在样品2中，在将甜菜糖蜜添加到烧瓶之前将其过滤以在暴露于酵母培养物之前去除任何皂苷。在样品3中，甜菜糖蜜在发酵之前添加控制量的皂苷。在发酵过程中，对每个样品常规测量光密度(od)，其中较高的od测量值对应于增加的酵母细胞生长。相应地，较低的od测量值表示降低的酵母细胞生长。

样品1、2和3的od结果总结在图1中。通常，结果表明在发酵之前去除皂苷(样品2)导致最高的酵母细胞生长，而富含皂苷的糖蜜(样品3)显著地阻碍酵母细胞生长。对照样品(样品1)似乎显示存在较低水平的皂苷(与样品3相比)，在发酵之前没有经历过滤的甜菜糖蜜中将预期出现这种情况。

向酵母乳中添加皂苷

当将皂苷添加到酵母乳中时，皂苷和酵母乳之间的代谢活性导致酵母细胞壁膜的损伤和/或弱化。所导致的酵母细胞壁膜的损伤/弱化可以通过利用设置在260nm波长的分光光度计测量酵母自溶过程中释放的rna量来定量。在以下实验例中证明了由于添加皂苷而引起的rna释放的增加。

实施例2

同时制备并温育两个酵母乳样品。第一个样品是仅含有酵母乳的对照。第二个样品含有与对照相同的酵母乳，但是具有添加到混合物中的已知量的皂苷提取物。将两个样品在温度控制的水浴中在相同的条件下在30℃的温度温育两小时，以引发皂苷和酵母乳之间的代谢活性。两小时后，然后将两个样品在不到10分钟的时间内加热到50℃，在此之后在该温度保持六小时的时间段以完成酵母自溶。在自溶过程中，在260nm处用分光光度计周期性地分析两个样品中的每一个以测量rna释放，并且吸光度指数在图2中显示。

如图2所示，与共同时间间隔的对照相比，含有皂苷的样品具有显著更高的rna指数。如果随着时间绘制两种测试混合物的rna浓度的比率，则可以在图3中看到，经皂苷增强的自溶在八小时测试期间产生比对照多二至八倍的rna。

如在测试中所示，从甜菜加工引入皂苷和/或含有皂苷的副产品导致在酵母自溶过程中释放更高水平的rna。更高水平的rna的存在指示酵母细胞壁损伤/弱化，并且当所需产品是酵母细胞壁产品和酵母提取物时其是有利的。通过在酵母发酵过程中或在自溶之前选择性地控制皂苷的添加，可以选择性地生产用于商业面包房和酿酒厂的具有牢固细胞壁的压缩形式的酵母终产物或用于酵母细胞壁产品和酵母提取物的粘性酵母。更特别地，通过在自溶之前向酵母乳中引入皂苷可以提高酵母细胞壁产品和酵母提取物(例如蛋白质水解物、食品调味成分诸如5’核苷酸10％i&g、碱性酵母提取物和β葡聚糖)的产量。

经皂苷增强的自溶

在以下实施例3和4中，在酵母自溶测定中利用皂苷提取物(在甜菜加工过程中提取的)。皂苷提取物由以下组成：

实施例3

制备三个面包酵母样品。第一个样品是没有添加皂苷的高质量面包酵母的对照样品。第二个样品含有高质量的面包酵母，在酵母和皂苷之间几乎不存在至不存在发酵活性的条件下添加70g皂苷提取物作为洗涤剂。第三个样品含有高质量的面包酵母，在自溶步骤之前在30℃添加70g皂苷提取物作为发酵饲料持续2小时。将3个面包酵母样品在45℃和在5.45-5.55的ph置于自溶反应器中。样品在进入自溶24和48小时从反应器中抽出。将样品的50ml等分样品在离心机中以3300rpm旋转8分钟。样品在管底部具有酵母细胞壁沉淀，并且在顶部具有轻相提取液。通过硅藻土过滤器过滤轻相提取物并分析游离氨基氮浓度(fan)。fan被用作自溶活性的指示。更高浓度的fan表示酵母细胞蛋白质和蛋白水解酶的释放更大。

如图4所示，所有三个样品在进入自溶24小时具有相似的fan浓度。不具有预自溶发酵步骤的样品2具有与对照大致相同的fan浓度。然而，在48小时，样品3的fan比对照增加了91％。样品2中的反应在不具有发酵步骤的情况下在皂苷是非生物活性洗涤剂的条件下进行。样品3的结果表明，在生物活性条件下在酵母发酵过程中添加皂苷具有增加自溶活性的作用。这表明在发酵步骤过程中引入皂苷最终加速了酵母的自溶。据信这些结果的机制是在促进发酵活性的条件下皂苷糖苷与酵母细胞壁的相互作用。

实施例4

制备四个面包酵母样品。第一个样品是没有添加皂苷的高质量面包酵母的对照样品。第二个样品含有高质量的面包酵母，在自溶之前2小时在30℃添加含有大约10g纯皂苷的35g皂苷提取物作为发酵饲料。第三个样品含有高质量的面包酵母，在自溶之前2小时在30℃添加含有大约10g纯皂苷的202g干燥且切碎的甜菜叶作为发酵饲料。第四个样品包含高质量的面包酵母，在自溶之前在30℃添加含有大约20g纯皂苷的70g皂苷提取物作为发酵饲料持续2小时。将样品在50℃和5.45-5.55的ph置于自溶反应器中。样品在进入自溶24和48小时从反应器中抽出。将样品的50ml等分样品在离心机中以3300rpm旋转8分钟。离心的样品在管底部具有酵母细胞壁沉淀，并且在顶部具有轻相提取液。通过硅藻土过滤器过滤轻相提取物并分析fan浓度。

如图5所示，在所有自溶条件下，在进入自溶24小时的酵母提取物中50℃自溶系列显示比45℃系列显著更多的fan。这表明升高的温度对真菌细胞壁的自溶具有显著影响。在24小时，样品2和3向自溶实验提供了大约相同量的实际皂苷，并且相比于对照的fan浓度增加是非常相似的，分别为30％和32％。这些结果表明，以加工提取物或其天然状态(干燥且切碎的甜菜叶)的形式提供的等量皂苷具有增加自溶活性的等同效果，而与皂苷来源无关。与样品2和3相比，样品4具有双倍的皂苷浓度，并且样品4的fan浓度比对照(样品1)增加117％，这表明较高的皂苷浓度增加了自溶速率。

如图6所示，与45℃实验相比，50℃样品在48小时自溶后在样品范围内具有更相似的fan浓度。这是由于在添加和不添加皂苷的情况下，在较高温度下酵母细胞内容物向提取物溶液中的释放增强。图6还表明，具有样品4的大约一半量的皂苷含量的样品3在48小时后具有与样品4相似的自溶活性量。在48小时未测试样品2，因此图6中没有呈现样品2的数据。这些结果表明增加的皂苷浓度提高了酵母的自溶活性速率。参考图5，样品4在24小时基本上完成了99％，而样品2和3在24小时仅完成62％。然而，在48小时后，样品3经历了与样品4基本相同量的自溶活性。

正如测试所示，当存在自溶前发酵步骤时，将皂苷添加到面包酵母的自溶过程中证明是有效地提高了自溶速率。当使用加工的皂苷提取物或干燥且切碎的甜菜叶时，不管皂苷来源如何，含有相同量的皂苷的样品获得了相似的结果。尽管这些实验是在厌氧条件下进行的，但是在好氧加工条件下预期得到相似的结果。该方法的商业应用可以尤其是传统的酵母自溶、酵母提取物生产、酵母细胞壁和细胞壁产品生产以及皂苷发酵产品。其它皂苷来源，诸如例如作为其它农业来源(诸如大豆、花生、各种豆种、燕麦、芦笋、菠菜、苜蓿和各种树种)的产品或副产品，可以具有相同的效果。由于这些不同的农产品中存在不同且独特的皂苷，因此预期使用不同农业来源的皂苷将允许生产各种不同的酵母自溶和皂苷发酵产品。无论皂苷来源如何，在发酵步骤过程中暴露于皂苷的真菌或酵母菌株将通过具有弱化的细胞壁和增加的自溶产物的速率和量来响应，所述自溶产物将基于加工条件和皂苷来源而变化。

虽然本文中已经说明和描述了具体实例，但是本领域普通技术人员可理解，为实现相同目的而计算的任何布置能够代替所示的具体实例。本申请旨在涵盖本主题的调整或变化。因此，本发明旨在由所附权利要求书及它们的合法等效物所定义。