本专利申请要求于2016年4月6日提交的pct专利申请pct/us2016/026270的权益，所述pct专利申请要求以下专利申请的权益：于2015年10月6日提交的pct专利申请pct/us2015/054295；于2014年10月6日提交的美国临时专利申请62/060,484；于2015年8月18日提交的美国临时专利申请62/206,770、62/206,771；以及于2015年8月18日提交的美国临时专利申请62/206,772，这些专利申请中的每一篇的全部内容均通过引用并入本文。
本专利申请涉及新型结合剂和载体蛋白的组合物及其制备和使用方法，具体而言，该组合物可作为癌症治疗剂。
背景技术：
化疗一直是用于包括黑素瘤在内的多种类型癌症的全身性疗法的主要手段。大多数化疗药物对肿瘤细胞只有轻微选择性，而对健康增殖细胞的毒性可能很高(allentm.(2002)cancer2:750-763(allentm.，2002年，《癌症》，第2卷，第750-763页))，因此通常需要减小剂量，并且甚至终止治疗。理论上，克服化疗毒性问题以及改善药物疗效的一种方法是使用对由肿瘤细胞选择性表达(或过度表达)的蛋白质具有特异性的抗体将靶向药物吸引至肿瘤而使化疗药物靶向肿瘤，从而改变化疗药物的体内分布并导致更多药物进入肿瘤而在较低程度上影响健康组织。尽管进行了30年的研究，但特异靶向在治疗中很少成功。
常规抗体依赖性化疗(adc)被设计成其中毒性剂经由合成的蛋白酶可裂解连接体连接至靶向抗体。这种adc疗法的功效取决于靶细胞结合至抗体的能力、待裂解的连接体以及毒性剂在靶细胞中的吸收。schrama,d.etal.(2006)naturereviews.drugdiscovery5:147-159(schrama,d.等人，2006年，《自然评论药物发现》，第5卷，第147-159页)。
抗体靶向化疗具有优于常规疗法的优势，因为其提供靶向能力、多种细胞毒素剂以及改善的治疗能力而潜在更小的毒性的组合。尽管进行了广泛的研究，但临床上有效的抗体靶向化疗仍然难以捉摸：主要障碍包括抗体和化疗药物之间的连接体不稳定、化学治疗剂在结合至抗体时肿瘤毒性降低以及缀合物不能结合并进入肿瘤细胞。此外，这些疗法不允许对抗体-药物缀合物的尺寸加以控制。
本领域仍然需要基于抗体的癌症治疗剂，这些治疗剂保持靶向药物递送的细胞毒性效应以提供比现有治疗剂可靠且改善的抗肿瘤功效。
此外，就任何治疗应用而言，仍然需要物理、化学和生物特性稳定的组合物。
冻干或冷冻干燥从组合物中除去水。在该工艺中，首先冷冻待干燥的材料，然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻溶剂。赋形剂可包括在预冻干的制剂中以增强冷冻干燥过程期间的稳定性和/或改善冻干的产品在储存时的稳定性。pikal,m.biopharm.3(9)26-30(1990)(pikal,m.，《生物制药》，第3卷第9期，第26-30页，1990年)和arakawaetal.,pharm.res.8(3):285-291(1991)(arakawa等人，《药物研究》，第8卷第3期，第285-291页，1991年)。
虽然可冻干蛋白质，但冻干和复溶方法可能影响蛋白质的特性。因为蛋白质比传统有机和无机药物更大且更复杂(即除复杂的三维结构之外还有多个官能团)，此类蛋白质的制剂产生了特殊问题。为了使蛋白质保持生物活性，制剂必须保持蛋白质氨基酸的至少核心序列的构象完整性完好，同时保护蛋白质的多个官能团免于降解。蛋白质的降解途径可涉及化学不稳定性(即任何涉及通过键形成或裂解来修饰蛋白质的方法从而得到新的化学实体)或物理不稳定性(即蛋白质的更高阶结构改变)。化学不稳定性可能是脱酰胺、消旋、水解、氧化、β消除或二硫键交换引起的。物理不稳定性可能是例如变性、聚集、沉淀或吸附引起的。三种最常见的蛋白质降解途径是蛋白质聚集、脱酰胺和氧化。cleland,etal.,criticalreviewsintherapeuticdrugcarriersystems10(4):307-377(1993)(cleland等人，治疗性药物载体系统的重要综述，第10卷第4期，第307-377页，1993年)。
技术实现要素：
在本发明中，组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包括(a)载体蛋白、(b)结合剂和(c)任选地治疗剂。所述结合剂被认为通过其本身微弱的疏水相互作用结合至载体蛋白。尽管将组合物冻干和复溶，但保持了单独的组分的活性以及它们在纳米颗粒中的相对关系。另外本发明还提出，结合至载体蛋白(例如结合剂复合至载体蛋白)通过结合剂的疏水部分中的一些或全部(例如fc组分)发生，这导致疏水部分的全部或部分整合到载体蛋白核心，而抗体的靶结合部分(区域)(例如fa和fb部分)保持在载体蛋白核心之外，从而保持其靶特异性结合能力。在一些实施方案中，结合剂是非治疗性和非内源性人抗体、融合蛋白(例如抗体fc结构域融合至结合靶抗原的肽)或适体。
由于在疗法中使用纳米颗粒而产生了进一步的挑战。
虽然疏水性组分在纳米颗粒中的重排可通过组分之间的共价键减缓，但此类共价键为纳米颗粒在癌症治疗中的治疗性用途提出了挑战。结合剂、载体蛋白和附加的治疗剂通常通过不同的机制作用于肿瘤中的不同位置处。非共价键允许纳米颗粒的组分在肿瘤中解离。因此，虽然共价键可有利于冻干，但它对于治疗性用途可能是不利的。
纳米颗粒的尺寸和尺寸的分布也很重要。纳米颗粒根据其尺寸可起到不同的作用。在大尺寸时，纳米颗粒或颗粒的团聚体可堵塞血管，它们中的任一者均可影响组合物的性能和安全。
最后，冷冻保护剂和有助于冻干过程的试剂对于治疗性用途必须是安全且耐受的。
在本发明中，本发明的组合物包含纳米颗粒，该纳米颗粒包括(a)载体蛋白、(b)结合剂和(c)任选地治疗剂。不受理论的限制，结合剂被认为通过其本身的微弱的疏水相互作用结合至载体蛋白。尽管将组合物冻干和复溶，但仍然实现了单独的组分的活性以及它们在纳米颗粒中的相对关系。
一方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒中的每一个包括载体蛋白、约100至约1000个结合剂和任选地至少一种治疗剂，其中结合剂从纳米颗粒的表面向外排布，并且其中纳米颗粒能够结合至体内预定的表位。
当静脉内给药时，大颗粒(例如大于1μm)通常是不利的，因为它们可驻留在肺的微脉管系统中。同时，较大的颗粒可积聚在肿瘤或特定器官中。参见例如用于注入给养肝脏肿瘤的肝动脉中的20-60微米的玻璃颗粒，称为“therasphere”(用于肝癌的临床用途中)。
因此，对于静脉内给药而言，使用1μm以下的颗粒。1μm以上的颗粒更通常直接给药到肿瘤中(“直接注射”)或给药到给养到肿瘤部位的动脉中。
另一方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒中的每一个包括非白蛋白的载体蛋白、约100至约1000个结合剂(优选地约400至约800个的结合剂)和任选地至少一种治疗剂，其中结合剂布置在纳米颗粒的外表面上，并且其中纳米颗粒能够结合至体内预定的表位。当纳米颗粒多聚化时，结合剂的数量成比例地增加。例如，如果160nm纳米颗粒包括400个结合剂，则320nm二聚体包括约800个结合剂。
另一方面，本文提供了包含纳米颗粒的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒中的每一个包括载体蛋白、约400至约800个结合剂和任选地至少一种非紫杉醇治疗剂，其中结合剂布置在纳米颗粒的表面上使得结合剂的结合部分从该表面指向外部，并且其中纳米颗粒能够结合至体内预定的表位。
在其它实施方案中，纳米颗粒发生多聚化，例如二聚化。多聚化做可被看作单位分子的重量或尺寸的加倍，例如160nm颗粒多聚成约320nm、480nm、640nm等。在一些实施方案中，颗粒群中小于20％的纳米颗粒是多聚体。在一些实施方案中，颗粒群中大于80％的纳米颗粒是多聚体。
在一个实施方案中，载体结合药物与结合剂(例如白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗)的重量比为约5:1至约1:1。在一个实施方案中，载体结合药物与结合剂的重量比为约10:4。在一个实施方案中，结合剂为纳米颗粒的全部或部分表面上的基本上单层。在一个实施方案中，所述组合物中小于0.01％的纳米颗粒具有选自以下的尺寸：大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm以及大于800nm。较大的尺寸被认为是由于若干纳米颗粒的多聚化导致的，每个纳米颗粒包括核心和涂覆在每个纳米颗粒的全部或部分表面上的结合剂。
本发明还包括冻干的组合物以及与新鲜制备的纳米颗粒的特性没有显著不同或与新鲜制备的纳米颗粒的特性相同的冻干的组合物。具体地，冻干的组合物在重悬于水溶液中之后在粒度、粒度分布、对于癌细胞的毒性、结合剂亲和力以及结合剂特异性方面与新鲜的组合物类似或相同。本发明涉及令人惊讶的发现，冻干的纳米颗粒在重悬之后保持新鲜制备的纳米颗粒的特性，尽管这些颗粒中存在两种不同的蛋白质组分。
一个方面，本发明涉及一种包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物，其中所述纳米颗粒中的每个纳米颗粒包括载体结合药物核心和布置在核心表面上的一定量的结合剂，使得结合剂的结合部分从该表面指向外部，其中结合剂在用水溶液复溶时保持其与纳米颗粒外表面的缔合。在一个实施方案中，冻干的组合物在室温下稳定至少约3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月或更长时间。在一个实施方案中，冻干的组合物在室温下稳定至少3个月。在一个实施方案中，复溶的纳米颗粒保持治疗剂的活性并且能够结合至体内靶点。
在一个实施方案中，复溶的纳米颗粒的平均尺寸为约130nm至约1μm。在一个优选的实施方案中，复溶的纳米颗粒的平均尺寸为约130nm至约200nm，并且更优选地为约160nm。在一个实施方案中，复溶的纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm，其包括较小纳米颗粒的多聚体，例如100-200nm纳米颗粒的多聚体。在一个实施方案中，核心与结合剂的重量比为大于1:1至约1:3。在一个实施方案中，复溶的纳米颗粒的平均尺寸为约160nm至约225nm。
一个方面，本公开涉及一种包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒中的每个纳米颗粒包括：(a)白蛋白结合的紫杉醇核心以及(b)布置在白蛋白结合的紫杉醇核心表面上的约400至约800个分子的贝伐单抗，使得结合剂的结合部分从该表面指向外部，其中结合剂在用水溶液复溶之后保持与纳米颗粒表面的缔合，前提条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃下稳定至少3个月，并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合至vegf。
在其它方面，本文公开的内容涉及一种包含纳米颗粒的冻干的纳米颗粒组合物，其中纳米颗粒中的每个纳米颗粒包括：(a)白蛋白结合的紫杉醇核心以及(b)布置在白蛋白结合的紫杉醇核心表面上的一定量的贝伐单抗，使得结合剂的结合部分从该表面指向外部，其中结合剂在用水溶液复溶时保持与纳米颗粒表面的缔合，前提条件是所述冻干的组合物在约20℃至约25℃下稳定至少3个月，并且复溶的纳米颗粒能够在体内结合至vegf，并且另外，其中复溶的纳米颗粒的平均尺寸与新鲜制备的纳米颗粒的粒度并无显著差异。在一些实施方案中，平均粒度介于200nm和800nm之间，包括200nm、300nm、400nm、500nm、600nm、700nm或800nm。在其它实施方案中，平均粒度更大，例如大于800nm至约3.5μm。在一些实施方案中，颗粒为纳米颗粒的多聚体。在一些实施方案中，新鲜制备的纳米颗粒或者在冻干并重悬于适于注射的水溶液中之后的纳米颗粒的平均粒度为约160nm至约225nm。
在一些实施方案中，白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约5:1至约1:1。在其它实施方案中，白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为约10:4。在另外的实施方案中，白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的重量比为大于1:1至约1:3。
在一些实施方案中，核心为白蛋白结合的紫杉醇，并且结合剂选自：选择性地识别vegf的结合剂(例如贝伐单抗/阿瓦斯汀(avastin))、选择性地识别cd20的结合剂(例如利妥昔单抗/rituxin)以及选择性地识别her2的结合剂(曲妥珠单抗/赫赛汀(herceptin))。
在一些实施方案中，所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒内部。在其它实施方案中，所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒的外表面上。在其它实施方案中，所述至少一种治疗剂位于纳米颗粒内部和纳米颗粒的外表面上。
在一些实施方案中，纳米颗粒包括多于一种类型的治疗剂。例如，紫杉烷和铂基药物，例如紫杉醇和顺铂。
在一些实施方案中，结合剂选自：ado-曲妥珠单抗艾美坦辛、阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、狄诺塞麦、地努图希单抗、易普利姆玛、纳武单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、帕姆单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗。在一些实施方案中，结合剂为纳米颗粒的全部或部分表面上的基本上单层的结合剂。
在另外的实施方案中，抗体的糖基化程度比通常存在于天然人抗体中的低。这种糖基化可受例如表达系统或在表达期间存在糖基化抑制剂的影响。在一些实施方案中，抗体或其它结合剂的糖基化状态通过酶或化学作用而改变。
在一些实施方案中，所述至少一种治疗剂选自：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西他塞、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、紫杉醇、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、赛特铂、索拉非尼、威罗菲尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂(triplatin)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。
在一些实施方案中，纳米颗粒还包括至少一种其他治疗剂，其不是紫杉醇或贝伐单抗。
在一些实施方案中，结合剂、载体蛋白和治疗剂(当存在时)通过非共价键结合。
在一些实施方案中，载体蛋白选自：明胶、弹性蛋白、麦胶蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白、牛奶蛋白和乳清蛋白。在其它实施方案中，载体蛋白是白蛋白，例如人血清白蛋白。
在一些实施方案中，所述组合物被配制成用于静脉内递送。在其它实施方案中，所述组合物被配制成用于直接注射或灌注到肿瘤中。
在一些实施方案中，所述组合物中纳米颗粒的平均尺寸为大于800nm至约3.5μm。
在一些实施方案中，纳米颗粒具有介于约1×10-11m和约1×10-9m之间的解离常数。
另一方面，本文提供了制备纳米颗粒组合物的方法，其中所述方法包括使载体蛋白和任选地至少一种治疗剂与抗体在温度为5℃至约60℃、23℃至约60℃、或55℃至约60℃且ph值为5.0至7.5的溶液中，在允许形成期望的纳米颗粒的条件和组分比下接触。在一个实施方案中，在55℃至60℃且ph7.0的条件下制备纳米颗粒。在另一个方面，本文提供了制备纳米颗粒组合物的方法，其中所述方法包括(a)使载体蛋白和任选地至少一种治疗剂接触以形成核心，以及(b)使核心与抗体在ph为约5.0至约7.5且温度为5℃至约60℃、23℃至约60℃、或55℃至约60℃的溶液中，在允许形成期望的纳米颗粒的条件和组分比下接触。
控制组分(例如载体蛋白、抗体、治疗剂、它们的组合)的量以便形成期望的纳米颗粒。其中组分的量过稀的组合物将不会形成本文所述的纳米颗粒。在一个优选的实施方案中，载体蛋白与结合剂的重量比为10:4。在一些实施方案中，载体蛋白的量介于约1mg/ml和约100mg/ml之间。在一些实施方案中，结合剂的量介于约1mg/ml和约30mg/ml之间。例如，在一些实施方案中，载体蛋白：结合剂：溶液的比率为大约9mg载体蛋白(例如白蛋白)：4mg结合剂(例如bev)：1ml溶液(例如盐水)。一定量的治疗剂(例如紫杉醇)也可加入载体蛋白。
在另外的实施方案中，如上制备纳米颗粒，然后冻干。
在另一个方面，本文提供了用于治疗癌细胞的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物接触以治疗癌细胞。
在另一个方面，本文提供了用于治疗需要这种治疗的患者的肿瘤的方法，所述方法包括使细胞与有效量的本文公开的纳米颗粒组合物接触以治疗肿瘤。在一些实施方案中，肿瘤的尺寸有所减小。在其它实施方案中，静脉内给药纳米颗粒组合物。在其它实施方案中，通过直接注入或灌注到肿瘤中来给药纳米颗粒组合物。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括以下步骤：a)每周给药一次纳米颗粒组合物，持续三周；b)停止给药纳米颗粒组合物一周；以及c)根据需要重复步骤a)和b)以治疗肿瘤。
在相关实施方案中，治疗包括在给药纳米颗粒之前给药靶向结合剂。在一个实施方案中，在给药纳米颗粒之前约6小时至48小时或12小时至48小时给药靶向结合剂。在另一个实施方案中，在给药纳米颗粒之前6小时至12小时给药靶向结合剂。在另一个实施方案中，在给药纳米颗粒之前2小时至8小时给药靶向结合剂。在其它实施方案中，在给药纳米颗粒前一周给药靶向结合剂。例如，在给药ab160之前24小时给药一定剂量的bev。又如，在给药ar纳米颗粒之前给药利妥昔单抗。在纳米颗粒之前给药的结合剂可按亚治疗剂量给药，例如，通常认为是治疗性量的1/2、1/10或1/20。因此，对于人类而言，用bev预治疗可包括给药lmg/kgbev(其为通常剂量的1/10)，然后给药ab160。
在一些实施方案中，治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白(即毫克载体蛋白/m2患者)。在其它实施方案中，治疗有效量包括约75mg/m2至约175mg/m2的治疗剂(例如紫杉醇)。在其它实施方案中，治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的结合剂。在其它实施方案中，治疗有效量包括约30mg/m2至约70mg/m2的贝伐单抗。
在一个具体的实施方案中，冻干的组合物包含约75mg/m2至约175mg/m2的载体蛋白，其优选地为白蛋白；约30mg/m2至约70mg/m2的结合剂，其优选地为贝伐单抗；以及约75mg/m2至约175mg/m2的紫杉醇。
本发明的实施方案包括一种通过给药纳米颗粒中的化疗剂来延长肿瘤摄入化疗剂的持续时间的方法，所述纳米颗粒包括载体蛋白以及与抗体(例如特异性结合至肿瘤上的抗原或肿瘤脱落的抗原的抗体)具有表面复合的化疗剂。
附图说明
以下附图仅仅是代表性的并且不旨在限定本发明。为了保持一致性，本发明的纳米颗粒使用
图1a示出了流式细胞术散点图，其包括：仅用二抗染色的
图1b示出了采用金颗粒标记的抗人iggfe孵育ab160之后的代表性电子显微图。
图1c示出了表示ab160组分中总紫杉醇的百分比的饼形图(上图)(粒状，大于100kd的蛋白质和小于100kd的蛋白质)；以及采用抗小鼠iggfab(bev)的抗体和紫杉醇来验证共定位的western印迹(底部)。
图1d表示相比于单独的abx，紫杉醇在采用a375人黑素瘤细胞的体外毒性测定中的活性。结果以平均值(+/-平均值标准误差)增殖指数表示，其为未处理细胞的总增殖百分比。这些数据表示3个实验，并且差异不显著。
图1e表示在vegf与abx和ab160共孵育之后上清液vegfelisa的结果，以测定抗体对配体vegf的结合。结果示为未与两种复合物结合的vegf的平均百分比+/-平均值标准误差。该数据表示3个实验，**p<0.005。
图2a示出了通过在形成纳米颗粒和更大的颗粒的条件下将bev(贝伐单抗)加至abx所形成的复合物的尺寸(通过光散射技术测定)。提高加入10mgabx中的bev的浓度(0-25mg)，并测定所形成复合物的尺寸。随着bev的浓度增大，复合物的平均尺寸(146nm至2,166nm)有所增加。该数据显示为样品体积/尺寸，并且图形示出颗粒的尺寸分布。这些数据表示5个单独的药物制剂。作为比较，abx本身具有约130nm的平均粒度。
图2b示出abx和bev的结合亲和力(如通过光吸收(blitz)技术测定)。该数据显示为解离常数(kd)。评估了在四个ph水平(3、5、7、9)和3个温度(rt、37℃和58℃)下制备的颗粒的结合亲和力，并且该数据表示5个实验。
图2c示出了通过纳米颗粒跟踪分析(nta)在nanosight300(ns300)上测定的图2b纳米颗粒复合物在血清中的稳定性。该数据显示为颗粒数目/mgabx，并相对于在每种条件下单独使用abx，比较了在rt和ph7(ab16007；粒度，ph值)、58℃和ph7(ab1600758；粒度，ph，温度)以及58℃和ph5(ab1600558；粒度，ph，温度)下制备的ab160。一旦制成颗粒，就将其加入人ab血清，持续15、30和60分钟以测定随时间推移在血清中的稳定性。
图3a示出了在右侧腹注射有1×106a375人黑素瘤细胞并在肿瘤尺寸为约600mm3至900mm3的条件下用pbs、12mg/kgbev、30mg/kgabx、12mg/kgbev+30mg/kgabx或ab160(具有约12mg/kgbev和约30mg/kgabx)治疗的无胸腺裸鼠中ab纳米颗粒的体内测试。在治疗后第7天数据表示为肿瘤尺寸相对于基线(治疗当天的肿瘤尺寸)的变化百分比。学生t检验用于确定显著性。所有ab颗粒的p值均显著不同于pbs、单独的各个药物和按顺序给药的两种药物。
图3b示出了图3a中分析的小鼠的中位存活期而生成的卡普兰-迈耶曲线。使用mantle-cox检验比较存活曲线而确定显著性。
图3c示出了当肿瘤小于或大于700mm3时治疗后小鼠相对于基线的变化百分比，以确定肿瘤的尺寸是否影响仅abx组和ab160组的肿瘤反应。学生t检验用于确定显著性。基于肿瘤尺寸，仅abx组未示出显著性差异(p＝0.752)，而ab160组显示出显著性差异(p＝0.0057)。
图3d示出了在右侧腹注射有1×106a375人黑素瘤细胞并在肿瘤尺寸为约600mm3至900mm3的条件下用pbs、30mg/kgabx或45mg/kgbev和ab160、ab580(具有580nm的平均粒度的白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的纳米颗粒)或ab1130(具有1130nm的平均粒度的白蛋白结合的紫杉醇与贝伐单抗的纳米颗粒)治疗的无胸腺裸鼠中ab纳米颗粒的体内测试。在治疗后第7天数据表示为肿瘤尺寸相对于基线(治疗当天的肿瘤尺寸)的变化百分比。学生t检验用于确定显著性。在给药ab颗粒之后肿瘤尺寸的变化均显著不同于pbs、单独的各个药物和按顺序给药的两种药物。不同尺寸的ab颗粒之间的差异不显著。
图3e示出了在图3d中分析的小鼠的中位存活期而生成的卡普兰-迈耶曲线。使用比较存活曲线的mantle-cox检验确定显著性。
图4a示出了abx或ab160组中在静脉注射有30mg/kg的紫杉醇之后在0-24小时，基于从不具有肿瘤的小鼠和具有肿瘤的小鼠中抽取的血液和肿瘤样品，并且通过lc-ms测量得到的血液紫杉醇浓度，以线图显示，其中y轴以对数标度计。在时刻0时对小鼠进行静脉注射，其中在0、4、8、12和24小时的时间点时取血液样品并处死小鼠。每个时间点至少有3只小鼠。学生t检验用于确定abx和ab160之间浓度的任何差异是否显著。
图4b示出了图4a中的血液紫杉醇浓度，以线图显示，其中y轴以数值标度计。
图4c示出了由图4a和图4b中提供的血液浓度数据计算得到的c最大、半衰期和auc值。
图4d示出了使用较早时间点(2至8小时)的来自第二药代动力学实验的血液紫杉醇浓度，以线图显示，其中y轴以对数标度计。
图4e示出了图4d中的血液紫杉醇浓度，以线图显示，其中y轴以数值标度计。
图4f示出了在注射abx和ab160之前允许肿瘤生长至较大尺寸的小鼠的血液紫杉醇浓度。
图4g示出了由图4f的数据计算得到的c最大和auc。
图4h示出了通过lc-ms测定的来自第二小鼠实验的肿瘤中的紫杉醇浓度。数据显示为μg紫杉醇/mg肿瘤组织。学生t检验用于确定差异是否显著。
图4i示出了相对于单独的abx，用ab160治疗的小鼠中i-125放射性水平。
图4j示出了图4i所示的i-125放射性水平的图示。
图5a示出了用利妥昔单抗制备的纳米颗粒的粒度测量和亲和力。10mg/ml的abx与0-10mg/ml的利妥昔单抗(rit)一起孵育，并且光散射技术(mastersizer2000)用于测定所得粒度。数据显示为每一尺寸下颗粒的体积百分比，并且曲线表示粒度分布(上图)。表格(下图)表示出了每一抗体浓度下所得颗粒的尺寸。
图5b示出了用曲妥珠单抗制备的纳米颗粒的粒度测量和亲和力。10mg/ml的abx与0-22mg/ml的曲妥珠单抗(her)一起孵育，并且光散射技术(mastersizer2000)用于测定所得粒度。数据显示为每一粒度下颗粒的体积百分比，并且曲线表示粒度分布(上图)。表格(下图)表示出了每一抗体浓度下所得颗粒的尺寸。
图5c示出了通过生物层干涉(blitz)技术测定的利妥昔单抗和曲妥珠单抗相比于ph3、5、7和9下的abx的结合亲和力。显示了每个相互作用的解离常数。
图6a示出了如用cd20阳性daudi人淋巴瘤细胞系所测定的arl60的体外毒性。数据显示于增殖指数图中，其为处理孔中fitc阳性细胞相对于未处理孔中fitc阳性细胞的百分比(最高增殖水平)。
图6b示出在右侧腹注射有5×106daudi人淋巴瘤细胞的无胸腺裸鼠的体内肿瘤功效。允许肿瘤生长至600mm3至900mm3，并用pbs、30mg/kgabx、12mg/kg利妥昔单抗、12mg/kg利妥昔单抗+30mg/kgabx或arl60治疗小鼠。在治疗后第7天通过肿瘤尺寸从治疗第一天起变化的百分比来测定肿瘤反应。通过学生t检验确定显著性；经arl60治疗的小鼠相对于基线的变化百分比与所有其它组相对于基线的变化百分比显著不同的(p<0.0001)。
图6c示出了由图6b所示的实验生成的卡普兰-迈耶存活曲线。示出了每个治疗组的中位存活期。使用mantle-cox检验来确定存活曲线差异是否显著。
图7a示出了向ab160添加另一种化疗药物(顺铂)。abx(5mg/ml)与顺铂(0.5mg/ml)在室温下一起孵育30分钟，并且在除去abx颗粒后通过hplc测量上清液中的游离顺铂。由起始浓度减去游离顺铂的量以确定结合至abx的顺铂的量。该数据连同起始浓度(顺铂)一起显示于柱形图中。
图7b示出了在a375人黑素瘤细胞的增殖测定中顺铂结合的abx(ac)的毒性。在药物暴露和edu结合24小时之后，将细胞固定、透性化并用fitc缀合的抗edu抗体标记。该数据显示于增殖指数图中，其为处理孔中fitc阳性细胞相比于未处理孔中fitc阳性细胞的百分比(最高增殖水平)。
图7c示出了在右侧腹注射有1×106a375人黑素瘤细胞的无胸腺裸鼠中ac(abc复合物；顺铂结合的abx)的体内肿瘤功效。允许肿瘤生长至600mm3至900mm3，并用pbs、30mg/kgabx、2mg/kg顺铂、ab160、2mg/kg顺铂+ab160或abc160治疗小鼠。在治疗后第7天通过肿瘤尺寸从治疗当日起变化的百分比来测定肿瘤反应。通过学生t检验确定显著性；经abc160治疗的小鼠相对于基线的变化百分比与经pbs、顺铂或abx治疗的小鼠相对于基线的变化百分比显著不同(p<0.0001)。治疗后第7天从基线变化的百分比在ab160、ab160+顺铂以及abc160治疗组之间不存在显著性差异。
图7d示出了基于图7c所示的实验生成的卡普兰-迈耶存活曲线，并示出了每个治疗组的中位存活期。使用mantle-cox检验来确定存活曲线差异是否显著。
图8a示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存一个月然后复溶的ab160纳米颗粒的尺寸分布。
图8b示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存一个月然后复溶的ab160纳米颗粒的配体(vegf)结合能力。
图8c示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存一个月然后复溶的ab160纳米颗粒的体外癌细胞毒性。
图8d示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存十个月然后复溶的ab160纳米颗粒的尺寸分布。
图8e示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存十个月然后复溶的ab160纳米颗粒的配体(vegf)结合能力。
图8f示出了相比于新鲜的ab160或单独的abx，冻干后在室温下储存十个月然后复溶的ab160纳米颗粒的体外癌细胞毒性。
图9a-9c示出了在静脉输注条件(abx最终浓度为5mg/ml)下于室温在盐水中孵育至多24小时abx-bev复合物的尺寸分布(图9a和图9b)。在室温下孵育4小时时，elisa分析表明存在一些复合物分解(20％，图9c)的证据。
图10示出了abx(上图)或ab160(下图)在相对体积比为9:1或1:1的盐水或肝素化人血浆中体外孵育30秒。
图11a-11e示出了在右侧腹注射有1×106a375人黑素瘤细胞并用pbs(图11a)、12mg/kgbev(图11b)、30mg/kgabx(图11c)、ab160(图11d)治疗或用01.2mg/kgbev预治疗，并且24h后用ab160(图11e)治疗的无胸腺裸鼠的体内测试。数据表示治疗后第7天和治疗第10天以mm3计的肿瘤体积。
图11f汇总了来自图11a-11e的治疗后第7天的数据。
图11g汇总了来自图11a-11e的治疗后第10天的数据。
图12示出了通过流式细胞术分析得到的实验结果，其中cd20阳性daudi淋巴瘤细胞在组f和a中分别用荧光标记的抗人cd20或同种型匹配的对照标记。在其它组中，在cd20标记之前，daudi细胞用
图13是图12散点图的柱状图叠加。
图14a-14b示出了单独的abx相对于刚制备和冻干的ar(图14a)和at(图14b)的粒度比较。
图15在daudi细胞增殖测定中比较了abx和ar颗粒的毒性。
图16a-16c示出了从用标记
图17示出了用单剂量盐水、bev24(24mg/kg)、abx30(30mg/kg)、ab160(12mg/kgbev和30mg/kgabx)和ab225(24mg/kgbev和30mg/kgabs)治疗的小鼠的存活期。在给药后第30天时，用ab225和用ab160治疗的小鼠的存活期远远超过用单独的
具体实施方式
在阅读本具体实施方式后，如何在各种另选的实施方案和另选的应用中实现本发明对于本领域的技术人员来说将变得显而易见。然而，本文不会描述本发明的所有不同实施方案。应当理解，本文提出的实施方案仅以举例的方式呈现，并不旨在进行限制。由此，各种另选的实施方案的具体描述不应理解为限制如下所述本发明的范围或广度。
在公开和描述本发明之前，应当理解下述方面不限于特定的组合物，制备此类组合物的方法或其用途，所述组合物，制备此类组合物的方法或其用途同样可以改变。还应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定方面的目的并不旨在进行限制。
为了便于读者阅读，将本发明的具体实施方式分成多个部分，并且存在于任何部分的公开内容可与另一部分中的公开内容相结合。为了读者的方便，标题或小标题可用于本说明书中，而不旨在影响本发明的范围。
定义
除非另有定义，本文所用的全部技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。在本说明书和下面的权利要求书中，将参考具有以下含义的许多术语：
本文使用的术语仅为了描述具体实施方案并不旨在限制本发明。如本文所用，除非上下文明确地另外指出，单数形式“一”、“一种”和“所述”(“a”，“an”，“the”)也旨在包括复数形式。
“任选的”或“任选地”意指随后描述的事件或情况可能或不可能发生，并且该描述包括其中事件或情况发生的情形以及其中事件或情况不发生的情形。
术语“约”当用于数字标识(例如温度、时间、量、浓度以及其它)之前包括表示近似值的范围，其可在正负10％、正负5％、正负1％或其间的任何子范围或子值的范围内发生改变。优选地，术语“约”当针对剂量使用时意指剂量可改变+/-10％。例如，“约400至约800个结合剂”表示纳米颗粒的外表面包括介于360和880个颗粒之间量的结合剂。
“包含”或“包括”旨在意指组合物和方法包括所列举的要素，但不排除其它要素。“基本上由…组成”当用于限定组合物和方法时将意指排除出于所述目的对组合而言任何本质上显著的其它要素。因此，基本上由如本文所定义的要素组成的组合物不排除不会显著影响本发明要求保护的基本特征和新颖性特征的其它材料或步骤。“由…组成”应当意指排除超出痕量要素的其它成分和基本方法步骤。由这些过渡术语中的每一者限定的实施方案均在本发明的范围内。
如本文所用，术语“纳米颗粒”是指至少一个维度小于5微米的颗粒。在诸如用于静脉内给药的优选实施方案中，纳米颗粒小于1微米。对于直接给药而言，纳米颗粒较大。本发明明确地提出了甚至更大的颗粒。
在颗粒群中，单个颗粒的尺寸围绕一均值分布。因此，颗粒群的粒度可由均值表示，也可由百分率表示。d50是如下粒度，50％颗粒落入低于该粒度的范围。10％颗粒小于dio值，并且90％颗粒小于d90。在不清楚的情况下，“平均”尺寸等同于d50。因此，例如，ab160和ar160是指具有160纳米的平均尺寸的纳米颗粒。
术语“纳米颗粒”也可涵盖较小单元纳米颗粒的离散多聚体。例如，320nm颗粒包括160nm纳米颗粒单元的二聚体。因此，对于160nm纳米颗粒而言，多聚体将为大约320nm、480nm、640nm、800nm、960nm、1120nm等等。
如本文所用，术语“载体蛋白”是指起到输送结合剂和/或治疗剂作用的蛋白质。本文公开的结合剂可以可逆地结合至载体蛋白。载体蛋白的实例在下文更详细地论述。
如本文所用，术语“核心”是指纳米颗粒的中心或内部部分，其可由载体蛋白、载体蛋白和治疗剂或其它药剂或药剂的组合构成。在一些实施方案中，结合剂的疏水部分可结合至所述核心中。
如本文所用，术语“治疗剂”意指在治疗上有用的试剂，例如，用于治疗、缓解或减弱疾病状态、生理条件、症状或致病因素的试剂，或者用于评估或诊断的试剂。治疗剂可为化疗剂，例如有丝分裂抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、类固醇、抗肿瘤抗生素、抗代谢剂、烷化剂、酶、蛋白酶体抑制剂或它们的任何组合。
如本文所用，术语“结合剂”、“……特异性结合剂”或“特异性结合……的结合剂”是指结合至靶抗原但不显著结合至不相关化合物的试剂。可有效地用于所公开方法中的结合剂的实例包括但不限于：凝集素、蛋白质和抗体(诸如单克隆抗体如人源化单克隆抗体、嵌合抗体或多克隆抗体)或其抗原结合片段以及适体、fc结构域融合蛋白以及具有或融合至疏水蛋白结构域(例如fc结构域)的适体等。在一个实施方案中，结合剂是外源抗体。外源抗体为在哺乳动物中非天然产生的抗体，例如在人类中通过哺乳动物的免疫系统产生。
如本文所用，术语“抗体”(“antibody”或“antibodies”)是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的免疫活性部分(即，包含免疫特异性结合抗原的抗原结合位点的分子)。该术语还指由两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链以及包括全长抗体以及它们的各个部分在内的多种形式构成的抗体；包括例如免疫球蛋白分子、单克隆抗体、嵌合抗体、cdr-接枝抗体、人源化抗体、fab、fab'、f(ab')2、fv、二硫键连接的fv、scfv、单结构域抗体(dab)、双价抗体、多特异性抗体、双重特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体、其功能活性表位结合片段、双功能杂交抗体(例如lanzavecchiaetal.,eur.jimmunol.17,105(1987)(lanzavecchia等人，《欧洲免疫学杂志》，第17卷，第105期，1987年))以及单链(例如，hustonetal.,proc.natlacad.sei.us.a.,85,5879-5883(1988)(huston等人，《美国国家科学院院刊》，第85卷，第5879-5883页，1988年)和birdetal.,science242,423-426(1988)(bird等人，《科学》，第242卷，第423-426页，1988年)，这些文献以引用方式并入本文)。(一般参见，hoodetal.,immunology,benjamin,n.y.,2nded.(1984)(hood等人，《免疫学》，benjamin，纽约州，第2版，1984年)；harlowandlane,antibodies.alaboratorymanual,coldspringharborlaboratory(1988)(harlow和lane，《抗体：实验室手册》，冷泉港实验室出版社，1988年)；hunkapillerandhood,nature,323,15-16(1986)(hunkapiller和hood，《自然》，第323卷，第15-16页，1986年)，这些文献以引用的方式并入本文)。抗体可为任何类型(例如igg、iga、igm、ige或igd)。优选地，抗体为igg抗体。抗体可为非人抗体(例如来自小鼠、山羊或任何其它动物)、全人抗体、人源化抗体或嵌合抗体。抗体包括本文所公开抗体的任何生物仿制药。如本文所用，生物仿制药是指认为其品质、安全性和功效与原创公司出售的参比制剂相当的生物药物(公共保健服务法(42u.s.c.262(i))的第351(i)部分)。
术语“解离常数”也被称为“kd”，是指表达特定物质分解成单个组分(例如蛋白载体、抗体和任选的治疗剂)的程度的量。
如本文所用，术语“冻干”(“lyophilized”、“lyophilization”)等是指首先冷冻待干燥的材料(例如纳米颗粒)，并且然后通过在真空环境中升华除去冰或冷冻溶剂这一过程。赋形剂任选地包括在预冻干的制剂中以增强冻干的产品在储存时的稳定性。在一些实施方案中，纳米颗粒在用作治疗剂之前可由冻干的组分(载体蛋白、抗体和任选的治疗剂)形成。在其它实施方案中，载体蛋白、结合剂(例如抗体)和任选的治疗剂首先组合成纳米颗粒，并且然后被冻干。冻干的样品还可包含额外的赋形剂。
术语“增量剂”包括提供冷冻干燥产品结构的试剂。用作增量剂的常见实例包括甘露醇、甘氨酸、乳糖和蔗糖。除了提供药学上优质的饼状物之外，增量剂也可赋予有关改变塌缩温度、提供冻融保护以及提高蛋白质在长期储存期间的稳定性的有用品质。这些试剂也可用作张度调节剂。
术语“缓冲液”涵盖在冻干之前将溶液ph维持在可接受范围内的那些试剂，并且可包括琥珀酸盐(琥珀酸钠或琥珀酸钾)、组氨酸、磷酸盐(磷酸钠或磷酸钾)、三(三(羟甲基)氨基甲烷)、二乙醇胺、柠檬酸盐(柠檬酸钠)等。本发明的缓冲液具有在约5.5至约6.5范围内的ph；并且优选地具有约6.0的ph。将ph控制在此范围内的缓冲液的实例包括琥珀酸盐(诸如琥珀酸钠)、葡糖酸盐、组氨酸、柠檬酸盐以及其它有机酸缓冲液。
术语“冷冻保护剂”通常包括为蛋白质提供抵抗冷冻诱导的应力的稳定性的试剂，推测该冷冻保护剂通过优先从蛋白质表面排除而发挥作用。它们也可在初级和次级干燥以及长期产品储存期间提供保护。实例为诸如葡聚糖和聚乙二醇之类的聚合物；诸如蔗糖、葡萄糖、海藻糖和乳糖之类的糖类；诸如聚山梨酸酯之类的表面活性剂；以及诸如甘氨酸、精氨酸和丝氨酸之类的氨基酸。
术语“冻干的保护剂”包括在干燥或“脱水”过程(初级和次级干燥循环)中为蛋白质提供稳定性的试剂，推测该冻干保护剂通过提供无定形玻璃态基质和通过氢键与蛋白质结合，从而替代在干燥过程期间除去的水分子来发挥作用。这有助于维持蛋白质构象，在冻干循环期间使蛋白质降解最小化并改善长期产品。实例包括多元醇或诸如蔗糖和海藻糖之类的糖类。
术语“药物制剂”是指如下制剂，所述制剂在该形式中允许活性成分有效，并且其不含对给药该制剂的个体有毒的其他组分。
“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可合理地给药给个体哺乳动物以提供所使用的活性成分的有效剂量的那些赋形剂。
“复溶时间”是使冻干的制剂再水合成溶液所需的时间。
“稳定的”制剂是储存之后其中蛋白质基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。例如，用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术可从本领域获得，并在peptideandproteindrugdelivery,247-301,vincentleeed.,marceldekker,inc.,newyork,n.y.,pubs.(1991)(《肽和蛋白质药物递送》，第247-301页，vincentlee编辑，marceldekker,inc.出版社，,美国纽约州纽约，1991年)和jones,a.adv.drugdeliveryrev.10:29-90(1993)(jones，a.，《先进药物递送综述》，第10卷，第29-90页，1993年)中概述。稳定性可在所选温度下测量所选时间段。
如本文所用，术语“表位”是指由结合剂(例如抗体)识别的抗原部分。表位包括但不限于能够与蛋白质(例如抗体)或配体特异性相互作用的短氨基酸序列或肽(任选地糖基化或以其它方式修饰)。例如，表位可为结合剂的抗原结合位点所连接分子的一部分。
术语“治疗”(“treating”或“treatment”)涵盖治疗个体(诸如人类)的疾病或病症(例如癌症)，并包括：(i)抑制疾病或病症，即阻止其发展；(ii)缓解疾病或病症，即，使病症好转；(iii)减慢病症进程；和/或(iv)抑制、缓解或减慢疾病或病症中的一种或多种症状的进程。在一些实施方案中，“治疗”(“treating”或“treatment”)是指杀死癌细胞。
关于癌症治疗的术语“杀死”(“kill”或“killing”)是指包括导致癌细胞或癌细胞群的至少一部分死亡的任何类型的处理方式。
术语“适体”是指能够结合至目标分子(诸如多肽)的核酸分子。例如，本发明的适体可特异性地结合至例如cd20、cd38、cd52、pd-l1、ly6e、her2、her3/egfrdaf、erbb-3受体、csf-1r、steap1、cd3、cea、cd40、ox40、ang2-vegf和vegf。具有特定结合特异性的抗体的产生以及适体的治疗性用途在本领域中完整阐述。参见例如，美国专利5,475,096、美国专利5,270,163、美国专利5,582,981、美国专利5,840,867、美国专利6,011,020、美国专利6,051,698、美国专利6,147,204、美国专利6,180,348和美国专利6,699,843，以及用于治疗年龄相关的黄斑变性的
如本文所用，术语“低聚物”或“低聚的”(“oligomeric”或“oligomerized”是指由两个或更多个单体组成的低聚物。
fc融合蛋白是将抗体的可结晶片段(fc)结构域与另一种生物活性剂(例如蛋白结构域、肽、或核酸或肽适体)接合以产生具有期望结构功能特性和显著治疗潜能的生物工程多肽。γ免疫球蛋白(igg)同种型由于其有利特性(例如效应子功能的募集以及血浆半衰期延长)通常用作产生fc融合蛋白的基础。考虑到适体的范围，肽和核酸两者均可用作融合搭档，fc融合蛋白具有多种生物和药物应用。
另外，本说明书中使用的一些术语更具体地如下进行定义。
概述
本发明部分地基于如下令人惊奇的发现，任选地冻干的纳米颗粒为肿瘤提供靶向疗法，同时使对患者的毒性最小化，该任选地冻干的纳米颗粒包括载体蛋白、结合剂(例如抗体)、适体或具有疏水结构域和结合结构域的融合蛋白(例如融合至适体或细胞受体的配体的fc结构域)以及治疗剂。因此，如本文所述的纳米颗粒是相对于常规adc的显著改进。
为了使常规adc有效，重要的是连接体足够稳定，以使得不在全身循环中解离但允许在肿瘤部位充分释放药物。alley,s.c.,etal.(2008)bioconjugchem19:759-765(alley,s.c.等人，2008年，《生物缀合化学》，第19卷，第759-765页)。已证明这是开发有效药物缀合物中的主要障碍(julien,d.c.,etal.(2011)mabs3:467-478(julien,d.c.等人，2011年，《mabs》，第3卷，第467-478页)；alley,s.c.,etal.(2008)bioconjugchem19:759-765(alley,s.c.等人，2008年，《生物缀合化学》，第19卷，第759-765页))；因此，纳米免疫缀合物的最吸引人的特征是生物化学连接体不是必需的。
当前adc的另一个缺点是基本上尚未在人肿瘤中证明更多药物渗透到肿瘤中。小鼠模型中adc的早期测试表明，用抗体靶向肿瘤将导致活性剂在肿瘤中浓度较高(deguchi,t.etal.(1986)cancerres46:3751-3755(deguchi,t.等人，1986年，《癌症研究》，第46卷，第3751-3755页))；然而，这与人疾病的治疗不相关，可能是因为人肿瘤的渗透性比小鼠肿瘤更加异质。jain,r.k.etal.(2010)natrevclinoncol7:653-664(jain,r.k.等人，2010年，《自然评论临床肿瘤学》，第7卷，第653-664页)。另外，纳米颗粒的尺寸对于从脉管外渗到肿瘤中是至关重要的。在使用人结肠腺癌异种移植模型的小鼠研究中，脉管孔可渗透至多400nm的脂质体。yuan,f.,etal.(1995)cancerres55:3752-3756(yuan,f.等人，1995年，《癌症研究》，第55卷，第3752-3756页)。肿瘤孔径和渗透性的另一项研究表明，这两种特征取决于肿瘤位置和生长状态，其中消退肿瘤和颅内肿瘤可渗透至小于200nm的颗粒。hobbs,s.k.,etal.(1998)procnatlacadseiusa95:4607-4612(hobbs,s.k.等人，1998年，《美国国家科学院院刊》，第95卷，第4607-4612页)。本文所述的纳米免疫缀合物克服了该问题，因为小于200nm完整的大复合物在全身循环中部分地解离成能够容易地渗透肿瘤组织的较小功能单元。此外，一旦缀合物到达肿瘤部位，就可释放较小毒性有效载荷，并且肿瘤细胞只需摄取毒性部分而非整个缀合物。
抗体(即
当白蛋白和结合剂(例如抗体)的组合物在水溶液中以特定浓度和比率混合在一起时，可用于本发明的结合剂自发地自组装成白蛋白并组装到白蛋白上以形成具有多个结合剂副本(至多500个或更多)的纳米颗粒。不受任何理论的限制，预期结合剂(例如抗体或适体或fc融合分子)的抗原(或配体)受体部分从纳米颗粒向外定位，而结合剂的疏水尾通过疏水-疏水相互作用整合到白蛋白中。
虽然包含单一来源蛋白的蛋白质组合物通常以冻干的形式储存，在这种情况下这些组合物表现出较长的保质期，但此类冻干的组合物不包含通过疏水-疏水相互作用整合在一起的两种不同蛋白质的自组装纳米颗粒。此外，其中结合剂的大部分结合部分暴露在纳米颗粒表面上的纳米颗粒构造使其自身易受在其他被认为是良性的环境下进行的移位或重构的影响。例如，在冻干期间，使蛋白质上的离子电荷脱水，从而暴露下面的电荷。暴露的电荷允许这两种蛋白质之间发生电荷-电荷相互作用，这可改变每种蛋白质与另一种蛋白质的结合亲和力。此外，纳米颗粒的浓度随着溶剂(例如水)的除去而显著增加。纳米颗粒的这种浓度增加可导致不可逆的低聚化。低聚化是蛋白质的已知特性，与单体形式相比其降低了低聚物的生物特性并使颗粒的尺寸增加有时超过1微米。
另一方面，临床和/或商业用途需要稳定形式的纳米颗粒组合物，其中需要至少3个月的保质期，并优选地大于6个月或9个月的保质期。此类稳定的组合物必须容易地用于静脉注射，在静脉注射时必须保持其自组装形式以便将纳米颗粒引导至体内预定部位，必须具有小于1微米的最大尺寸以便当递送到血流中时避免任何局部缺血事件，并且最后必须与用于注射的水性组合物相容。
化合物
如在阅读本文公开的内容后对本领域技术人员而言明显的是，本文公开的内容涉及包含载体蛋白、结合剂和任选地至少一种治疗剂的纳米颗粒组合物，其中所述组合物任选地被冻干。
在一些实施方案中，载体蛋白可为白蛋白、明胶、弹性蛋白(包括弹性蛋白原)或弹性蛋白衍生多肽(例如α-弹性蛋白和弹性蛋白样多肽(elp))、麦胶蛋白、豆球蛋白、玉米蛋白、大豆蛋白(例如大豆分离蛋白(spi))、牛奶蛋白(例如β-乳球蛋白(blg)和酪蛋白)或乳清蛋白(例如乳清浓缩蛋白(wpc)和乳清分离蛋白(wpi))。在优选的实施方案中，载体蛋白是白蛋白。在优选的实施方案中，白蛋白是蛋清(卵清蛋白)、牛血清白蛋白(bsa)等。在甚至更优选的实施方案中，载体蛋白是人血清白蛋白(hsa)。在一些实施方案中，载体蛋白通常被视为由美国食品药品监督管理局(fda)批准的安全(gras)赋形剂。
在一些实施方案中，结合剂为选自ado-曲妥珠单抗艾美坦辛、阿仑单抗、贝伐单抗、西妥昔单抗、狄诺塞麦、地努图希单抗、易普利姆玛、纳武单抗、奥比妥珠单抗、奥法木单抗、帕尼单抗、帕姆单抗、帕妥珠单抗、利妥昔单抗和曲妥珠单抗的抗体。在一些实施方案中，抗体为纳米颗粒的全部或部分表面上的基本上单层的抗体。
表1示出了抗体的非限制性列表。
表1：抗体
在一些实施方案中，所述至少一种治疗剂选自：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西他塞、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、紫杉醇、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、赛特铂、索拉非尼、威罗菲尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂(triplatin)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。
表2示出了癌症治疗剂的非限制性列表。
表2：癌症治疗剂
应当理解，治疗剂可定位在纳米颗粒内部、纳米颗粒的外表面上、或两者。纳米颗粒可包含多于一种治疗剂，例如两种治疗剂、三种治疗剂、四种治疗剂、五种治疗剂或更多种。此外，纳米颗粒可包含在纳米颗粒内部和外部的相同或不同的治疗剂。
在本发明的一些实施方案中，排除包含abraxane和贝伐单抗的纳米颗粒。
在一个方面，纳米颗粒包含至少100个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少200个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少300个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少400个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少500个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含至少600个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。
在一个方面，纳米颗粒包含约100个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含介约200个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约300个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约400个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约500个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约600个至约1000个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约200个至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在一个方面，纳米颗粒包含约300个至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。在优选的实施方案中，纳米颗粒包含约400个至约800个非共价结合至纳米颗粒表面的结合剂。预期值包括任何值或任何列举范围内的子范围(包括端值)。
在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度小于约1μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约1μm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约900nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约800nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约700nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约600nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约500nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约400nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约300nm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约130nm和约200nm之间。在一个优选的实施方案中，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约150nm和约180nm之间。在一个特别优选的实施方案中，纳米颗粒组合物的平均粒度为约160nm。预期值包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
在一个方面，纳米颗粒组合物被配制成用于静脉注射。为了避免局部缺血事件，被配制成用于静脉注射的纳米颗粒组合物应包括平均粒度小于约1μm的纳米颗粒。
在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度大于约1μm。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约1μm和约5μm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约1μm和约4μm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约1μm和约3μm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约1μm和约2μm之间。在一个方面，纳米颗粒组合物的平均粒度介于约1μm和约1.5μm之间。预期值包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
在一个方面，纳米颗粒组合物被配制成用于直接注射到肿瘤中。直接注射包括注射到肿瘤部位或肿瘤部位近侧、灌注到肿瘤中等。当被配制成用于直接注射到肿瘤中时，纳米颗粒可具有任何平均粒度。不受理论的约束，较大的颗粒(例如大于500nm、大于1μm等)被认为更有可能固定在肿瘤内，从而提供有益效果。较大的颗粒可积聚在肿瘤或特定器官中。参见例如，用于注入给养肝脏肿瘤的肝动脉中的20-60微米的玻璃颗粒被称为
在一个方面，所述组合物内小于约0.01％的纳米颗粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一个方面，所述组合物内小于约0.001％的纳米颗粒具有大于200nm、大于300nm、大于400nm、大于500nm、大于600nm、大于700nm或大于800nm的粒度。在一个优选的实施方案中，所述组合物内小于约0.01％的纳米颗粒具有大于800nm的粒度。在一个更优选的实施方案中，所述组合物内小于约0.001％的纳米颗粒具有大于800nm的粒度。
在一个优选的方面，本文列举的尺寸和尺寸范围涉及复溶的冻干纳米颗粒组合物的粒度。也就是说，在冻干的纳米颗粒重悬浮于水溶液(例如水、其它药学上可接受的赋形剂、缓冲液等)中之后，粒度或平均粒度在本文列举的范围内。
在一个方面，至少约50％、60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％或99.9％的纳米颗粒在复溶组合物中作为单个纳米颗粒存在。也就是说，少于约50％、40％、30％等的纳米颗粒是二聚或多聚的(低聚的)。
在一些实施方案中，所述组合物中小于20％的纳米颗粒被二聚化、小于10％的纳米颗粒被二聚化、并且优选地小于5％的纳米颗粒被二聚化。
在一些实施方案中，纳米颗粒的尺寸可通过调节载体蛋白与结合剂的量(例如比率)来控制。纳米颗粒的尺寸和尺寸分布也很重要。本发明的纳米颗粒可根据它们的尺寸而起到不同作用。在大尺寸下，团聚体可堵塞血管。因此，纳米颗粒团聚体可影响所述组合物的性能和安全性。另一方面，较大的颗粒在某些条件下可能具有更高疗效(例如，当不在静脉内给药时)。
在一个方面，纳米颗粒组合物包含至少一种额外的治疗剂。在一个实施方案中，所述至少一种额外的治疗剂非共价结合至纳米颗粒的外表面。在一个实施方案中，所述至少一种额外的治疗剂布置在纳米颗粒的外表面上。在一个实施方案中，所述至少一种额外的治疗剂选自：阿比特龙、苯达莫司汀、硼替佐米、卡铂、卡巴他赛、顺铂、苯丁酸氮芥、达沙替尼、多西他塞、多柔比星、表柔比星、厄洛替尼、依托泊苷、依维莫司、吉西他滨、吉非替尼、伊达比星、伊马替尼、羟基脲、伊马替尼、拉帕替尼、亮丙瑞林、美法仑、甲氨蝶呤、米托蒽醌、奈达铂、尼罗替尼、奥沙利铂、帕唑帕尼、培美曲塞、吡铂、罗米地辛、赛特铂、索拉非尼、威罗菲尼、舒尼替尼、替尼泊苷、三铂(triplatin)、长春碱、长春瑞滨、长春新碱和环磷酰胺。在一个实施方案中，所述至少一种额外的治疗剂为抗癌结合剂，例如抗癌抗体。
制备纳米颗粒的方法
在一些方面，本发明涉及制备如本文所述的纳米颗粒组合物的方法。
在一个方面，纳米颗粒组合物的纳米颗粒是通过使载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂以约10:1至约10:30载体蛋白颗粒或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂的比率接触而形成的。在一个实施方案中，该比率为约10:2至约10:25。在一个实施方案中，该比率为约10:2至约1:1。在一个优选的实施方案中，该比率为约10:2至约10:6。在一个特别优选的实施方案中，该比率为约10:4。预期比率包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
在一个实施方案中，用于形成纳米颗粒的溶液或其它液体介质的量特别重要。在载体蛋白(或载体蛋白-治疗剂)和抗体的过稀溶液中未形成纳米颗粒。过度浓缩溶液将产生未结构化的聚集体。在一些实施方案中，所采用溶液(例如无菌水、盐水、磷酸盐缓冲盐水)的量为约0.5ml溶液至约20ml溶液。在一些实施方案中，载体蛋白的量介于约1mg/ml和约100mg/ml之间。在一些实施方案中，结合剂的量介于约1mg/ml和约30mg/ml之间。例如，在一些实施方案中，载体蛋白：结合剂：溶液的比率为大约9mg载体蛋白(例如白蛋白)：4mg结合剂(例如抗体例如bev)：1ml溶液(例如盐水)。一定量的治疗剂(例如紫杉醇)也可加入载体蛋白中。例如，可将1mg紫杉醇加入9mg载体蛋白(10mg载体蛋白-治疗剂)和4mg结合剂(例如抗体、fc融合分子或适体)的1ml溶液中。当使用例如盛有大约1升溶液的典型静脉注射袋时，相比于用于1ml溶液的量，需要使用1000倍载体蛋白/载体蛋白-治疗剂和抗体的量。因此，本发明的纳米颗粒不能在标准静脉注射袋中形成。此外，当组分以本发明的治疗量加入标准静脉注射袋中时，这些组分不会自组装以形成纳米颗粒。
在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约4至约8的溶液中接触。在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约4的溶液中接触。在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约5的溶液中接触。在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约6的溶液中接触。在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约7的溶液中接触。在一个实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约8的溶液中接触。在一个优选的实施方案中，载体蛋白或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在ph为约5至约7之间的溶液中接触。
在一个实施方案中，载体蛋白颗粒或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在约5℃至约60℃的温度条件下或其任何范围、子范围或所述范围内值(包括端值)的温度下孵育。在一个优选的实施方案中，载体蛋白颗粒或载体蛋白-治疗剂颗粒与结合剂在约23℃至约60℃的温度下孵育。
不受理论的约束，纳米颗粒组合物内纳米颗粒的稳定性被认为至少部分取决于形成纳米颗粒的温度和/或ph，以及溶液中组分(即载体蛋白、结合剂和任选地治疗剂)的浓度。在一个实施方案中，纳米颗粒的kd介于约1×10-11m和约2×10-5m之间。在一个实施方案中，纳米颗粒的kd介于约1×10-11m和约2×10-8m之间。在一个实施方案中，纳米颗粒的kd介于约1×10-11m和约7×10-9m之间。在一个优选的实施方案中，纳米颗粒的kd介于约1×10-11m和约3×10-8m之间。预期值包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
冻干
本发明的冻干的组合物是通过标准冻干技术在存在或不存在稳定剂、缓冲液等的情况下制备的。令人惊讶的是，这些条件不改变纳米颗粒相对易碎的结构。此外，最好的是，这些纳米颗粒在冻干后保持其尺寸分布，并且更重要的是，这些纳米颗粒可复溶以与新鲜制备的纳米颗粒基本上相同的形式和比率体内给药(例如静脉内递送)。
制剂
在一个方面，纳米颗粒组合物被配制成用于全身递送，例如静脉内给药。
在一个方面，纳米颗粒组合物被配制成用于直接注射到肿瘤中。直接注射包括注射到肿瘤部位或肿瘤部位近侧、灌注到肿瘤中等。因为纳米颗粒组合物不是全身给药，被配制成用于直接注射到肿瘤中的纳米颗粒组合物可具有任何平均粒度。不受理论的约束，较大的颗粒(例如大于500nm、大于1μm等)被认为更有可能固化在肿瘤中，从而提供更好的有益效果。
在另一个方面，本文提供了包含本文提供的化合物和至少一种药学上可接受赋形剂的组合物。
一般来讲，本文提供的化合物可被配制成用于通过任何可接受的给药模式给药于患者。本领域中已知各种制剂和药物递送系统。参见例如，gennaro,a.r.,ed.(1995)remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,mackpublishingco(gennaro,a.r.编辑，1995年，《remington氏药物科学》，第18版，mack出版公司)。
一般来讲，本文提供的化合物将作为药物组合物通过以下途径中的任何一条给药：口服、全身(例如透皮、鼻内给药或通过栓剂)或肠胃外给药(例如肌内、静脉内或皮下给药)。
所述组合物通常由本发明的化合物与至少一种药学上可接受的赋形剂构成。可接受的赋形剂无毒，有助于给药，并且不会不利地影响本发明要求保护的化合物的治疗有益效果。此类赋形剂可为任何固体、液体、半固体，或者在气溶胶组合物的情况下为本领域技术人员通常已知的气态赋形剂。
固体药物赋形剂包括：淀粉、纤维素、滑石、葡萄糖、乳糖、蔗糖、明胶、麦芽、大米、面粉、白垩、硅胶、硬脂酸镁、硬脂酸钠、单硬脂酸甘油酯、氯化钠、脱脂奶粉等。液体和半固体赋形剂可选自：甘油、丙二醇、水、乙醇和各种油类，包括石油、动物、植物或合成来源的那些油类，例如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。特别地用于可注射溶液的优选液体载体包括水、盐水、水性右旋糖以及二醇类。其它合适的药物赋形剂以及它们的制剂在remington'spharmaceuticalsciences,editedbye.w.martin(mackpublishingcompany,18thed.,1990)(《remington氏药物科学》，由e.w.martin编辑(mack出版公司，第18版，1990年))中描述。
如果需要，本发明的组合物可存在于一种或多种含有活性成分的单位剂型的包装或分配装置中。此类包装或装置可例如包括金属或塑料薄片(诸如泡罩包装或玻璃)，以及诸如小瓶中的橡胶塞。包装或分配装置可附带有给药说明书。也可制备包含配制在相容药物载体中的本发明化合物的组合物，将其置于适当容器中并标记治疗指定的病症。
治疗方法
本文所述的纳米颗粒组合物可用于治疗哺乳动物体内的癌细胞和/或肿瘤。在一个优选的实施方案中，所述哺乳动物是人(即人类患者)。优选地，冻干的纳米颗粒组合物在给药之前复溶(悬浮于水性赋形剂中)。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗癌细胞的方法，该方法包括使细胞与有效量的本文所述的纳米颗粒组合物接触以治疗癌细胞。癌细胞的治疗包括但不限于：增殖降低、杀死细胞、预防细胞转移等。
在一个方面，本文提供了一种用于治疗有此治疗需求的患者体内的肿瘤的方法，该方法包括向患者给药治疗有效量的本文所述的纳米颗粒组合物以治疗肿瘤。在一个实施方案中，肿瘤的尺寸有所减小。在一个实施方案中，肿瘤尺寸在治疗期间和/或治疗之后至少一段时间段内不再增大(即进展)。
在一个实施方案中，静脉内给药纳米颗粒组合物。在一个实施方案中，纳米颗粒组合物直接给药到肿瘤中。在一个实施方案中，通过直接注入或灌注到肿瘤中来给药纳米颗粒组合物。
在一个实施方案中，该方法包括：
a)每周一次给药纳米颗粒组合物，持续三周；
b)停止给药纳米颗粒组合物一周；以及
c)根据需要任选地重复步骤a)和b)以治疗肿瘤。
在一个实施方案中，本文所述的治疗有效量的纳米颗粒包含约1mg/m2至约200mg/m2的抗体，约2mg/m2至约150mg/m2、约5mg/m2至约100mg/m2、约10mg/m2至约85mg/m2、约15mg/m2至约75mg/m2、约20mg/m2至约65mg/m2、约25mg/m2至约55mg/m2、约30mg/m2至约45mg/m2或约35mg/m2至约40mg/m2的抗体。在其它实施方案中，治疗有效量包含约20mg/m2至约90mg/m2的抗体。在一个实施方案中，治疗有效量包含30mg/m2至约70mg/m2的抗体。在一个实施方案中，本文所述的治疗有效量的纳米颗粒包含约50mg/m2至约200mg/m2的载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。在优选的实施方案中，治疗有效量的纳米颗粒包含约75mg/m2至约175mg/m2载体蛋白或载体蛋白和治疗剂。预期值包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
在一个实施方案中，治疗有效量包含约20mg/m2至约90mg/m2的结合剂，例如抗体、适体或fc融合物。在一个优选的实施方案中，治疗有效量包含约30mg/m2至约70mg/m2的结合剂，例如抗体、适体或fc融合物。预期值包括任何值、子范围或任何列举范围内的范围(包括端值)。
可通过本文所述的组合物和方法治疗的癌症或肿瘤包括但不限于：胆道癌；脑癌(包括胶质母细胞瘤和成神经管细胞瘤)；乳腺癌；子宫颈癌；绒毛膜癌；结肠癌；子宫内膜癌；食道癌、胃癌；血液肿瘤(包括急性淋巴细胞性和骨髓性白血病)；多发性骨髓瘤；aids相关白血病和成人t细胞白血病淋巴瘤；上皮内肿瘤(包括博文氏病和佩吉特氏病)；肝癌(肝肿瘤)；肺癌；淋巴瘤(包括霍奇金氏病和淋巴细胞性淋巴瘤)；成神经细胞瘤；口腔癌(包括鳞状细胞癌)；卵巢癌(包括由上皮细胞、基质细胞、生殖细胞和间充质细胞产生的那些癌症)；胰腺癌；前列腺癌；直肠癌；肉瘤(包括平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、脂肪肉瘤、纤维肉瘤和骨肉瘤)；皮肤癌(包括黑素瘤、卡波西氏肉瘤、嗜碱细胞癌和鳞状细胞癌)；睾丸癌(包括生殖肿瘤(精原细胞瘤、非精原细胞瘤[畸胎瘤、绒毛膜癌])、间质瘤和生殖细胞瘤)；甲状腺癌(包括甲状腺腺癌和髓样癌)；以及肾癌(包括腺癌和肾母细胞瘤)。在重要的实施方案中，癌症或肿瘤包括乳腺癌、淋巴瘤、多发性骨髓瘤和黑素瘤。
一般来讲，本发明的化合物通过用于给药具有类似功效的试剂的任何可接受给药模式以治疗有效量给药。本发明化合物(即纳米颗粒)的实际量将取决于多种因素，诸如待治疗疾病的严重性、个体的年龄和相对健康状况、所用化合物的功效、给药路径和形式以及本领域技术人员熟知的其它因素。
此类试剂的有效量可通过常规实验容易地测定，如最有效且方便的给药途径以及最适当的制剂也可通过常规实验容易地测定。本领域中已知各种制剂和药物递送系统。参见例如，gennaro,a.r.,ed.(1995)remington'spharmaceuticalsciences,18thed.,mackpublishingco(gennaro,a.r.编辑，1995年，《remington氏药物科学》，第18版，mack出版公司)。
试剂(例如本发明的化合物)的有效量或治疗有效量或治疗有效剂量是指导致症状减轻或个体存活期延长的试剂或化合物的量。此类分子的毒性和疗效可通过细胞培养物或实验动物中的标准药物过程，例如通过测定ld50(50％群体的致死剂量)和ed50(50％群体的治疗有效剂量)来确定。毒性与治疗效果的剂量比率是治疗指数，其可表示为ld50/ed50比。表现出高治疗指数的试剂是优选的。
有效量或治疗有效量是研究人员、兽医、医师或其他临床医生寻找的引起组织、系统、动物或人类的生物学或医学反应的化合物或药物组合物的量。剂量可在该范围内变化，其取决于使用的剂型和/或所使用的给药途径。确切的制剂、给药途径、剂量和剂量时间间隔应当根据本领域已知的方法，参照个体的具体条件，进行选择。
剂量和时间间隔可单独进行调节，以提供足以达到期望效果的活性部分的血浆水平；即，最小有效浓度(mec)。每种化合物的mec可以是不同的，但可从例如体外数据和动物实验中估计得出mec。实现mec所必需的剂量取决于个体特征和给药途径。在局部给药或选择性摄入的情况下，药物的有效局部浓度可能不涉及血浆浓度。
实施例
使用由白蛋白结合紫杉醇(即
本领域的技术人员应当理解，制备和使用本实施例的纳米颗粒仅仅是出于举例说明的目的，并且本文公开的内容并不受限于该举例说明。
本文所用的任何缩写具有通常的科学含义。所有温度均以℃计，除非另有说明。在本文中，以下术语具有以下含义，除非另有定义：
实施例1：纳米颗粒的制备
将
为了用于人类，abx:bev复合物可通过以下方法制备：获得25mg/mlbev的合适剂量的4ml小瓶，并按照下面的指示将每个小瓶稀释至4mg/ml。abx的合适剂量的100mg小瓶可通过复溶至最终浓度为含有10mg/mlabx纳米颗粒中来制备。使用3ml无菌注射器，可在最小1分钟内抽出并缓慢注射1.6ml(40mg)贝伐单抗(25mg/ml)到容纳有100mg的abx的每个小瓶的内壁上。贝伐单抗溶液不应直接注射到冻干的饼状物上，因为这会导致发泡。然后，使用12ml无菌注射器，可在最小1分钟内抽出并缓慢注射8.4mlusp级0.9％氯化钠注射液到每个容纳有100mgabx和40mgbev的小瓶的内壁上。一旦完成1.6mlbev和8.4mlusp级0.9％氯化钠注射液的添加，就可轻轻搅动和/或缓慢倒置每个小瓶至少2分钟，直至完全溶解任何饼状物/粉末。应当避免生成泡沫。此时，每个小瓶的浓度应当为100mg/10mlabx和40mg/10ml的bev。容纳有abx和bev的小瓶应静置60分钟。应当轻轻搅动并且/或者每隔10分钟倒置小瓶，以继续混合该复合物。在经过60分钟之后，应从每个小瓶抽出所计算剂量体积的abx和bev，然后缓慢加入空viaflex袋中。然后加入等体积的usp级0.9％氯化钠注射液，以使得最终浓度为5mg/mlabx和2mg/mlbev。然后应轻轻搅动和/或缓慢倒置该袋保持1分钟以混合。abx:bev纳米颗粒在最终稀释之后可在室温下储存至多4个小时。
实施例2：abx和bev的体外结合
为了确定abx和bev是否发生相互作用，通过流式细胞术和电子显微镜法分析在实施例1中形成的纳米颗粒。
方法
流式细胞术：如上面的实施例1所述的那样来制备ab160。为了确定bev与abx的结合，在accuric6流式细胞分析仪(美国新泽西州富兰克林湖的碧迪医疗公司(bdfranklinlakes,nj))上进行ab160的可视化，并使用accuric6软件进行数据分析。用5μg链霉亲和素pe(美国马萨诸塞州坎布里奇的艾奕康公司(abeam,cambridge,ma))标记生物素酰化的(5μg)山羊抗小鼠igg(美国马萨诸塞州坎布里奇的艾奕康公司(abeam,cambridge,ma))。选择山羊抗小鼠igg来标记ab160，因为bev的fab部分来源于小鼠。abx和ab160与pe标记的山羊抗小鼠igg在室温下孵育30分钟，洗涤并通过流式细胞术可视化。
电子显微镜法：将溶解于pbs中浓度为6mg/ml的5μlabx加入300目火棉胶片(parlodian)-碳包被的铜网中并使其静置1分钟。使滤纸的尖头接触液滴以除去多余的液体，从而在网上留下薄膜。使网干燥。为了溶解留在干燥网上的缓冲液晶体，在dh20中洗涤样品三次。将ph为7.2的一小滴1％磷钨酸(pta)加入网。然后使滤纸的尖头再次接触网，以除去多余的液体，从而在网上留下薄膜并使其干燥。以1:10的比率用pbs稀释25mg/mlbev(基因工程技术公司(genentech))的0.9％氯化钠溶液。将5μlbev装载在镍聚醋酸甲基乙烯脂包被的网上，并使其风干30分钟至1小时。对于ab160，10mg/ml溶解于pbs溶液中的abx以及4mg/mlbev的0.9％氯化钠溶液以2.5:1的比率混合。用pbs以1:5进一步稀释该复合物。将5μl复合物装载在镍聚醋酸甲基乙烯脂包被的网上，并风干30分钟至1小时。两种样品与6nm金缀合颗粒(美国电子显微镜科学公司(electronmicroscopysciences))在山羊抗小鼠igg中一起孵育1小时，用10％fcb/pbs以1:30稀释，用pbs洗涤6次(每次2分钟)，用dh2o洗涤6次，然后用2％甲基纤维素和4％ua(9:1)的混合物染色5分钟。使用滤纸以滤出污渍，并使网风干1小时。两种样品与6nm金缀合颗粒(杰克逊免疫研究公司(jacksonimmunoresearch))在驴抗小鼠igg中一起孵育过夜，用10％fcb/pbs以1:25稀释，用pbs洗涤6次(每次2分钟)，用dh2o水洗涤6次，用1％pta染色5分钟，风干，用2％甲基纤维素覆盖，并风干1小时。在80kv下运行的jeol1400上拍摄显微图。
结果
abx(10mg/ml)与4mg/mlbev在体外共孵育，并且发现它们形成160nm的纳米颗粒(在本文中被称为ab160)。因为iggi(bev)的fab部分来源于小鼠，用纯化的山羊抗小鼠igg，然后用抗山羊pe作为二抗选择性地标记含bev的颗粒。作为阴性对照，仅用抗山羊pe对样品染色。通过流式细胞术使颗粒可视化，并且经证实，相对于单独的abx(6.7％阳性)，存在抗小鼠iggi结合至ab160(41.2％阳性)的强信号(图ia)。为了验证bev与abx的结合，用金标记的小鼠抗人igg标记bev，并用电子显微镜法使这些颗粒可视化(图1b)。令人惊讶的是，em图片表明单层bev围绕abx纳米颗粒。
为了确定当复合物分解时紫杉醇保持结合至哪种蛋白质(白蛋白或bev)，制备ab160并收集各个组分：颗粒(纳米ab160)、大于100kd的蛋白质和小于100kd的蛋白质。通过液相色谱-质谱(lc-ms)测量每种组分中的紫杉醇。颗粒中剩下的大概75％的紫杉醇以及大部分其余紫杉醇与含100kd或更高的蛋白质的组分相结合(图1c，上图)，这表明当颗粒解离时，紫杉醇结合至单独的bev或者结合至bev和白蛋白的异源二聚体。这表明，解离的复合物包含化疗药物与抗体，其仍然进入高vegf肿瘤微环境中。通过ab160上清液的western印迹分析确认了这些发现，这表明bev和紫杉醇共定位在大约200kd(与紫杉醇-bev-白蛋白复合物一致的尺寸)处(图ic，下图)。
实施例3：ab160的体外功能
本实施例确认了复合物中的两个关键要素抗体和紫杉醇当存在于复合物中时保持其功能。
方法
体外毒性：将a375人黑素瘤细胞系(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(atccmanassas,va))和daudib细胞淋巴瘤系(美国弗吉尼亚州马纳萨斯的美国典型培养物保藏中心(atccmanassas,va))在含1％psg和10％fbs的dmem中培养。收集细胞，并以0.75×106细胞/孔的密度将其接种在24孔板中。在浓度为0至200μg/ml的紫杉醇中，在37℃和5％c02下将细胞暴露于abx或ab160过夜。利用click-itedu试剂盒(美国俄勒冈州尤金的分子探针公司(molecularprobes,eugene,or))测量增殖。简言之，将10mmedu加入孔中，并与细胞和abx或ab160一起孵育过夜。用1％皂草苷对细胞渗透化，并用fitc缀合抗体标记插入的edu。通过未处理edu标记细胞的最大增殖量除以每次处理的fitc阳性细胞数来确定增殖指数。
vegfelisa：为了确定bev当结合至abx时是否仍可结合其配体vegf，采用了标准vegfelisa(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的r和dsystems公司(randdsystems,minneapolis,mn))。如上所述那样制备ab160，并将2000pg/mlvegf加入ab160复合物或单独的abx中。vegf在室温下与纳米颗粒一起孵育2小时。将悬浮液以6000rpm旋转15分钟，收集上清液并通过elisa测量游离的vegf。简言之，在4℃下用捕获抗体包被elisa板过夜。洗涤、阻断板并加入标准品和样品。在洗涤之后，加入检测抗体并用底物(美国明尼苏达州明尼阿波利斯的r和dsystems公司(randdsystems,minneapolis,mn))使板显影。使用versamaxelisa读板机(美国加利福尼亚州森尼韦尔的分子仪器公司(moleculardevices,sunnyvale,ca))测量450nm下的吸光度。使用0至2000pg/ml的标准曲线测量未结合的vegf的浓度。
结果
在使用人黑素瘤细胞系a375的体外毒性测定中，ab160具有与单独的abx类似的毒性，这表明紫杉醇的任一种制剂在功能上等同(图1d)。
为了测试vegf与bev在ab160复合物中的结合，使ab160或abx与vegf共孵育，除去颗粒物质，并测试上清液的vegf含量。从ab160测得，上清液中缺少vegf(<10％vegf未结合)，这表明在ab160复合物中vegf与bev结合，而当vegf与单独的abx(>80％vegf未结合)孵育时它保持游离(图1e)。
重要的是，这些分析证明了ab160中的紫杉醇保持了其对肿瘤细胞的毒性，并且所结合的bev保持结合其配体vegf的能力。
实施例4：粒度和蛋白质亲和力
为了了解当将bev结合至abx时所形成的纳米颗粒的特性，测定了abx:bev复合物相对于abx的尺寸。
方法
mastersizer和nanosight：通过动态光散射在mastersizer2000(马萨诸塞州韦斯特伯鲁的马尔文仪器公司(malverninstruments,westborough,ma))上测量abx和抗体-abx药物复合物的粒度。为了测量粒度，将2ml(5mg/ml)
结合测定：将100μg/ml的生物素酰化bev、利妥昔单抗或曲妥珠单抗结合至链霉亲和素探针(美国加利福尼亚州门洛帕克的艾瑞生物公司(fortebiocorp.menlopark,ca))。通过在blitz系统(美国加利福尼亚州门洛帕克的艾瑞生物公司(fortebiocorp.menlopark,ca))上在1000、500和100mg/ml下的吸光度测量abx的结合。使用blitz软件计算缔合和解离常数。
利用生物层干涉(blitz)技术来评估bev与abx的结合亲和力。生物素酰化bev结合至链霉亲和素探针并暴露于abx(1000、500、100μg/ml)。bev和abx在室温和ph7的条件下的解离常数(kd)为2.2×10-8m，与强的非共价相互作用一致。bev和abx的结合亲和力与在白蛋白和一些细菌蛋白的天然或工程化的白蛋白结合结构域之间观察到的解离常数范围内。nilvebrant,j.etal.(2013)computstructbiotechnolj6:e201303009(nilvebrant，j.等人，2013年，《计算与结构生物技术杂志》，6:e201303009)。
结果
abx:bev纳米颗粒始终大于单独的130nmabx(大约160nm)(图2a)。所形成纳米颗粒的尺寸与所用的bev的浓度直接相关联，其中值尺寸范围为0.157至2.166μm。(图2a)。由于这些研究的目标是1期临床试验，关注的是最小abx:bev颗粒(ab160)，因为它最类似于130nmabx。ab160颗粒的尺寸与abx加上围绕它的单层bev一致，并与该颗粒的em图像一致(见图1b)。
为了确定静脉给药条件是否影响纳米尺寸分布，评估了室温下在盐水中孵育至多24小时的ab160(或abx)的粒度分布。ab160尺寸分布在至多24小时内未发生显著变化(图9a和图9b)。然而，在室温下孵育4小时时，elisa分析表明存在一些ab160分解(图9c)的证据。
为了确定ab160在血浆中的稳定性，abx或ab160以9:1或1:1的相对体积比在盐水或肝素化人血浆中孵育。值得注意的是，当abx(图10，上图)或ab160(图10，下图)以等体积(1:1)在血浆中孵育时未检测到颗粒(0.01至1μm)。
western印迹(数据未示出)表明，在盐水或肝素化人血浆中，ab160解离成仍包含肿瘤靶向抗体、白蛋白和细胞毒性剂、紫杉醇的较小蛋白缀合物。这些蛋白缀合物保持其靶向肿瘤的能力，并且一旦在肿瘤部位，就可快速溶解并释放细胞毒性有效载荷以有效地引发肿瘤好转，而未由肿瘤细胞内在化整个纳米颗粒。
接着，将abx悬浮于bev中，并用ph为3、5、7或9的盐水稀释该混合物，随后并在不同温度(rt、37℃和58℃)下进行孵育，以形成颗粒，从而测试结合亲和力是否是ph依赖型和/或温度依赖型。abx和bev的结合亲和力是ph依赖型和温度依赖型，当颗粒在ph5和58℃下形成时观察到其最高结合亲和力(图2b)。
为了确定bev和abx在58℃和ph5下的最高结合亲和力是否转化成复合物的稳定性，通过纳米颗粒跟踪分析(nanosight)比较了各种制剂。将在58℃和ph5(ab1600558)条件下、室温和ph7(ab16007)条件下、或58℃和ph7(ab1600758)条件下制备的ab160的稳定性与在人ab血清中孵育0、15、30或60分钟之后暴露于相同条件的abx(分别为abx0558、abx07和abx0758)相比较。
在较高亲和力条件(ph7和58℃)下制备的颗粒同样更加稳定，如通过在暴露于人ab血清之后存在于每mgabx中的颗粒数目所显示的那样。ab160颗粒在人血清中表现出与其结合亲和力相关联的提高的稳定性。具体地，在盐水和人血清这两者中ab16007和ab1600558均比单独的abx更稳定，如通过每mgabx测量的颗粒的尺寸和数目所确定(图2c和表3)的。这表明可通过改变形成ab160颗粒的条件来操纵ab160颗粒的稳定性。
表3：ab160和abx在人ab血清中的稳定性
每mgabx的颗粒×10-8
这些数据表明，bev以皮摩尔范围内的亲和力结合至abx，这显示强的非共价键，并表明粒度分布与由单层抗体分子包围的abx一致；所形成颗粒的尺寸取决于抗体浓度。
实施例5：ab160在小鼠中的功效
将植入无胸腺裸鼠的a375人黑素瘤细胞的异种移植物模型用于测试ab160的体内功效。
方法
体内实验进行至少2次。通过功效分析确定这些实验所需小鼠的数目。每周测量小鼠肿瘤2-3次，并且当肿瘤为10重量％时处死小鼠。在治疗后60-80天时监测具有完全肿瘤反应的小鼠。小鼠研究的目的是中位存活期。生成了卡普兰-迈耶曲线，并进行mantle-cox测试以确定治疗组之间中位存活期的显著性。体外结果表示至少5次重复实验。使用学生t检验进行相对于基线实验的体外和体内百分比变化的统计分析。
小鼠模型：为了测试肿瘤功效，将1×106a375人黑素瘤细胞植入无胸腺裸鼠(美国印第安纳州印第安纳波利斯的harlanspraguedawley公司(harlanspraguedawley,indianapolis,in))的右侧腹。当肿瘤已经达到约700mm3的尺寸时，将小鼠随机化并用pbs治疗、用abx(30mg/kg)治疗、用bev(12mg/kg)治疗、用上述浓度的bev治疗之后用abx治疗，或者用上述浓度的ab160治疗。对于测试较大ab颗粒的小鼠实验而言，仅bev治疗组使用形成较大颗粒所必需的最高剂量(45mg/kg)的bev。每周监测肿瘤尺寸3次，并且肿瘤体积用以下公式计算：(长度×宽度2)/2。当肿瘤尺寸等于小鼠体重的10％或约2500mm3时处死小鼠。如下计算第7天时相对于基线的百分比变化：[(治疗当日肿瘤尺寸-第7天时肿瘤尺寸)/治疗当日肿瘤尺寸]×100。arl60的体内测试是类似的，不同之处在于将5×106daudi细胞注射到无胸腺裸鼠的右侧腹。
结果
相对于pbs、单独的单一药物以及按顺序给药的药物测试ab160。在治疗后第7天(p＝0.0001至0.0089)时，用ab160治疗的小鼠相比于所有其它治疗组具有相对于基线(图3a)显著降低的肿瘤尺寸。所有用ab160治疗的小鼠的肿瘤在第7天时已经好转，并且这种肿瘤反应转化成ab160组相对于所有其它组显著延长的中位存活期(图3b)，其中pbs(p<0.0001)、bev(p＝0.003)、abx(p＝0.0003)、bev+abx(p＝0.0006)和ab160组的中位存活期分别为7、14、14、18和33天。
较大肿瘤可能具有较高的局部vegf浓度。当基于治疗当日肿瘤尺寸(<700mm3和>700mm3)分析数据时，较大肿瘤显示出对ab160具有更大的反应，这表明较高的肿瘤vegf浓度将更多的bev靶向的abx吸引至肿瘤。ab160组(p＝0.0057)相对于基线的百分比变化是显著的(p＝0.0057)。在仅abx组中未观察到这种结果(p＝0.752)，在该组中abx没有靶向能力(图3c)。
如图2所示，使用渐增的bev:abx比率来制备尺寸渐增的颗粒。肿瘤好转和中位存活期与渐增的粒度正相关，这表明较大颗粒相对于较小颗粒的生物分布可发生改变(图3d和图3e)。在小鼠身上进行了完全毒性研究，并且没有观察到毒性。
实施例6：小鼠中紫杉醇药代动力学
为了比较ab160和abx的药代动力学(pk)，在0、4、8、12和24小时时测量给药ab160或abx的小鼠中的血浆紫杉醇浓度。
方法
紫杉醇药代动力学：使用附接至agilentporoshell120ec-c18分析柱(2.1×100mm，2.7μm，明尼苏达州苹果谷的chromtech公司(chromtech,applevalley,mn))的agilentporoshell120ec-c18预柱(2.1×5mm，2.7μm，明尼苏达州苹果谷的chromtech公司(chromtech,applevalley,mn))，在40℃下用由水与0.1％甲酸(a)以及acn与0.1％甲酸(b)组成的梯度流动相以0.5ml/分钟的恒定流速洗脱，实现了紫杉醇和d5紫杉醇的液相色谱分离。在60％a和40％b下开始洗脱0.5分钟，然后在4.5分钟内b从40％直线增加至85％，在85％b下保持0.2分钟，并且回到初始条件保持1.3分钟。自动进样器温度为10℃，并且注射样品体积为2μl。使用阳离子esi模式下的质谱，使用停留时间为0.075秒的多反应监测(mrm)扫描模式实现紫杉醇和内标d5紫杉醇的检测，质谱设置为毛细管电压1.75kv、离子源温度150℃、脱溶剂温度500℃、锥孔反吹气流量150l/h、脱溶剂气流量1000l/h。锥电压和碰撞能通过4.1版masslynx-intellistart软件测定，其分别在6-16v和12-60ev之间变化。在m/z854.3>105.2处监测紫杉醇mrm前体和产物离子，并且在m/z859.3>291.2处监测d5紫杉醇mrm前体和产物离子。在4ml琥珀色硅烷化玻璃小瓶中制备紫杉醇(1mg/ml的etoh溶液)和d5紫杉醇(1mg/ml的etoh溶液)的初级储存母液，并储存于-20℃。通过在2ml琥珀色硅烷化玻璃小瓶中用acn稀释储存母液来制备工作标准液，并储存于-20℃。按以下方式提取血浆样品：将100μl血浆样品加入含有d5紫杉醇(116.4nm或100ng/ml)和300μlacn的1.7ml微量离心管中，涡旋混合，在室温下孵育10分钟以使蛋白质沉淀，并离心(14,000rpm)3分钟。在agilentcaptivand脂质板(明尼苏达州苹果谷的chromtech公司(chromtech,applevalley,mn))上过滤上清液，收集在深96孔板中，并使用氮气干燥。使用100μlacn复溶样品，并且在平板振荡器上(高速)振荡5分钟。每日绘制包括紫杉醇(0.59-5855nm或0.5-5000ng/ml)和d5紫杉醇(116.4nm)的血浆标准曲线，以用于定量紫杉醇。在冰上解冻小鼠肿瘤，称重，并在l×pbs中稀释2份(重量/体积)。然后通过使用锯齿状探针(5mm×75mm)的pro200组织匀化器将肿瘤匀化。然后按照与人血浆样品相同的方式处理肿瘤匀浆。
小鼠成像：制备avastin和igg对照溶液，并按操作规程对其进行i-125(imanislifesciences)标记。简言之，将tris缓冲液(0.125mtris-hcl，ph6.8，0.15mnacl)和5mcina125i直接加入碘化管(马萨诸塞州沃尔瑟姆的赛默飞世尔科技公司(thermofischerscientific,waltham,ma))中。使碘化物活化并在室温下搅动。活化的碘化物与蛋白质溶液混合。加入50μl清除缓冲液(10mg酪氨酸/ml的pbs溶液，ph7.4)并孵育五分钟。在添加tris/bsa缓冲液并混合之后，在4℃下在10kmwco透析盒中用预冷却的pbs对样品透析30分钟、1小时、2小时以及过夜。通过γ计数器确定放射性，然后计算每分钟分解量(dpm)和比活性。在小鼠尾静脉中注射avastini-125、
结果
第一pk实验的结果提供于图4a和图4b中。计算带有a375肿瘤的小鼠和不带有肿瘤的小鼠的曲线下面积(auc)和最大血清浓度(c最大)。在第一pk实验中，不带有肿瘤的小鼠中ab160和abx的c最大和auc是非常类似的(分别为63.3+/-39.4相对于65.5+/-14.4，以及129μg/ml相对于133μg/ml)。然而，在带有肿瘤的小鼠中，治疗组的c最大和auc是不同的(分别为55.7+/-21.2相对于63.3+/-17.3，以及112μg/ml相对于128μg/ml)(图4c)。虽然这种差异在统计学上是不显著的，但其与ab160相对于abx具有优异的靶向性一致。
使用另外较早的时间点以及较大的肿瘤尺寸和较小的肿瘤尺寸进行第二pk实验(图4d-4f)。本实验的结果表明，带有肿瘤的小鼠中的auc相对于不带有肿瘤的小鼠中的auc更小，其中较大肿瘤的小鼠中紫杉醇的血液值相对于较小肿瘤的小鼠最低(对于经abx治疗的不带有肿瘤的小鼠、带有较小肿瘤的小鼠和较大肿瘤的小鼠的紫杉醇血液值分别为80.4+/-2.7，48.4+/-12.3和30.7+/-5.2；对于经ab160治疗的不带有肿瘤的小鼠、带有较小肿瘤的小鼠和较大肿瘤的小鼠的紫杉醇血液值分别为66.1+/-19.8、44.4+/-12.1和22.8+/-6.9)。类似地，在两个治疗组中带有较大肿瘤的小鼠中的c最大均有所下降(对于abx为47.2、28.9和19.7μg/ml，并且对于ab160为40.1、26.9和15.3μg/ml)(图4g)。相对于经abx治疗的小鼠，血液中紫杉醇的auc和c最大在经ab160治疗的小鼠中更低。虽然在统计学上是不显著的，但这些数据进一步与用ab160治疗的肿瘤中紫杉醇的更高沉积一致。
为了直接测试这种假设，通过lc-ms测量肿瘤紫杉醇浓度。在4小时(3473μg/mg组织+/-340相对于2127μg/mg组织+/-3.5；p＝0.02)和8小时(3005μg/mg组织+/-146相对于1688μg/mg组织+/-146；p＝0.01)的时间点，相对于abx，在用ab160治疗的肿瘤中肿瘤紫杉醇浓度明显更高，这表明当由抗体靶向时紫杉醇在肿瘤中停留更长时间(图4h)。这解释了血液pk，并与药物在包括肿瘤在内的组织中重新分布一致。
i-125标记的ab160(abx-avti125)和igg同种型结合的abx(abx-iggi125)的体内实时成像验证了lc-ms的结果，其中在注射后3小时(32.2uci/g+/-9.1相对于18.5uci/g+/-1.65；p＝0.06)和10小时(41.5uci/g+/-6.4相对于28.7uci/g+/-2.66；p＝0.03)，相对于igg-abx，用ab160治疗的小鼠的肿瘤中i-125的浓度更高(图4i和图4j)。综上，这些数据表明，bev结合至abx改变血液pk，并且这种改变是由于药物向肿瘤组织的重新分布引起的，如通过紫杉醇的lc-ms分析以及bev的i-125标记相对于同种型匹配的iggl这两者所示。
不受理论的约束，本发明认为通过将靶向肿瘤的抗体结合至abx，pk相比于单独的abx发生更加显著的改变，从而由于ab160在肿瘤组织的重新分布而降低血液中的c最大和auc。来自小鼠血液紫杉醇pk、紫杉醇的肿瘤组织水平以及相对于单独的abx，用ab160治疗的小鼠中i-125放射性水平的这些结果表明，abx的抗体靶向改变紫杉醇的生物分布，使得更高水平的紫杉醇到达肿瘤并在其中保持较长的一段时间，从而产生明显的肿瘤好转。
实施例7：其它治疗性抗体的结合
测试抗人cd20抗体(利妥昔单抗)和抗her2/neu受体抗体(曲妥珠单抗)与abx的结合，以确定其它igg治疗性抗体当体外组合时是否也表现出结合至abx。
方法
如在上述实施例中所述描述的那样制备和测试包含利妥昔单抗或曲妥珠单抗的纳米颗粒。
结果
含有bev的复合物的粒度和含有曲妥珠单抗(her)的复合物的粒度非常类似，平均尺寸范围分别为0.157至2.166μm(图2a)和0.148至2.868μm(图5b)。相反，由利妥昔单抗形成的颗粒在较低的抗体：abx比率下变得大得多，粒度范围为0.159至8.286μm(图5a)。
通过blitz在不同ph值下测定利妥昔单抗和曲妥珠单抗与abx的结合亲和力。两种抗体以在皮摩尔浓度范围内的相对高的亲和力结合(图5c)。利妥昔单抗与abx的亲和力随ph升高而降低，但曲妥珠单抗与abx的亲和力不受ph影响(图5c)。
在体外和体内测试由利妥昔单抗(ar160)制备的i60nm颗粒的功效。在体外，在紫杉醇浓度(0至200μg/ml)增加的条件下，用ar160、abx或单独的利妥昔单抗治疗b细胞淋巴瘤细胞系daudi。相比于abx(ic50>200μg/ml)或单独的利妥昔单抗(ic50>200μg/ml)，ar160(ic50＝10μg/ml)显著抑制治疗24小时的daudi细胞的增殖(p＝0.024)(图6a)。
在体内，在无胸腺裸鼠中建立daudi细胞的异种移植模型。一旦形成肿瘤，就用pbs、abx、利妥昔单抗、按顺序给药的abx和利妥昔单抗或ar160治疗小鼠。在治疗后第7天，测量肿瘤并计算肿瘤尺寸相对于基线的变化百分比。经ar160治疗的肿瘤消退或保持稳定，而所有其它治疗组中的肿瘤恶化(图6b)。相比于所有其它组，ar160组中肿瘤尺寸相对于基线的变化百分比是显著的(p<0.0001)。相比于分别用pbs(p<0.0001)、abx(p<0.0001)或利妥昔单抗(p＝0.0002)治疗的小鼠的中位存活期12天、16天和12天(图6c)，用arl60治疗的小鼠具有大于60天的明显更长的中位存活期。然而，中位存活期的差异在ar160和按顺序治疗组(p＝0.36)之间并不显著。这可能是因为利妥昔单抗结合至肿瘤细胞，并保留在细胞表面，从而允许随后给药的abx在进入肿瘤部位时结合至抗体，不像结合可溶性靶点而非细胞表面标记物的bev。
实施例8：其它化疗药物与ab160的结合
评估了其它化疗药物形成功能纳米颗粒的功效。
方法
如上述实施例中所述的那样制备和测试包含顺铂的纳米颗粒。
结果
为了测试另一种化疗药物是否可结合至ab160颗粒，共孵育顺铂和abx，并通过hplc测量上清液中剩余的游离顺铂的量。大约60％(即，仅40％保留在上清液中)的顺铂结合至abx(图7a)。
接下来，使用a375细胞测试ac相对于abx和单独的顺铂的肿瘤毒性。将复合物离心以除去高毒性未结合的顺铂，并在介质中复溶以确保ac相对于abx的任何额外的毒性只是由于结合abx的顺铂引起的。类似地，以类似的方式离心仅abx。ac(ic50＝90μg/ml)在比单独的abx(ic50>1000μg/ml)更大的程度上抑制a375细胞的增殖(图7b)。相对于其它毒性实验，本实验中毒性降低是由于药物在离心步骤中的一些损失而引起的，但abx与ac的比较仍然相关。
为了确定含顺铂的ab160复合物的肿瘤毒性，将ab160与顺铂共孵育以形成含顺铂的颗粒(abc复合物)。在a375黑素瘤异种移植模型中相对于单独的每种药物和ab160测试abc复合物。用ab160、按顺序给的ab160+顺铂以及abc复合物治疗的肿瘤均表现出在治疗后第7天肿瘤尺寸消退(图7c)，但abc复合物赋予最长的中位存活期(35天，相对于ab160和ab160+顺铂的中位存活期分别为24天和26天)。虽然这种差异在统计学上并不显著(p＝0.82和0.79)(图7d)，但该数据与abc复合物对长期存活率的有益效果一致。
这些数据表明，abx的白蛋白部分提供其它治疗性抗体(诸如利妥昔单抗和曲妥珠单抗)以及其它化疗剂(例如顺铂)结合的平台，这些均有与ab160类似的体外和体内功效。
这些数据一起表明一种构建多功能纳米免疫缀合物的简单方式，其允许多个蛋白或细胞毒素剂结合至单个白蛋白支架。在小鼠模型中示出靶向药物相对于单独的单一试剂的改善的功效，这至少部分地是由于抗体-靶向药物的pk的改变引起。此外，不受理论的约束，本文认为本发明公开的无需连接体或靶细胞内化的纳米免疫缀合物的通用性将克服其它纳米药物在将结果从小鼠转化至人类方面所面临的障碍。
实施例9：ab160的冻干
通过将8mg(320μ1)贝伐单抗加至20mg的
在室温下孵育30分钟之后，将该混合物按1:2在0.9％盐水中稀释至贝伐单抗和
将ab160分成二十份200μ1等份试样，置于1.5ml聚丙烯eppendorf管，并在-80℃下冷冻。
冷冻后，用开启致冷的virtis3l台式冻干机(美国宾夕法尼亚州沃明斯特的spscientific公司(spscientific,warmister,pa))过夜冻干等份试样。产生冻干的制剂。
在室温下将干燥后的等份试样储存在相同的1.5ml聚丙烯eppendorf管中。这些样品在室温下易于复溶于盐水中持续30分钟，然后在2000×g的条件下离心7分钟。然后根据需要将所得样品重悬于适当的缓冲液中。
相比之下，通过加热和高速真空干燥的样品不可能复溶。
实施例10：冻干的制剂的测试
将样品在冻干之后的不同时间点复溶，并测试其相对于abx和新鲜制备的ab160的物理特性。
如上所述那样评估粒度分布。
通过在室温下将样品与vegf孵育2小时，在2000×g条件下离心7分钟来评估vegf结合。用elisa测量vegf结合至小球(对应于纳米颗粒)的量或上清液中剩余vegf的量。
紫杉醇活性通过针对a375细胞的体外细胞毒性来评估。
令人惊讶的是，冻干不显著影响粒度、vegf结合或紫杉醇的活性，如通过抑制癌症细胞增殖的能力所显示的。该结果适用于储存1个月(图8a-8c)或10个月(图8d-8f)的冻干样品。
还令人惊讶的是，在不使用冷冻保护剂或可能不利地影响人治疗性用途的其它试剂的情况下观察到冻干的纳米颗粒的这些结果。
实施例11：ab160在人类中的功效
在1期临床试验(首先男性身上)中测试ab160，测试ab160在给药于先前疗法失败的转移性恶性黑素瘤患者时的安全性。该研究使用传统的3+3，1期临床试验设计，按以下方案测试3种不同剂量的ab160：
表4
*剂量水平1是指起始剂量。
选择与临床实践中目前所用的
本研究附带有与疗法周期1和2的剂量1相关联的正式(患者身上)药代动力学研究。
五名患者在100mg/m2的abx和40mg/m2的bev下已给药ab160，已经分析其中四名患者。
表5：i期研究中的病程*
*如在2015年10月6日提交的专利申请pct/us2015/054295中提供的信息。所有患者仍存活。
pfs是指无恶化中位存活期，即癌症复发之前治疗的天数。不良事件列举如下。不存在剂量限制性毒性(dlt)，即不良事件不与ab160的剂量相关联。更多细节提供于表6中。
表6：i期研究中的不良事件
平均pfs为7.6个月，并且中位pfs为7.0个月。
与其它临床试验比较
下表示出了其它已公布的转移性黑素瘤的紫杉烷疗法的临床研究。
在本试验中，ab160颗粒的给药剂量等同于100mg/m2的
spilter还研究了先前未经治疗的患者，而当前研究针对先前治疗已经失败的患者。先前无效的治疗不仅花费预期pfs的时间，而且选择对治疗更有抗性的癌细胞，并且通常使得患者身体状况较差。因此，处于“拯救”疗法(此处用ab160治疗)的一群患者的pfs预期比原始群体的pfs更低。这可见于研究拯救疗法患者和单独的
表9：在针对已公布数据的有限研究中ab160的性能
因此，采用ab160的i期临床试验的早期结果表明，先前治疗的患者身上晚期转移性恶性黑素瘤的pfs有所增加。这种增加是特别令人惊讶的，因为pfs大于spitler中的那些患者，他们是初始化疗并给予较高剂量的
因此，abx/bev复合物(ab160)优于顺序给药abx和bev或单独的abx，并以非常低有效剂量的bev实现这种优异结果。因此，该数据与具有改善的化疗药物对肿瘤的靶向性的ab160一致，并且这种靶向性通过bev介导。abx纳米颗粒可能有助于使bev靶向肿瘤，如白蛋白选择性地被肿瘤摄取。还可能的是，bev/abx复合物的存在表现出比
实施例12：bev预治疗是否改善靶向性的跟踪研究
按照上述一般方案，向无胸腺裸鼠的右侧腹注射1×106a375人黑素瘤细胞，然后用pbs、12mg/kgbev、30mg/kgabx、ab160治疗，或用1.2mg/kgbev预治疗，并且24h后用ab160治疗。数据表示治疗后第7天和第10天以mm3为单位的肿瘤体积。图11a-11e是10天内跟踪的肿瘤尺寸。只有用ab160治疗的小鼠(用或不用bev预治疗)显示平均肿瘤体积降低。另外参见图11f和图11g。
如在图11f中汇总的，治疗后第7天的数据表明，相比于对照或单独的bev(p≤0.0001)或单独的abx(p≤0.0001)，用bev预治疗与肿瘤体积在统计学上的显著降低相关联。
如在图11g中汇总的，治疗后第10天的数据表明，相比于对照或单独的bev(p≤s0.0001)或单独的abx(p≤0.0001)，用bev预治疗与肿瘤体积在统计学上的显著降低相关联。相比于单独的ab160(p＝0.02)，在ab160之前用bev预治疗也与肿瘤体积的降低相关联，其中在两只小鼠中完全反应。
在该实验中，12mg/kg的bev剂量不具有治疗性。加入预治疗组中bev的量仅为1.2mg/kg，其为小鼠中通常剂量的1/10。然而用亚治疗剂量进行预治疗似乎显示出ab160纳米颗粒的改善的功效。该数据支持以下观点：用亚治疗量的bev预治疗可清除全身水平的vegf，从而在肿瘤处剩下更大的相对浓度，使得由ab160纳米颗粒靶向肿瘤相关vegf更加有效。
实施例13：递送纳米颗粒的可选方式
本发明设计了可将本发明的纳米颗粒直接递送到肿瘤。例如，纳米颗粒可经由动脉内插管递送或通过直接注射到肿瘤中递送。在此类实施方案中，本发明设计了较大的纳米颗粒(例如580nm或1130nm)可通过直接注射至肿瘤中或肿瘤附近来递送。
实施例14：冻干的ar160的抗原结合
cd20阳性daudi淋巴瘤细胞在f和a组中分别用荧光标记的抗人cd20或同种型匹配的对照标记，并通过流式细胞术分析。在其它组中，在cd20标记之前用abx、ar160、ar160l(ar160冻干并重悬于适于注射的溶液中)或美罗华(rituxan)预治疗daudi细胞。图12表明，cd20结合由ar颗粒和美罗华(rituxan)而非单独的abx特异性地阻断。这些结果表明，在这些细胞上，ar结合至其cd20配体，从而阻断荧光抗cd20的结合。
图13是图12所示相同数据的柱状图叠加。
图14a和图14b示出了单独的abx相对于刚制备和冻干的ar(图14a)和at(图14b)的粒度比较。
图15示出了比较abx和ar颗粒毒性的daudi增殖测定结果。该数据表明，在daudi测定中冻干的和非冻干的纳米颗粒具有基本上相同的毒性。
实施例15：alexafluor750标记的纳米颗粒的肿瘤积聚的荧光分析
小鼠接受等量的标记的
实施例16：具有225nm尺寸的纳米颗粒
为了制备尺寸为225nm的纳米颗粒，根据实施例1制备颗粒，但bev与