本发明涉及具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学活性的包含成纤维细胞生长因子21(fibroblastgrowthfactor21，fgf21)突变蛋白的融合蛋白，和包含所述融合蛋白的药物组合物。
背景技术：
：在肝中合成的成纤维细胞生长因子21(fgf21)是已知在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用的激素。fgf21在表达fgf21特异性受体(即fgf受体)和β-klotho复合物二者的肝、脂肪细胞、胰腺β细胞、脑中的下丘脑和肌肉组织中展示药理学作用。已经报道，在多种糖尿病和代谢疾病的非人灵长类动物和鼠模型中，fgf21可以以胰岛素非依赖性方式降低血糖水平、减轻体重和降低血液中的甘油三酯和低密度脂蛋白(low-densitylipoprotein，ldl)浓度。此外，由于其提高胰岛素敏感性的作用，fgf21具有开发作为糖尿病和肥胖的新治疗剂的潜力(参见wo2003/011213)。因此，为了开发基于fgf21的新抗糖尿病药，已经尝试了通过基于野生型fgf21序列通过替换、插入和缺失一些氨基酸构建fgf21突变体来提高其生物学活性和体内稳定性(参见wo2010/065439)。然而，由于fgf21具有非常短的半衰期，已经证明如果直接用作生物治疗剂，其是有问题的(kharitonenkov，a.等(2005)journalofclinicalinvestigation115：1627-1635)。在小鼠中，fgf21的体内半衰期为1至2小时，并且在猴中为2.5至3小时。因此，对于fgf21以其当前形式用作用于糖尿病的治疗剂，需要每日施用。已经报道了尝试提高fgf21重组蛋白的体内半衰期的多种方法。一个这样的实例是将聚乙二醇(peg)(即聚合物材料)与fgf21连接以增加其分子量，由此抑制肾排泄并提高体内保留时间(参见wo2012/066075)。另一种方法尝试通过将其与结合至人白蛋白的脂肪酸融合来提高半衰期(参见wo2012/010553)。另一个实例尝试通过产生激动剂抗体来在维持与在野生型fgf21等同的药理学活性的同时提高半衰期，所述激动剂抗体与单独或作为与β-klotho复合物的人fgf受体特异性结合(参见wo2012/170438)。在另一个实例中，通过制备长效融合蛋白来提高半衰期，在所述长效融合蛋白中igg的fc区与fgf21分子融合(参见wo2013/188181)。在多种可用于产生长效药物的技术中，fc融合技术被广泛使用，因为其具有更少在其他方法中所见的缺点，例如在提高体内半衰期的同时诱导免疫应答或毒性。为了开发fc融合的fgf21蛋白作为长效治疗药物，应满足以下条件。首先，应最小化由融合引起的体外活性降低。fgf21的n端和c端二者都参与fgf21的活性。就此而言，已知fgf21融合蛋白的活性根据融合位置而大不相同。因此，取决于融合的存在/不存在或位置，其中突变被引入到fgf21中的fc融合的fgf21融合蛋白的活性可以改变。其次，可以通过融合提高体内半衰期来实现能够在人中以每周一次间隔施用的药代动力学谱。第三，考虑到预期在施用生物药物后在大多数患者中可能出现免疫原性，因此应最小化由融合接头或突变引起的免疫原性风险。第四，融合位置或引入突变不应引起稳定性问题。第五，由于取决于融合的免疫球蛋白的同种型可能发生不希望的免疫应答，因此需要防止这样的应答的解决方案。已经报道了通过将免疫球蛋白g(igg)的fc区与fgf21分子连接来开发长效融合蛋白的尝试(参见wo2013/188181)。在其中fc与野生型fgf21的n端融合的一种fc-fgf21结构的情况下，尽管与野生型fgf21相比在体外活性方面没有明显差异，但是已知由于蛋白质的体内降解，半衰期非常短。为了解决这一问题，已经尝试通过在fgf21的特定位点位置处引入数种突变以抵抗蛋白质降解来提高体内半衰期。然而，在引入多重突变的情况下，免疫原性风险可能提高。相比之下，在其中fc与fgf21分子的c端融合的fgf21-fc结构的情况下，已知当与fc-fgf21结构相比时，在该位点的融合引起活性显著降低。本发明人努力提高fgf21的生理活性和稳定性，并且发现当向fgf21的特定位置引入突变并使免疫球蛋白fc区与其连接时，可以提高fgf21的药理学效力并且可以增加fgf21的体内暴露和半衰期而不损害体外活性，从而完成本发明。技术实现要素：技术问题本发明的一个目的是提供具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学效力的包含fgf21突变蛋白的融合蛋白。本发明的另一个目的是提供包含所述融合蛋白的药物组合物。本发明的另一个目的是提供编码所述融合蛋白的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。问题的解决方案本发明提供了包含fgf21突变蛋白和免疫球蛋白的fc区的融合蛋白，其中所述fgf21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型fgf21蛋白的n端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列eirp(seqidno：42)；(2)从野生型fgf21蛋白的n端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列tgleav(seqidno：43)；(3)从野生型fgf21蛋白的n端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列tglean(seqidno：44)；(4)从野生型fgf21蛋白的n端起第170位的氨基酸替换为氨基酸n；(5)从野生型fgf21蛋白的n端起第174位的氨基酸替换为氨基酸n；(6)从野生型fgf21蛋白的n端起第180位的氨基酸替换为氨基酸e，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型fgf21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。此外，本发明提供了包含所述融合蛋白的药物组合物，其用于治疗糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎。此外，本发明提供了编码所述融合蛋白的分离的核酸分子、包含所述核酸分子的表达载体和包含所述表达载体的宿主细胞。有益效果通过将人免疫球蛋白的fc区与fgf21突变蛋白连接而制备的本发明融合蛋白具有提高的体内持续时间、蛋白质稳定性和药理学效力。此外，包含所述融合蛋白作为活性成分的药物组合物可以用作糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎的治疗剂。特别地，与包含fgf21蛋白的常规药物组合物相比，本发明的药物组合物由于fgf21融合蛋白的提高的体内稳定性而具有长施用间隔的优点。附图简述图1a至1c是显示通过使用其中过表达人β-klotho的hek293细胞系的包含fgf21突变蛋白的融合蛋白(以下称为“fgf21突变体融合蛋白”)体外活性的测量结果的图。由于引入突变，fgf21突变体融合蛋白变体未显示活性显著降低。图2a和2b是显示通过使用其中过表达人β-klotho的hek293细胞系根据将fgf21的n端与fc区连接的接头的fgf21突变体融合蛋白体外活性的测量结果的图。fgf21突变体融合蛋白变体未显示活性显著降低，但是根据接头序列在活性方面观察到微小差异。图3是显示使用其中过表达人β-klotho的hek293细胞系的rge(amgen)、fc-fgf21(lilly)和dfd1体外活性的测量结果的图。dfd1和rge(amgen)具有类似的活性，而fc-fgf21(lilly)的体外活性比其他蛋白质高两倍。图4示出了比较dfd4与dfd13的稳定性以确定eirp突变(在fgf21中)对融合蛋白之稳定性的作用的图。证实了，与dfd4相比，dfd13在初始阶段和超过2周的时间点具有更低的高分子量聚集体比率(hmw％)，这表明eirp突变的引入提高fgf21突变体融合蛋白的稳定性，从而显著降低hmw％。图5是显示在皮下施用fgf21突变体融合蛋白后96小时内血液中每种蛋白质的浓度的图。数据表示为平均值和标准偏差。图6是显示单次皮下注射dfd18、dfd72、dfd74或fc-fgf21(lilly)后ob/ob小鼠模型中的血糖水平的图。dfd18、dfd72和dfd74全部都具有持续降低血糖水平的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差(s.e.m.)。图7示出了显示从施用当天到单次皮下注射dfd18、dfd72、dfd74或fc-fgf21(lilly)后第14天ob/ob小鼠模型的体重变化的图。与pbs处理组相比，dfd18、dfd72和dfd74全部都具有减轻体重的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。图8示出了显示施用当天(第1天)和在单次皮下注射dfd18、dfd72、dfd74或fc-fgf21(lilly)后第16天ob/ob小鼠模型中糖化血红蛋白水平变化的图。与在施用当天的水平相比，在第16天，dfd18、dfd72和dfd74全部均使糖化血红蛋白水平降低。数据表示为平均值和平均值的标准误差。图9是显示单次皮下注射dfd72或dfd74后hfd/stz小鼠模型中的血糖水平的图。dfd72和dfd74二者都具有持续降低血糖水平的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。图10示出了显示从施用当天到单次皮下注射dfd72或dfd74后第14天hfd/stz小鼠模型的体重变化的图。与pbs处理组相比，dfd72和dfd74二者都具有减轻体重的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。图11示出了显示单次皮下注射dfd72或dfd74后第1天和第13天hfd/stz小鼠模型中糖化血红蛋白水平变化的图。其示出与pbs处理组相比，dfd72和dfd74处理二者都使糖化血红蛋白水平的降低更大。数据表示为平均值和平均值的标准误差。图12示出了显示从施用当天到单次施用dfd18后第14天在饮食诱导的肥胖小鼠模型中测量的体重变化的图。dfd18对体重减轻具有优异的作用。数据表示为平均值和平均值的标准误差。最佳实施方式在下文中，将更详细地描述本发明。在一个方面，本发明提供了包含成纤维细胞生长因子21(fgf21)突变蛋白和免疫球蛋白的fc区的融合蛋白，其中所述fgf21突变蛋白包含选自以下突变(1)至(7)的至少一种突变：(1)从野生型fgf21蛋白的n端起第98至101位的氨基酸替换为氨基酸序列eirp(seqidno：42)(在下文为“eirp”)；(2)从野生型fgf21蛋白的n端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列tgleav(seqidno：43)(在下文为“tgleav”)；(3)从野生型fgf21蛋白的n端起第170至174位的氨基酸替换为氨基酸序列tglean(seqidno：44)(在下文为“tglean”)；(4)从野生型fgf21蛋白的n端起第170位的氨基酸替换为氨基酸n(在下文为“g170n”)；(5)从野生型fgf21蛋白的n端起第174位的氨基酸替换为氨基酸n(在下文为“g174n”)；(6)从野生型fgf21蛋白的n端起第180位的氨基酸替换为氨基酸e(在下文为“a180e”)，以及上述突变(1)至(5)的一种或更多种；和(7)用于降低野生型fgf21蛋白之免疫原性的1至10个氨基酸的突变。野生型fgf21蛋白(已知在葡萄糖和脂质稳态中起重要作用的激素)可以是来源于哺乳动物(例如人、鼠、猪、猴等)、优选来自人的fgf21蛋白。更优选地，野生型fgf21蛋白可以是具有由seqidno：1表示的氨基酸序列的野生型人fgf21蛋白。fgf21突变蛋白中包含的突变可以优选地是：eirp、tgleav、tglean、g170n和g174n突变中的任一种；tgleav、tglean、g170n和g174n突变中的任一种与eirp突变的组合；eirp、tgleav、tglean、g170n和g174n突变中的任一种与a180e突变的组合；或tgleav、tglean、g170n和g174n突变中的任一种与eirp突变和a180e突变的组合。此外，fgf21突变蛋白可以具有其中与野生型fgf21蛋白相比n端或c端的1至10个氨基酸缺失的构象。更优选地，fgf21突变蛋白可以包含由seqidno：6至23中任一个表示的氨基酸序列。还更优选地，fgf21突变蛋白可以包含由seqidno：6至23中任一个表示的氨基酸序列并且还具有其中与野生型fgf21蛋白相比n端或c端的1至10个氨基酸缺失的构象。在融合蛋白中，通过突变引入的fgf21突变蛋白的氨基酸残基n可以是糖基化的。本文中使用的术语“fc区”、“fc片段”或“fc”是指包含免疫球蛋白的重链恒定区1(ch1)、重链恒定区2(ch2)和重链恒定区3(ch3)但不包含免疫球蛋白的重链和轻链可变区以及轻链恒定区1(cl1)的蛋白质。此外，本文中使用的术语“fc区突变体”是指通过替换fc区的部分氨基酸或通过组合不同类型的fc区而制备的突变体。免疫球蛋白的fc区可以是构成抗体的完整fc区、其片段或fc区突变体。另外，fc区包含单体或多聚体形式的分子，并且还可以包含重链恒定区的铰链区。fc区突变体可以被修饰以防止铰链区处的切割。此外，fc的铰链序列可以在一些氨基酸序列中具有替换以降低抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(adcc)或补体依赖性细胞毒性(cdc)。另外，fc铰链序列的部分氨基酸序列可以被替换以抑制fab区的重排。可以去除fc的c端的赖氨酸残基。优选地，免疫球蛋白的fc区可以是igg1、igg2、igg3、igg4和igdfc区中的任一种；或者是为其组合的杂合fc。此外，杂合fc可以包含igg4区和igd区。此外，杂合fc区可以包含igdfc的部分铰链序列和ch2，以及igg4fc的ch2和ch3序列。另外，本发明的fc片段可以是野生型糖基化链、与野生型相比糖基化程度较高的链、与野生型相比糖基化程度较低的链、或去糖基化链的形式。糖基化链的增加、减少或去除可以通过本领域已知的常规方法进行，例如化学方法、酶促方法和使用微生物的遗传工程方法。此外，免疫球蛋白fc区可以由seqidno：24或25表示。另外，免疫球蛋白fc区可以由seqidno：26表示。另外，融合蛋白还可以包含接头。融合蛋白可以是以下形式，其中fgf21突变蛋白与免疫球蛋白fc区的n端或c端直接连接，或者fgf21突变蛋白通过接头与免疫球蛋白fc区连接。在这样的情况下，接头可以与fc片段的n端、c端或自由基连接，并且还可以与fgf21突变蛋白的n端、c端或自由基连接。当接头是肽接头时，连接可以发生在任何区域中。例如，接头可以与免疫球蛋白fc区的c端和fgf21突变蛋白的n端连接以形成免疫球蛋白fc区与fgf21突变蛋白的融合蛋白。当接头和fc分别表达并随后连接时，接头可以是本领域已知的交联剂。交联剂的一些实例可以包括1，1-双(重氮基乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、亚氨酸酯(包括n-羟基琥珀酰亚胺酯(例如4-叠氮基水杨酸)和二琥珀酰亚胺酯(例如3，3’-二硫代双(琥珀酰亚胺基丙酸酯)))，以及双官能马来酰亚胺，例如双-n-马来酰亚胺-1，8-辛烷，但不限于此。此外，接头可以是肽。优选地，接头可以是由10至30个氨基酸残基组成的肽。此外，丙氨酸可以另外与接头的末端连接。优选地，接头可以是具有由seqidno：2至5中任一个表示的氨基酸序列的肽。融合蛋白可以是以下形式，其中一个或更多个fgf21突变蛋白连接在一起的fgf21突变蛋白二聚体或多聚体与免疫球蛋白fc区连接。另外，融合蛋白可以是其中两个或更多个免疫球蛋白fc区相连的二聚体或多聚体的形式，其中免疫球蛋白fc区与fgf21突变蛋白连接。另外，融合蛋白可以是优选具有由seqidno：27至39中任一个表示的氨基酸序列的肽。更优选地，包含fgf21突变蛋白的融合蛋白可以是具有由seqidno：36、37或39表示的氨基酸序列的肽。如上面(7)中所述的免疫原性可以通过本领域已知的常规方法预测。例如，可以通过使用例如itopetm和tcedtm方法来筛选蛋白质的潜在免疫原性。此外，用于使免疫原性最小化的突变可以通过本领域已知的常规方法来设计。例如，当通过进行episcreentm分析来观察免疫原性以评价潜在的免疫原性时，可以通过t细胞表位作图来鉴定诱导免疫原性的氨基酸序列，并且可以通过计算机预测来设计具有最小免疫原性的突变体。融合蛋白可以具有与一种或更多种生物活性蛋白进一步偶联的形式。生物活性蛋白可以是选自以下的生物活性蛋白：胰岛素、c肽、瘦蛋白、胰高血糖素、胃泌素、胃抑制性多肽(gastricinhibitorypolypeptide，gip)、胰淀素(amylin)、降钙素、胆囊收缩素、肽yy、神经肽y、骨形态发生蛋白-6(bonemorphogeneticprotein-6，bmp-6)、骨形态发生蛋白-9(bmp-9)、胃泌酸调节素(oxyntomodulin)、催产素、胰高血糖素样肽-1(glucagon-likepeptide-1，glp-1)、胰高血糖素样肽-2(glp-2)、鸢尾素、含纤连蛋白iii型结构域蛋白5(fibronectintypeiiidomain-containingprotein5，fndc5)、爱帕琳肽(apelin)、脂连蛋白、c1q和肿瘤坏死因子相关蛋白(ctrp家族)、抵抗素、内脂素、网膜蛋白、视黄醇结合蛋白-4(retinolbindingprotein-4，rbp-4)、肠高血糖素(glicentin)、血管生成素、白介素22(il-22)、毒蜥外泌肽-4(exendin-4)和生长激素。优选地，生物活性蛋白可以是选自glp-1、其突变体和毒蜥外泌肽-4的生物活性蛋白。在另一个方面，本发明提供了用于治疗fgf21相关病症的包含所述融合蛋白的药物组合物。本文中使用的术语“fgf21相关病症”可以包括肥胖、i型和ii型糖尿病、胰腺炎、血脂异常、非酒精性脂肪肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，nafld)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，nash)、胰岛素抗性、高胰岛素血症、葡萄糖耐受不良、高血糖、代谢综合征、急性心肌梗死、高血压、心血管疾病、动脉粥样硬化、外周动脉疾病、卒中、心力衰竭、冠状动脉心脏病、肾病、糖尿病并发症、神经病、胃轻瘫、与胰岛素受体的严重失活突变相关的病症，以及其他代谢性病症。优选地，fgf21相关病症可以是糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或心血管疾病。此外，药物组合物还可以包含药用载体。药用载体可以是任何载体，只要其是适合于将抗体递送至患者的无毒材料即可。例如，可以包含蒸馏水、醇、脂肪、蜡和无活性固体作为载体。可药用助剂(缓冲剂、分散剂)也可以包含在药物组合物中。在这些制剂中，融合蛋白的浓度可以差别很大。具体地，药物组合物可以包含用于改变、维持或保持组合物的ph、摩尔渗透压浓度、黏度、透明度、颜色、等张性、气味、无菌性、稳定性、溶解或释放速率、吸附或渗透性的配制材料。合适的配制材料的实例可以包括氨基酸(例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸)、抗微生物剂、抗氧化剂(例如抗坏血酸、亚硫酸钠或亚硫酸氢钠)、缓冲剂(例如，硼酸盐、碳酸氢盐、tris-hcl、柠檬酸盐、磷酸盐或其他有机酸)、膨胀剂(bulkingagent)(例如甘露醇或甘氨酸)、螯合剂(例如乙二胺四乙酸(edta))、复合剂(例如咖啡因、聚乙烯吡咯烷酮、β-环糊精或羟丙基-β-环糊精)、填充剂，单糖、二糖和其他碳水化合物(例如葡萄糖、甘露糖或糊精)、蛋白质(例如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白)、着色剂、矫味剂、稀释剂、乳化剂、亲水性聚合物(例如聚乙烯吡咯烷酮)、低分子量多肽、成盐抗衡离子(例如钠)、防腐剂(例如苯扎氯铵、苯甲酸、水杨酸、硫柳汞、苯乙醇、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、氯己定、山梨酸或过氧化氢)、溶剂(例如甘油、丙二醇或聚乙二醇)、糖醇(例如甘露醇或山梨醇)、助悬剂、表面活性剂或湿润剂(例如普朗尼克类；peg；山梨聚糖酯；聚山梨酯，例如聚山梨酯20或聚山梨酯80；triton；氨丁三醇；卵磷脂；胆固醇或泰洛沙泊(tyloxapol))、稳定性改进剂(例如蔗糖或山梨醇)、生长促进剂(例如碱金属卤化物，优选氯化钠或氯化钾；或甘露醇、山梨醇)、递送载剂、稀释剂、赋形剂和/或药用助剂，但不限于此。在另一个方面，本发明提供了用于预防或治疗fgf21相关病症的方法，其包括向有此预防或治疗需要的对象施用所述融合蛋白。该方法特别地包括向具有以下病症的症状的哺乳动物施用有效量的本发明融合蛋白：糖尿病、肥胖、血脂异常、代谢综合征、非酒精性脂肪肝病、非酒精性脂肪性肝炎或心血管疾病，其是fgf21相关病症。本发明的药物组合物可以通过任何途径施用。本发明的组合物可以通过任何合适的方式直接(例如局部地，通过注射、移植来施用到组织区域中，或通过表面施用)或全身(例如通过经口或肠胃外施用)提供给动物。当通过静脉内、皮下、经眼、腹膜内、肌内、经口、经直肠、眶内、脑内、颅内、脊柱内、室内、鞘内、池内、囊内、鼻内或气雾剂施用来肠胃外提供本发明组合物时，所述组合物优选地是水性的或可以包含部分生理上可适用的体液悬液或溶液。因此，由于其在生理学上可适用，载体或载剂可以添加到组合物并且被递送给患者。因此，通常可以包含生理学上合适的盐水溶液作为制剂的载体(例如体液)。此外，施用频率可以根据待使用的制剂中融合蛋白的药代动力学参数而变化。通常，医师将施用组合物直至达到实现预期效果的施用剂量。因此，组合物可以作为单位剂量施用(具有一定时间间隔的至少两个剂量)(可以包含或可以不包含相同量的靶融合蛋白)或通过经由移植装置或导管持续注射而施用。添加合适施用剂量的精确度可以由本领域技术人员常规进行，并且对应于其常规执行的工作范围。另外，人中融合蛋白的优选单位剂量可以为0.01μg/kg至100mg/kg体重，并且更优选1μg/kg至10mg/kg体重。虽然这是最佳量，但是单位剂量可以根据待治疗的疾病或存在/不存在不良反应而变化。尽管如此，最佳施用剂量可以通过进行常规实验来确定。融合蛋白的施用可以通过定期推注注射、外部储库(例如静脉内袋)或者来自内部来源(例如生物可蚀解植入物)的持续静脉内、皮下或腹膜内施用来进行。另外，本发明的融合蛋白可以与其他生物活性分子一起施用至对象接受者。融合蛋白和其他分子的最佳组合、剂型和最佳剂量可以通过本领域公知的常规实验来确定。在另一个方面，本发明提供了编码融合蛋白的分离的核酸分子。本文中使用的术语“分离的核酸分子”是指以下本发明的核酸分子，当从源细胞分离总核酸时，其与天然发现的约至少50％蛋白质、脂质、碳水化合物或其他物质分离；其与非天然连接的多核苷酸有效连接；或者其是较大多核苷酸序列的一部分并且非天然存在。优选地，在本发明的分离的核酸分子中，基本上不存在任何其他污染的核酸或其他在天然环境中发现并且抑制核酸在多肽产生或者治疗、诊断、预防或研究中的用途的污染物。在这样的情况下，由于密码子冗余性，编码融合蛋白的分离的核酸分子可以彼此具有不同的序列。此外，只要分离的核酸可以产生融合蛋白，那么可以根据期望的目的适当地修饰分离的核酸，或者可以向分离的核酸的n端或c端添加核苷酸。分离的核酸可以包含例如由seqidno：45至57中任一个表示的核苷酸序列。在另一个方面，本发明提供了包含分离的核酸分子的表达载体，其编码包含fgf21突变蛋白和免疫球蛋白的fc区的融合蛋白。本文中使用的术语“表达载体”是指含有核酸序列的载体，其适于转化宿主细胞并指导或控制插入的异源核酸序列的表达。表达载体包括线性核酸、质粒、噬菌粒、黏粒、rna载体、病毒载体、及其类似物。病毒载体的实例包括逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒，但不限于此。本文中使用的术语“异源核酸序列的表达”或靶蛋白的“表达”是指插入的dna序列的转录、mrna转录物的翻译，以及fc融合蛋白产物、抗体或抗体片段的产生。可用的表达载体可以是rccmv(invitrogen，carlsbad)或其突变体。可用的表达载体可以包括用于促进靶基因在哺乳动物细胞中持续转录的人巨细胞病毒(cmv)启动子和用于增强转录后rna稳定性水平的牛生长激素多聚腺苷酸化信号序列。在本发明的一个示例性实施方案中，表达载体是pad15，其是rccmv的经修饰载体。在另一个方面，本发明提供了包含表达载体的宿主细胞。本文中使用的术语“宿主细胞”是指可以将重组表达载体引入其中的原核细胞或真核细胞。本文中使用的术语“转化的”或“转染的”是指通过本领域已知的多种技术将核酸(例如载体)引入细胞中。合适的宿主细胞可以用本发明的dna序列转化或转染，并且可以用于靶蛋白的表达和/或分泌。可以用于本发明的合适宿主细胞的实例包括永生化杂交瘤细胞、ns/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢(cho)细胞、hela细胞、cap细胞(人羊水来源的细胞)和cos细胞。在下文中，将参照实施例详细描述本发明的示例性实施方案。然而，根据本发明的这些实施例可以以众多不同的形式进行修改，并且本发明的范围不应被解释为限于在此阐述的实施例。具体实施方式制备例1.包含fgf21突变蛋白的融合蛋白的制备和纯化制备例1-1.用于表达fgf21突变蛋白的表达载体的制备为了提高fgf21在fc-fgf21结构中的稳定性、活性和药代动力学谱，进行了fgf21的突变研究。具体地，针对以下设计突变蛋白：llle区(从fgf21蛋白的n端起第98至101位的氨基酸)和gpsqg区(从fgf21蛋白的n端起第170至174位的氨基酸)，以及a180位点，其基于对fgf21蛋白的三维结构分析而预期显著影响蛋白质活性。引入到fgf21蛋白中的每种突变的位置、序列信息、靶标和预期效果列于下表1中(在表1中，n是指糖基化天冬酰胺(n))。此外，包含表1中所述突变的fgf21突变蛋白列于下表2中。[表1][表2]seqdnofgf21突变蛋白的序列6fgf21(eirp)7fgf21(tgleav)8fgf21(tglean)9fgf21(g170n)10fgf21(g174n)11fgf21(eirp，tgleav)12fgf21(eirp，tglean)13fgf21(eirp，g170n)14fgf21(eirp，g174n)15fgf21(eirp，a180e)16fgf21(tgleav，a180e)17fgf21(tglean，a180e)18fgf21(g170n，a180e)19fgf21(g174n，a180e)20fgf21(eirp，tgleav，a180e)21fgf21(eirp，tglean，a180e)22fgf21(eirp，g170n，a180e)23fgf21(eirp，g174n，a180e)制备表达载体以从n端到c端按顺序表达以下三种组分的氨基酸：融合载体、接头和fgf21突变体。每种fgf21突变体融合蛋白的物质代码(materialcode)、引入到fgf21中的突变的序列、融合载体的序列和接头序列列于下表3中(在表3中，n是指糖基化天冬酰胺(n))。[表3]为了产生fgf21突变体融合蛋白，基于每种蛋白质的氨基酸序列通过咨询bioneercorporation(korea)来合成编码每种fgf21突变蛋白的核苷酸序列。将nhei和noti限制性酶序列添加到编码每种fgf21突变蛋白的核苷酸序列的5′端和3′端，并将用于蛋白质翻译的起始密码子和能够将表达的蛋白质分泌到细胞外的前导序列(mdamlrglccvlllcgavfvspsha)紧接5′端的限制性酶序列插入。将终止密码子紧接编码每种fgf21突变体融合蛋白的核苷酸序列插入。通过使用nhei和noti的两种限制性酶将编码每种fgf21突变体融合蛋白的核苷酸序列克隆到ptrans-空表达载体中。具有包含cmv启动子、puc来源复制起点、sv40来源复制起点和氨苄西林抗性基因之简单结构的ptrans-空表达载体从cevecpharmaceuticals(germany)购买。在dfd6(大肠杆菌)和rge(amgen)的融合蛋白的情况下，将编码每种融合蛋白的核苷酸序列插入到pet30a表达载体中以用于在大肠杆菌中表达。制备例1-2.用于表达fgf21突变体融合蛋白的质粒dna的构建用制备例1-1中构建的每种表达载体转化大肠杆菌以获得大量待用于表达的质粒dna。通过热冲击用每种表达载体转化细胞壁削弱的大肠杆菌细胞，并将转化体平板接种在lb板上以获得菌落。将如此获得的菌落接种到lb培养基中，在37℃下培养16小时，并以100ml的体积获得包含每种表达载体的每种大肠杆菌培养物。将由此获得的大肠杆菌离心以去除培养基，然后添加p1、p2、p3溶液(qiagen，目录号：12963)以破裂细胞壁，从而获得其中蛋白质和dna相分离的dna悬液。通过使用qiagendna纯化柱从如此获得的dna悬液中纯化质粒dna。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定洗脱的质粒dna，并通过使用nanodrop装置(thermoscientific，nanodroplite)来测量浓度和纯度。将由此获得的dna用于表达。制备例1-3.融合蛋白在cap-t细胞中的表达用制备例1-2中获得的每种质粒dna类型转染人细胞系。通过使用pei溶液(polyplus，目录号：101-10n)将每种质粒dna类型转导入已经在pem培养基(lifetechnologies)中培养的cap-t细胞(cevec)中。通过使用freestyle293表达培养基(invitrogen)将dna和pei溶液的混合溶液与细胞悬液混合，在37℃下培养5小时，并添加pem培养基。在37℃下培养5至7天后，离心培养物以除去细胞，并获得包含fgf21突变体融合蛋白的上清液。制备例1-4.fgf21突变体融合蛋白在大肠杆菌中的表达和纯化用表达dfd6(大肠杆菌)和rge(amgen)融合蛋白的每种质粒dna转化大肠杆菌菌株bl21(de3)。将表达每种融合蛋白的转化大肠杆菌接种到20ml的lb培养基中，在37℃下摇动培养15小时，然后将一部分培养基接种到100ml的lb培养基中，并在37℃下摇动培养16小时。在培养完成后，离心培养物以获得大肠杆菌沉淀物，然后使用高压细胞破碎仪破碎细胞以获得包涵体。通过洗涤和洗脱，然后进行蛋白质重折叠过程来纯化获得的包涵体。具体地，将获得的包涵体用包含0.5％tritonx-100、50mmtris、1mmedta和0.1mnacl的缓冲溶液(ph8.0)洗涤2至3次以除去细菌蛋白质，然后重悬于包含8m脲、50mmtris和1mmdtt的8m脲缓冲液中。由于8m脲缓冲液中的蛋白质完全变性，因此如下进行蛋白质重折叠过程。首先，用20mm甘氨酸缓冲溶液(ph9.0)逐渐稀释8m脲缓冲液以除去脲，并且从2m浓度开始，添加cuso4至浓度80μm以诱导稳定的蛋白质折叠。将完成重折叠过程的蛋白质悬浮于pbs缓冲溶液(ph7.4)中，并用0.22μm过滤器过滤悬浮液以除去杂质，然后装载到蛋白a亲和色谱柱中。将柱用1xpbs缓冲溶液(ph7.4)洗涤，然后使用100mm甘氨酸缓冲溶液(ph3.0)洗脱蛋白质以制备dfd6(大肠杆菌)融合蛋白。在rge(amgen)融合蛋白的情况下，将完成重折叠过程的蛋白质悬浮于50mmtris缓冲溶液(ph8.0)中，用0.22μm过滤器过滤悬浮液以除去杂质，然后装载到阴离子交换树脂柱(poros@hq50μm，thermofisherscientific)中。用50mmtris缓冲溶液(ph8.0)洗涤柱，然后沿浓度梯度施加50mmtris缓冲溶液(ph8.0)以洗脱rge(amgen)融合蛋白。将通过阴离子交换树脂获得的rge(amgen)融合蛋白与硫酸铵混合至1m的浓度，然后使用疏水相互作用色谱柱(苯基sepharoseff，gehealthcare)进行纯化。具体地，将柱用含有1m硫酸铵的50mmtris缓冲溶液(ph8.0)洗涤，沿浓度梯度施加50mmtris缓冲溶液(ph8.0)，并将洗脱的级分通过10％tris-甘氨酸凝胶电泳分析。用考马斯亮蓝r在轻轻摇动下染色凝胶，收集包含高纯度fgf21突变体融合蛋白的级分，然后使用最终缓冲溶液(1xpbs、1mmedta，ph7.4)在4℃下透析过夜。在完成透析后，在4℃下通过使用30,000mw截留离心过滤器以3,000rpm浓缩所获得的蛋白质储备溶液。通过bca定量分析测量fgf21突变体融合蛋白的浓度。制备例1-5.fgf21突变体融合蛋白的纯化将蛋白a亲和色谱柱(gehealthcare)用1xpbs缓冲溶液(ph7.4)平衡。将包含制备例1-3中获得的每种fgf21突变体融合蛋白的培养物上清液用0.2μm过滤器过滤，然后装载到蛋白a亲和色谱柱中。将柱用1xpbs缓冲溶液(ph7.4)洗涤，然后使用100mm甘氨酸缓冲溶液(ph3.0)洗脱蛋白质。使用阴离子交换树脂柱(poros@hq50μm，thermofisherscientific)纯化通过亲和色谱法获得的融合蛋白。在从柱上洗脱fgf21突变体融合蛋白之前，将阴离子交换树脂柱用50mmtris缓冲溶液(ph8.0)平衡。具体地，在用50mmtris缓冲溶液(ph8.0)洗涤柱之后，沿浓度梯度分配50mmtris缓冲溶液(ph8.0)，并分析洗脱的级分。使用尺寸排阻色谱法(sec-hplc)分析每个洗脱的级分，并收集包含高纯度fgf21突变体融合蛋白的级分。根据制备例1-4中所述的方法进行浓缩和定量分析。实验例1.融合蛋白的体外活性实验例1-1.fgf21突变对蛋白质活性的作用测量制备例1中制备的融合蛋白dfd4、dfd5、dfd6、dfd6(大肠杆菌)、dfd7、dfd9、dfd13、dfd18、dfd72、dfd73和dfd74的体外活性。具体地，使用hek293细胞系(yuhancorporation，korea)来评价融合蛋白的体外fgf21活性，所述hek293细胞系被修饰以过表达人β-klotho(fgf21的共同受体)。为了评价活性，将制备例1-4和1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物以3μm的浓度进行3倍系列稀释。在已于血清缺乏状态下培养5小时后，用稀释的融合蛋白处理过表达人β-klotho的细胞系20分钟，然后在室温下在以60rpm搅动下通过添加细胞溶解缓冲液(cisbio/目录号64erkpeg)进行裂解30分钟。将细胞裂解物溶液与可以检测细胞外信号调节激酶(erk)和磷酸化erk的抗体(cisbio/目录号64erkpeg)混合，并将混合物在室温下保持2小时。使用荧光检测器(tecan/geniospro)检测荧光。通过比较其ec50值来测量融合蛋白的活性。如图1a至1c所示，证实了通过向野生型fgf21蛋白中引入突变序列制备的融合蛋白的体外活性未受到抑制，并且每种融合蛋白的活性彼此相似。还证实了，通过在大肠杆菌中表达的dfd6(大肠杆菌)样品和在动物细胞中表达的dfd6样品，通过将n-糖基化突变引入野生型fgf21蛋白中制备的融合蛋白的体外活性未受到抑制。实验例1-2.接头序列对蛋白质活性的作用测量制备例1中制备的融合蛋白dfd1、dfd3、dfd4和dfd13的体外活性。具体地，根据实验例1-1中所述的方法通过使用制备例1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物来测量融合蛋白的fgf21活性。结果示于图2a和2b中。证实了fgf21突变体融合蛋白未显示活性显著降低，但是如图2a和2b所示，显示根据接头序列，活性略有差异。实验例1-3.dfd1、rge(amgen)和fc-fgf21(lilly)的实验结果测量制备例1中制备的融合蛋白dfd1以及对照蛋白rge(amgen)和fc-fgf21(lilly)的体外活性。具体地，根据实验例1-1中所述的方法通过使用制备例1-5中制备的包含融合蛋白的浓缩物和对照蛋白来测量融合蛋白的fgf21活性。结果示于图3中。如图3所示，证实了dfd1和rge(amgen)具有类似的体外活性，而fc-fgf21(lilly)的体外活性比其他蛋白质的体外活性高两倍。实验例2.融合蛋白稳定性的评价实验例2-1.评价稳定性的实验方法为了测量样品制备的初始阶段蛋白质聚集体的量，使用尺寸排阻色谱(sec-hplc)方法来量化高分子量聚集体(％hmw)。结果示于图4中。具体地，使用tosohaas型tsk-gelg3000swxl柱进行sec-hplc方法。通过使缓冲溶液(1xpbs、1mmedta，ph7.4)以1ml/分钟的流量流动来平衡柱。将制备例1-5中制备的dfd4和dfd13蛋白储备溶液在4℃下使用30,000mw截留离心过滤器以3000rpm浓缩至20mg/ml或更高的目标浓度。在通过bca定量分析测量每个样品的浓度后，将样品用缓冲溶液(1xpbs、1mmedta，ph7.4)稀释至终浓度为20mg/ml。为了测量dfd4和dfd13的初始％hmw，用缓冲溶液(1xpbs、1mmedta，ph7.4)将20mg/ml样品稀释至1mg/ml的终浓度，并通过sec-hplc柱分析在100μl体积中的每个样品。对于每个样品的稳定性评价，在将样品在5℃、25℃和37℃下储存两周的同时，在第4天、第8天和第14天使用sec-hplc方法来测量样品的％hmw。如图4所示，证实了与dfd4相比，dfd13在初始阶段和直至2周的时间点具有更低量的高分子量聚集体(hmw％)，这表明引入eirp突变提高fgf21突变体融合蛋白的稳定性，从而显著降低hmw％。实验例2-2.稳定性结果为了研究引入到fgf21的原始序列llle(98-101)中的eirp突变对稳定性的作用，根据实验例2-1中所述的方法测量dfd4(seqidno：29)和dfd13(seqidno：35)的稳定性。下表4总结了dfd4和dfd13的零小时样品(初始阶段；第0天)以及4、8和14天储存样品的分析结果(在表4中，n.d.表示“未检测到”)。[表4]dfd4和dfd13在20mg/ml的浓度下2周的稳定性(％hmw)如表4所示，在初始阶段(第0天)的％hmw量对于dfd4为0.91％，并且对于dfd13为0.56％。在25℃的储存条件下，在2周后，dfd4的％hmw量增加到8.83％，但在dfd13中没有观察到。与dfd4相比，dfd13在初始阶段和2周时显示具有较低的％hmw率，这表明由于引入eirp突变，fgf21突变体融合蛋白的％hmw率显著降低。实验例3.融合蛋白的药代动力学评估实验例3-1.药代动力学评估的实验方法将购买自orientbio(korea)的6周大雄性icr小鼠分组(n＝3/采血时间)以在药物处理前一天具有相似的体重平均值，并用1mg/kg的各样品(rge为2mg/kg)皮下施用一次。然后，分别在注射后1、4、8、12、24、48、72和96小时收集血液样品。使用对fgf21蛋白的n端和c端具有免疫反应性的完整人fgf21elisa试剂盒(f1231-k01，eaglebiosciences，usa)测量血液中完整全长fgf21蛋白的浓度。测量直至将每种融合蛋白皮下注射到小鼠中后96小时收集的血液中样品的浓度，并计算每个样品的药代动力学参数。实验例3-2.药代动力学活性的评估基于显示小鼠中血液中每种蛋白质的浓度相对于皮下施用融合蛋白后时间的图(图5)，计算药代动力学参数。数据示于下表5中。[表5]基于指示药物暴露程度的曲线下面积(areaunderthecurve，auc)的值来比较和评价每种融合蛋白的药代动力学谱。如表5所示，在将dfd4与dfd13进行比较并将dfd6与dfd73进行比较之后，确定了eirp序列的引入使得auc值增加约10至20％。通过将dfd9与dfd4进行比较，tgleav的引入使得auc值提高约6倍。此外，tglean、g170n和g174n的突变被设计成通过将n-糖基化引入已知在体内被蛋白水解的fgf21c端来延长半衰期。通过将突变体与每种对照物质进行比较确定由于引入n-糖基化的auc提高。为了确认由于引入n-糖基化产生的auc提高效果，将由不具有糖基化由大肠杆菌产生的dfd6(大肠杆菌)的auc值与由人细胞系产生的dfd6的auc值进行比较。与由大肠杆菌产生的dfd6(大肠杆菌)相比，由人细胞系产生的dfd6显示auc值提高3倍或更高，这证明了由于糖基化而改善药代动力学谱。a180e是在amgeninc.拥有的wo2009/149171中公开的突变。当将a180e突变分别进一步引入包含tgleav或g170n突变的突变体dfd13或dfd73中时，所得突变体dfd18或dfd74分别显示auc值另外提高约2至3倍。总之，证实了与dfd9(野生型fgf21融合蛋白)相比，通过引入不同的突变及其组合，药代动力学参数得到改善。显示出最大提高auc值的融合蛋白是包含eirp、g170n和a180e突变的dfd74，其显示与dfd9相比auc值提高约45倍。此外，考虑到rge(amgen)的剂量为2mg/kg体重，与rge相比，dfd74可能具有更高程度的药物暴露。由于突变产生的总体药代动力学改善效果总结在下表6中。[表6]实验例4.融合蛋白在ob/ob小鼠中的活性评价实验例4-1.用于评价在ob/ob小鼠中活性的实验方法表征为由于瘦蛋白遗传缺陷而表现出高血糖、胰岛素抗性、食欲过盛、脂肪肝和肥胖的ob/ob小鼠广泛用于2型糖尿病的研究。雄性ob/ob小鼠(harlan，usa)购买自raonbio(korea)。这些小鼠在到达时为5至6周大，并且在适应3周后在药物处理时为8至9周大。将小鼠分组(n＝8/组)，以在药物处理(第0天)前一天具有相似的体重和尾部血糖水平的平均值，并根据样品各自的相应剂量皮下施用样品一次。施用dulbecco磷酸缓冲盐水(dpbs，gibco，usa)作为载剂处理，并使用葡萄糖计glucodr(allmedicus，korea)测量血液中的葡萄糖浓度。每天测量非空腹血糖水平和体重直至施用后第14天。还在施用之前和测试之后测量每组中的糖化血红蛋白水平。使用dca2000hba1c试剂盒(siemens，5035c)计算糖化血红蛋白水平。实验例4-2.在ob/ob小鼠中活性的评价在单次皮下注射30或100nmol/kgdfd18和dfd72，或者10、30或100nmol/kgdfd74后，观察雄性ob/ob小鼠的非空腹血糖水平和体重的变化。证实了dfd18、dfd72和dfd74全部都具有以剂量依赖性方式降低血糖水平的作用。在高剂量100nmol/kg下比较三种药剂，与dfd18相比，dfd72和dfd74对降低血糖水平显示出提高的作用(图6)。另外，与相同剂量水平(30nmol/kg)的dfd18、dfd72和dfd74相比，在测试中用作对照物质的fc-fgf21(lilly)在降低血糖水平方面不太有效。对于对减轻体重的作用，在100nmol/kg的高剂量下比较三种药剂，dfd72在ob/ob小鼠中最有效，使得体重减轻约6％，并且dfd18是次最有效的，之后是dfd74(图7)。在测试结束后，测量指示血糖平均值的糖化血红蛋白水平，并在每个测试组中分析平均血糖的变化。除了用对照蛋白fc-fgf21(lilly)处理的对照组，所有处理组均显示出施用之前与测试之后之间的负差值，这证实了与对照物质相比受试蛋白在降低血糖方面的有效性(图8)。实验例5.融合蛋白在hfd/stz小鼠中的活性评价实验例5-1.评价在hfd/stz小鼠中活性的实验方法在另一糖尿病模型hfd/stz小鼠模型中比较和评价fgf21突变体融合蛋白对降低血糖和体重的作用。常规饮食诱导的肥胖小鼠模型(通过向c57bl/6小鼠饲喂60kcal％高脂肪饮食8周或更久来诱导)尽管其引发胰岛素抗性但是仍具有弱的高血糖和糖尿病特征。可以补偿常规饮食诱导的肥胖小鼠模型中的缺陷的hfd/stz小鼠能够在胰腺中产生功能障碍性β细胞且由于高脂肪饮食(hfd)和施用低水平链脲菌素(stz)而降低胰岛素分泌，并且因此可用于2型糖尿病的药理学研究。具体地，为了诱导hfd/stz小鼠模型，将c57bl/6小鼠(japan，slc)以60kcal％高脂肪饮食饲喂4周，然后每天腹膜内施用50mg/kgstz(sigma，85882)持续3天以诱导胰腺β细胞的功能障碍。在饲喂高脂肪饮食另外2周后，将非空腹血糖水平为200mg/dl或更高的小鼠用于测试。将小鼠分组(n＝6/组)以在药物处理(第0天)前一天具有相似的体重和尾部血糖水平的平均值，并根据样品各自的相应剂量皮下施用样品一次。施用dulbecco磷酸缓冲盐水(dpbs，gibco，usa)作为载剂处理，并使用葡萄糖计glucodr(allmedicus，korea)测量血液中的葡萄糖浓度。每天测量非空腹血糖水平和体重直至施用后第14天。还在施用之前和测试之后测量每组中的糖化血红蛋白水平。使用dca2000hba1c试剂盒(siemens，5035c)计算糖化血红蛋白水平。实验例5-2.在hfd/stz小鼠中的活性评价在单次皮下注射10nmol/kgdfd72或dfd74后观察雄性hfd/stz小鼠中非空腹血糖水平和体重随时间的变化。对于非空腹血糖水平的变化，证实了dfd72和dfd74对降低血糖水平具有类似的效果，并且血糖降低效果维持直至施用后第10天，然后在第10天之后随着药物代谢而丧失(图9)。dfd72在施用后第10天之后在非空腹血糖水平的变化方面显示出比dfd74更长久的作用。就由于施用fgf21突变蛋白对体重减轻的作用而言，证实了dfd72和dfd74二者具有类似的使体重减轻约5％的效果，并且在施用后第10天之后效果消失(图10)。在测试结束后，测量指示血糖平均值的糖化血红蛋白水平，并在每个测试组中分析平均血糖的变化。虽然载剂组的糖化血红蛋白水平增加0.25，但用dfd74处理的组增加0.1，并且用dfd72处理的组降低0.27(图11)。实验例6.融合蛋白在饮食诱导的肥胖小鼠中的活性实验例6-1.评价在饮食诱导的肥胖小鼠中的活性的实验方法在饮食诱导的肥胖小鼠中评价dfd18(一种fgf21突变体融合蛋白)的体重减轻作用。对于饮食诱导的肥胖模型，c57bl/6j小鼠购买自centrallab.animalinc.并向其饲喂含60kcal％脂肪的高脂肪饮食(研究性饮食)8至12周。将小鼠分组(n＝8/组)以在药物处理(第0天)前一天具有相似的体重平均值，然后皮下施用30nmol/kg样品一次。将体重变化与用载剂(pbs)处理的组进行比较。实验例6-2.饮食诱导的肥胖小鼠中的蛋白质活性对于单次施用30nmol/kgdfd18后饮食诱导的肥胖小鼠模型中随时间的体重变化，证实了截止施用后第10天体重减轻效果持续，并且最大体重减轻(约18％)在施用后第11天，其维持直至第14天(图12)。实验例7.免疫原性的预测和评价实验例7-1.预测免疫原性的方法和结果为了预测fgf21突变体融合蛋白的潜在免疫原性，对每种蛋白质进行免疫原性的计算机分析。具体地，通过使用itopetm和tcedtm方法(predictionofimmunogenicityoftherapeuticproteins：validityofcomputationaltools，biodrugs，2010)来快速筛选蛋白质的潜在免疫原性。关于这两种方法，与仅依赖于mhcii类结合分析的计算机分析方法相比，可以更准确地预测t细胞表位。实验例7-2.免疫原性的离体评价方法和结果为了评价fgf21突变体融合蛋白的潜在免疫原性，进了episcreentm分析(increasedbrainbio-distributionandchemicalstabilityanddecreasedimmunogenicityofanengineeredvariantofgdnf，expneurol，2015)。当检测到免疫原性时，可以通过t细胞表位作图鉴定诱导免疫原性的氨基酸序列，并且可以通过计算机预测来设计和制备具有最小化免疫原性的去免疫化突变体以重新评价免疫原性。当前第1页12