靶向PSCA的嵌合抗原受体的制作方法

前列腺癌(pca)是美国第三大最常见的癌症类型，其中今年预计诊断超过20万例新病例。在大概80％的pca患者中，肿瘤表型包括前列腺干细胞抗原(psca)的过表达。此外，psca在接近100％的骨转移性前列腺癌中表达，使得其成为理论上有吸引力的免疫治疗靶标。用于b细胞恶性肿瘤的利用靶向cd19的car的近期临床试验已经证明了引人注目的结果，但是利用其他抗原靶标仍然难以重复该成功结果。由于缺少这种受限制的抗原表达(即，用于b细胞恶性肿瘤的cd19)和存在可以显著阻碍car功效的免疫抑制性微环境，所以针对固体肿瘤的免疫疗法提出了更困难的肿瘤挑战。重要的是，由于正常组织上的抗原表达水平低，存在中靶脱瘤(on-target，off-tumor)毒性的实例。

虽然创建能够结合期望靶标的car所需的基本组分是相当良好理解的，但是设计具有用于安全且有效治疗中所需的质量的car具有挑战性。例如，避免针对非癌性细胞的过度活性是重要的，所述非癌性细胞表达低水平的靶标或根本不表达靶标。避免诱发高水平的细胞因子产生也是重要的，所述高水平的细胞因子可以诱发不想要的脱瘤效应。可以影响治疗潜力的其他因素包括但不限于表达car的t细胞的复制能力和寿命和稳健的抗肿瘤应答所需的表达car的t细胞的整体效应器功能。

发明概述

本文描述的是嵌合跨膜免疫受体(嵌合抗原受体或“car”)，其包含胞外域、跨膜区和胞内信号传导域。胞外域包括靶向psca的scfv。本文所述的car用于治疗前列腺癌和前列腺癌骨转移。

除了靶向psca的scfv外，胞外域包括间隔区，其包含例如人igg4fc域的部分。car的跨膜区包括例如，cd4跨膜域、cd8跨膜域、cd28跨膜域、cd3跨膜域或4ibb跨膜域。胞内信号传导域包括来自人cd3复合体的ζ链(cd3ζ)的信号传导域和共刺激域(例如，ox40、cd28、cd28gg或4-1bb(cd137))共刺激域。当在t细胞的表面上表达时，胞外域使得car能够将t细胞活性指向表达psca的那些细胞。此类细胞包括前列腺癌细胞。在胞内区中包括与cd3ζ串联(但是不一定直接接近)的共刺激域使得t细胞能够接受共刺激信号。可以工程化改造t细胞，例如，患者特异的自体t细胞以表达本文所述的car并且可以扩增工程化改造的细胞并用于act。可以使用多种t细胞子集。此外，可以在其他免疫细胞，如nk细胞中表达car。在利用表达本文所述的car的免疫细胞治疗患者时，所述细胞可以是自体或同种异体(allogenic)t细胞。在一些情况中，所用的细胞是cd4+和cd8+中央记忆t细胞(tcm)，其是cd45ra-cd62l+，或tcm/scm/n细胞(cd45ra+cd62l+)，并且相比于其他类型的患者特异性t细胞的使用，此类细胞的使用在过继性转移后可以改善所述细胞的长期持久性。重要的是，car的总体设计避免了针对非癌细胞的不想要的活性，包括仅表达相对低水平的psca的非癌细胞。

pscascfv可以包括序列：

diqltqspstlsasvgdrvtitcsasssvrfihwyqqkpgkapkrliydtsklasgvpsrfsgsgsgtdftltisslqpedfatyycqqwgsspftfgqgtkveikgstsgggsgggsggggssevqlveyggglvqpggslrlscaasgfnikdyyihwvrqapgkglewvawidpengdtefvpkfqgratmsadtskntaylqmnslraedtavyycktggfwgqgtlvtvss(seqidno：38)或其具有高达5个氨基酸取代(例如，保守取代)的变体。

本文所述的是编码car的核酸分子，其包含：针对psca的scfv(例如，seqidno：1)或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体；选自以下的跨膜域：cd4跨膜域或其具有1-10(例如1或2)个氨基酸修饰的变体、cd8跨膜域或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体、cd28跨膜域或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体，和cd3ζ跨膜域或其具有1-10(例如1或2)个氨基酸修饰的变体；共刺激域；和cd3ζ信号传导域或其具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰的变体。间隔区定位在scfv与跨膜域之间。下文更详尽地描述的间隔区可以包括人fc区的全部或部分。

在一些实施方案中：核酸分子表达包含选自seqidnos：26-37的氨基酸序列；嵌合抗原受体包含选自seqidno：26-37中具有1-5(例如1或2)个氨基酸修饰(例如，取代)的氨基酸序列。

还公开的是通过包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的人t细胞群，其中嵌合抗原受体包含针对psca的scfv，其包括4-1bb共刺激域。在多种实施方案中：人t细胞群包含表达嵌合抗原受体的载体，所述嵌合抗原受体包含选自seqidno：26-37的氨基酸序列；人t细胞群包含中央记忆t细胞(tcm)(例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是tcm细胞；至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm细胞是cd4+并且至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm细胞是cd8+细胞)。

还描述的是在患者中治疗癌症的方法，其包括施用通过包含编码嵌合抗原受体的表达盒的载体转导的自体或同种异体人t细胞群(例如，包含t细胞的自体或同种异体t细胞，例如，至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％的细胞是tcm细胞；至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm细胞是cd4+并且至少15％、20％、25％、30％、35％的tcm细胞是cd8+细胞)，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：26-37的氨基酸序列。在多种实施方案中：人t细胞群包含中央记忆细胞；癌症是成胶质细胞瘤；并且转导的人t细胞通过下述方法制备，所述方法包括从患者获得t细胞，处理t细胞以分离中央记忆t细胞，并利用包含编码嵌合抗原受体的表达盒的病毒载体转导中央记忆细胞的至少部分，其中嵌合抗原受体包含选自seqidno：26-37的氨基酸序列。

还描述的是：编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidnos26-37的氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidno：26-37的氨基酸序列相同的氨基酸序列，除了存在不超过5个氨基酸取代，缺失或插入；编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidno：26-37的氨基酸序列相同的氨基酸序列，除了存在不超过5个氨基酸取代；和编码多肽的核酸分子，所述多肽包含与选自seqidno：26-37的氨基酸序列相同的氨基酸序列，除了存在不超过2个氨基酸取代。

表达靶向psca的car的t细胞可用于治疗前列腺癌，包括激素难治性前列腺癌和前列腺癌转移，包括骨肝和肺转移，以及表达psca的其他癌症，其包括但不限于胰腺，膀胱，结肠和成胶质细胞瘤(原发性脑的)。因此，本公开内容包括使用表达本文所述car的t细胞治疗癌症的方法。

本公开内容还涉及编码本文所述的任何car的核酸分子(例如，包括编码car之一的核酸序列的载体)和表达本文所述的任何car的分离的t淋巴细胞。

本文所述的car可以包括位于psca靶向域(即识别psca或其变体的scfv)和跨膜域之间的间隔区。可以使用各种不同的间隔区。它们中的一些包括人fc区的至少一部分，例如人fc区的铰链部分或ch3域或其变体。下面的表1提供了可用于本文所述的car中的各种间隔区。

表1：间隔区的实例

一些间隔区包括全部或部分免疫球蛋白(例如igg1，igg2，igg3，igg4)铰链区，即落入免疫球蛋白的ch1和ch2域之间的序列，例如igg4fc铰链或cd8铰链。一些间隔区包括免疫球蛋白ch3域或ch3域和ch2域两者。免疫球蛋白衍生的序列可以包括一个或多个氨基酸修饰，例如1，2，3，4或5个取代，例如减少脱靶结合的取代。

“氨基酸修饰”是指蛋白质或肽序列中的氨基酸取代，插入和/或缺失。“氨基酸取代”或“取代”是指另一个氨基酸对亲本肽或蛋白质序列的特定位置的氨基酸的替代。为了改变所得蛋白质中的氨基酸，可以以非保守方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于另一个分组的氨基酸)或以保守的方式(即，通过将密码子从属于具有特定大小或特征的氨基酸分组的氨基酸改变为属于相同分组的氨基酸)进行取代。这种保守改变通常导致所得蛋白质的结构和功能的较小变化。以下是各种氨基酸分组的实例：1)具有非极性r基团的氨基酸：丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，色氨酸，甲硫氨酸；2)具有不带电荷的极性r基团的氨基酸：甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺；3)具有带电的极性r基团的氨基酸(在ph6时带负电荷)：天冬氨酸，谷氨酸；4)碱性氨基酸(在ph6.0时带正电)：赖氨酸，精氨酸，组氨酸(在ph6.0)。另一种分组可以是那些带有苯基的氨基酸：苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸。

在某些实施方案中，间隔区来源于包括一个或多个氨基酸残基的igg1，igg2，igg3或igg4，所述氨基酸残基被与未修饰的间隔区中存在的氨基酸残基不同的氨基酸残基取代。所述一个或多个取代的氨基酸残基选自但不限于位置220，226，228，229，230，233，234，235，234，237，238，239，243，247，267，268，280，290，292，297，298，299，300，305，309，218，326，330，331，332，333，334，336，339或其组合中的一个或多个氨基酸残基。在此编号方案中，如下文更详细描述，表1中igg4(l235e，n297q)间隔区中的第一个氨基酸为219，并且表1中igg4(hl-ch3)间隔区中的第一个氨基酸为219，表1中的igg铰链序列和igg4铰链接头(hl)序列中的第一个氨基酸亦然。

在一些实施方案中，修饰的间隔区来源于igg1，igg2，igg3或igg4，其包括但不限于以下氨基酸残基取代中的一个或多个：c220s，c226s，s228p，c229s，p230s，e233p，v234a，l234v，l234f，l234a，l235a，l235e，g236a，g237a，p238s，s239d，f243l，p247i，s267e，h268q，s280h，k290s，k290e，k290n，r292p，n297a，n297q，s298a，s298g，s298d，s298v，t299a，y300l，v305i，v309l，e318a，k326a，k326w，k326e，l328f，a330l，a330s，a331s，p331s，i332e，e333a，e333s，e333s，k334a，a339d，a339q，p396l或其组合。

在某些实施方案中，修饰的间隔区来源于igg4区域，其包括一个或多个氨基酸残基，所述氨基酸残基被与未修饰区域中存在的氨基酸残基不同的氨基酸残基取代。所述一个或多个取代的氨基酸残基选自但不限于位置220，226，228，229，230，233，234，235，234，237，238，239，243，247，267，268，280，290，292，297，298，299，300，305，309，218，326，330，331，332，333，334，336，339或其组合中的一个或多个氨基酸残基。

在一些实施方案中，修饰的间隔区来源于igg4区，其包括但不限于以下氨基酸残基取代中的一个或多个：220s，226s，228p，229s，230s，233p，234a，234v，234f，234a，235a，235e，236a，237a，238s，239d，243l，247i，267e，268q，280h，290s，290e，290n，292p，297a，297q，298a，298g，298d，298v，299a，300l，305i，309l，318a，326a，326w，326e，328f，330l，330s，331s，331s，332e，333a，333s，333s，334a，339d，339q，396l或其组合，其中未修饰的间隔区中的氨基酸被在指定的位置上上述鉴定的氨基酸取代。

对于本文讨论的免疫球蛋白中的氨基酸位置，编号是根据eu索引或eu编号方案(kabatetal.1991sequencesofproteinsofimmunologicalinterest，5thed.，unitedstatespublichealthservice，nationalinstitutesofhealth，bethesda，由此通过参考整体并入)。eu索引或如在kabat中的eu索引或eu编号方案是指eu抗体的编号(edelmanetal.1969procnatlacadsciusa63：78-85)。

可以使用多种跨膜域。表2包括合适跨膜域的实例。在存在间隔域的情况下，跨膜域位于间隔域的羧基末端。

表2：跨膜域的实例

本文所述的许多car包括一个或多个(例如，两个)共刺激域。共刺激域位于跨膜域和cd3ζ信号传导域之间。表3包括合适的共刺激域的实例以及cd3ζ信号传导域的序列。

表3：cd3ζ域和共刺激域的实例

本文描述的研究中使用的psca-car是表4中总结的那些(未成熟的，包括gmcsfra信号序列)，其中指示了每个car的间隔域和共刺激域。所有这些包括a11pscascfv。igg4(hl-ch3)间隔区也被称为igg4δch2间隔区。seqidno：26，27，28，29，30和31的成熟序列(缺乏gmcsfra信号序列)是seqidno：32，33，43，35，36和37。

表4：靶向psca的car的实例

附图简述

图1：具有多种间隔区(以上更详细描述)且具有以下的car构建体的示意图：(cd28跨膜域和cd28共刺激域；或cd4跨膜域和4-ibb共刺激域。构建体使用mb1scfv或a11scfv。所有构建体均使用cd3ζ细胞溶解域。t2a跳跃序列将car与用于评估构建体表达的截短的cd19(cd19t)蛋白质分隔开。

图2：图1中各种构建体的tcd19和scfv(蛋白l)表达数据的测量。

图3a-e：针对人前列腺癌细胞系的两种不同psca-cart细胞的体外表征。(a)工程化改造以表达psca的肿瘤细胞(lcl，pc-3和du145)中psca的表达。(b-c)通过流式细胞术测量的与肿瘤靶标共培养5小时后在cart细胞中的cd107a脱粒和ifnγ产生。(d-e)通过elisa测量的与重组psca蛋白或肿瘤靶标进行24小时培养后cart细胞的ifnγ产生。

图4a-e：含有4-1bb共刺激域的psca-car表现出优异的特异性，增殖和肿瘤细胞杀伤能力。通过流式细胞术测量的与肿瘤靶标(du145，pc-3，du145-psca和pc-3-psca)共培养72小时后，psca(δch2)28z或psca(δch2)bbzcart细胞中的肿瘤杀伤(a)和pd-1诱导(b)。(c)0.25∶1-4∶1的效应物：肿瘤(e∶t)比率下的肿瘤杀伤。(d)在与肿瘤靶标共培养72小时后cart细胞的cfse增殖。(e)在与肿瘤靶标(du145，左；du145-psca，右)共培养1，2或3天后，cart细胞中肿瘤杀伤和pd-1诱导的动力学。

图5a-b：细胞外间隔区指示体外psca-car功能性。(a)通过流式细胞术测量的在与肿瘤靶标(du145和du145-psca)共培养5小时后，psca(eq)bbz，psca(δch2)bbz和psca(l)bbzcart细胞中的cd107a脱粒和ifnγ产生。(b)通过elisa测量的在与重组psca蛋白或肿瘤靶标进行24h培养之后cart细胞中的ifnγ。

图6a-d：psca-cart细胞在前列腺癌异种移植物和原位模型中证明有效的抗肿瘤功效。(a)在nsg雄性小鼠中皮下注射pc-3-psca(2x10⁶)细胞，并且当肿瘤达到约30-50mm3时，瘤内注射cartcm(5x10⁶)，并通过卡尺测量监测肿瘤生长。(b)在nsg雄性中皮下注射du145-psca(2x10⁶)细胞，并且静脉内递送carpbmc细胞(5×10⁶)细胞。(c)在nsg雄性小鼠中颈内注射pc-3-psca(2×105)细胞，并且静脉内注射carpbmc细胞(2×10⁶或5×106)。(d)在每组中肿瘤注射后58天血液中cart细胞持续存在。

图7a-d：含有cd28或4-1bb共刺激域的psca-cart细胞。(a)具有psca-car的慢病毒表达盒的图，所述psca-car含有靶向psca的人源化scfv(a11克隆)，具有129个氨基酸的修饰的人igg4fc接头(缺乏ch2域，δch2)，跨膜域(cd28或cd4)，细胞质cd28或4-1bb共刺激域和细胞溶解cd3z域。截短的非信号传导cd19(cd19t)用t2a核糖体跳跃序列与car分隔开，所述t2a核糖体跳跃序列用于跟踪表达car的细胞。(b)通过流式细胞术评估模拟物(未转导的)，psca(δch2)28ζ或psca(δch2)bbζcart细胞的cd19t表达以检测car的慢病毒转导(上)或评估l蛋白表达以检测scfv的慢病毒转导(下)。(c)培养25天内模拟物和psca-cart细胞的离体扩增动力学。(d)如通过流式细胞术确定的离体扩增结束时psca-cart细胞的指定细胞表面标志物的细胞表面表达。所有数据代表至少两个独立实验。

图8a-g：与psca-car中的cd28共刺激相比，含有4-1bb共刺激域的psca-car在体外显示出优越的肿瘤靶向。(a)通过流式细胞术确定的人前列腺癌细胞系中psca表达的柱状图。慢病毒转导du145和pc-3细胞系以在ef1α启动子的控制下过表达人psca(参见材料和方法)。通过在所示的突变pgk启动子的控制下表达人psca产生pc-3-pgk100p细胞系。lapc-9细胞内源性表达人psca。(b)通过在与pc-3或pc-3-psca肿瘤细胞3天共培养后光学显微术评估的肿瘤杀伤测定法的快照图像，所述肿瘤杀伤测定法比较1：1效应物：靶标比率的模拟物，psca(δch2)28ζ或psca(δch2)bbζcart细胞。(c)与(b)中的肿瘤杀伤测定法类似，在与所示肿瘤靶标共培养3天后通过流式细胞术评估。(d)在与所示肿瘤靶标共培养3天后psca-cart细胞中pd-1表达的代表性斑马图。(e)在与所示肿瘤靶标共培养3天后cd8+car+t细胞中pd-1表达的定量。(f)在与du145共培养1，2或3天时比较psca-cart细胞的肿瘤杀伤测定。与没有肿瘤靶标的情况下培养的t细胞相比，t细胞中的pd-1表达。(g)具有不同效应物：靶标比率的肿瘤杀伤测定，在与pc-3-psca或pc-3-pgk100p共培养3天后通过流式细胞术评估。数据显示为每组n＝2/组±sd。所有数据代表至少两个独立实验。

图9a-f：psca-bbζcar在体外显示抗原依赖性细胞因子产生。(a)在来自用du145或du145-psca肿瘤细胞过夜培养的psca-cart细胞的上清液中通过elisa定量的ifnγ产生。(b)与(a)中相同，来自用pc-3，pc-3-pgk100p或pc-3-psca肿瘤细胞过夜培养的psca-cart细胞。(c)在来自在不同蛋白质浓度的平板结合的重组人psca上过夜培养的psca-cart细胞的上清液中通过elisa定量的ifnγ产生。(d)代表性斑马图，显示在与所示肿瘤靶标共培养4-6小时后由psca-cart细胞的cd107a脱粒。(e)来自(d)的psca-cart细胞的cd107a脱粒的定量。(f)在与所示肿瘤靶标共培养3天后模拟物，psca(δch2)28ζ或psca(δch2)bbζcart细胞中cd137表达的代表性斑马图。数据显示为每组n＝2/组±sd。所有数据代表至少两个独立实验。

图10a-f：在前列腺癌的皮下和原位骨转移人异种移植模型中psca(δch2)bbζcart细胞的稳健治疗功效。(a)第34天通过肿瘤内(i.t.)注射用模拟物或psca(δch2)bbζcart细胞以所示剂量处理的在第0天携带皮下pc-3-psca(2.5×10⁶)肿瘤的nsg小鼠中肿瘤体积(mm³)。n＝4只小鼠/组。数据代表至少两个独立实验。(b)在第51天通过i.v.注射利用5x10⁶模拟物或cart细胞处理的具有大肿瘤(约500mm3)的小鼠。n＝3只小鼠/组。数据代表至少两个独立实验。(c)i.v.t细胞处理后11天收获的用人cd3(上图)和粒酶b(下图)染色的pc-3-psca肿瘤的免疫组织化学。(d)带有胫骨内肿瘤的小鼠，在右后腿中有pc-3(野生型)细胞(0.2×106)，在左后腿中有pc-3-psca细胞(0.2×10⁶)。在第14天，通过i.v.注射用5×10⁶萤火虫萤光素酶阳性(约30％)模拟物或psca(δch2)bbζcart细胞处理小鼠。通过非侵入式光学成像(xenogen)在4小时，1天，2天和4天监测t细胞运输。流量图像的定量，显示pc-3-psca/pc-3(野生型)的比率。n＝4-6只小鼠/组。(e)带有胫骨内(左后腿)pc-3-psca-egfp-ffluc(0.2×10⁶)的nsg小鼠。通过非侵入式光学成像(xenogen)监测肿瘤生长动力学。在第14天，用5×10⁶模拟物或不同剂量的psca(δch2)bbζcart细胞i.v.注射小鼠。显示了在第13天(预处理)和第33天的小鼠的代表性流量图像。(f)来自仅肿瘤，模拟t细胞(5×10⁶)和psca(δch2)bbζcart细胞(5x10⁶，2.5x10⁶，1x10⁶，0.5x10⁶)组的流量图像(具有肿瘤注射部位处的感兴趣区域)的定量。对于car组，n＝4只小鼠/组。数据代表至少两个独立实验。

图11a-d：在前列腺癌患者衍生的骨转移异种移植模型中psca(δch2)bbζcart细胞与psca(δch2)28ζcart细胞相比的持久抗肿瘤功效。(a)携带胫骨内(左后腿)lapc-9-egfp-ffluc(0.15×10⁶)的nsg小鼠。通过非侵入式光学成像(xenogen)监测肿瘤生长动力学。在第14天，用5×106模拟物，psca(δch2)28ζ或psca(δch2)bbζcart细胞i.v.注射小鼠。显示了在指定日期的小鼠的代表性流量图像。(b)流量图像的定量，具有来自每个治疗组的胫骨(上图)处或来自全身(下图)的roi。(c)在肿瘤注射后第76天通过elisa从经处理的小鼠(n＝2-3/组)收获的血清测定的psa水平。(d)肿瘤注射后24和76天的小鼠外周血的流式细胞术分析(n＝2-3/组)。数据从两个独立的体内实验中汇集。

图12pbmc和tcm群体的细胞表面表型。(a)通过流式细胞术分析pbmc和tcm的起始群体的cd4，cd8，cd45ra，cd62l，ccr7，cd14，cd25和cd95的表达。显示了代表性的facs图。

图13：肿瘤细胞系中psca的mrna表达分析。(a)对各种前列腺和非前列腺癌细胞系进行qpcr以定量psca表达。相对于gapdhmrna标准化pscamrna。

图14a-c：含有mb1scfv和含有a11scfv的psca-car的比较。(a)具有psca-car的慢病毒表达盒的图，所述psca-car含有靶向psca的人源化mb1或a11scfv，具有129个氨基酸的修饰的人igg4fc接头(缺乏ch2域，δch2)，cd4跨膜域，细胞质4-1bb共刺激域和细胞溶解cd3ζ域。截短的非信号传导cd19(cd19t)用用于跟踪car表达细胞的t2a核糖体跳跃序列与car分隔开。(b)如通过流式细胞术确定的，模拟物(未转导的)，表达cd19以检测car的慢病毒转导(上)或表达l蛋白以检测scfv的慢病毒转导(下)的psca-mb1-(δch2)bbζ或psca-a11-(δch2)bbζcart细胞。(c)在与所示肿瘤靶标共培养3天后通过流式细胞术评估的肿瘤杀伤测定。

图15：pbmc或tcm中转导的psca(δch2)bbζcart细胞的细胞因子产生。在来自不同蛋白质浓度下在平板结合的重组人psca上培养的psca-cart细胞的上清液中通过elisa定量的ifnγ产生。

图16：模拟物，psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞针对平板结合的okt3的活化和耗竭表型。在与平板结合的okt3(10μg/ml)孵育2天后，在t细胞中通过流式细胞术得到的cd137和pd1表达。

图17a-d：用her2特异性cart细胞治疗psca阴性肿瘤复发。(a)psca(δch2)bbζ处理的携带pc-3-psca肿瘤的小鼠中肿瘤复发的动力学。每条线代表每个组的单独小鼠。n＝4/组。数据代表至少两项独立研究。(b)从用人类psca，cd3和her2染色的模拟物处理的(主要端点)或复发性psca(δch2)bbζ处理的肿瘤收获的pc-3-psca肿瘤的免疫组织化学。(c)通过流式细胞术评估的pc-3-psca肿瘤细胞中的her2表达。(d)在第24天(“第1个tx”)用5x10⁶模拟物或psca(δch2)bbζcart细胞(n＝6/组)静脉内处理的携带pc-3-psca肿瘤的小鼠中的肿瘤体积(mm³)。在第81天，当cart细胞处理的小鼠显示肿瘤复发(50-100mm³)时，将小鼠分配至第二次治疗(“第二次tx”)，接受5×10⁶模拟物，psca(δch2)bbζ或her2cart细胞的i.t.注射(n＝2/组)。

图18：pscascfv-igg4(hl-ch3)-cd4tm-4ibb-zeta的氨基酸序列(seqidno：26)。

图19：pscascfv-igg4(eq)-cd28tm-cd28gg-zeta的氨基酸序列(seqidno：27)。

图20：pscascfv-l-cd4tm-4ibb-zeta的氨基酸序列(seqidno：28)。

图21：pscascfv-igg4(hl-ch3)-cd28tm-cd28gg-zeta的氨基酸序列(seqidno：29)。

图22：pscascfv-igg4(eq)-cd4tm-4ibb-zeta的氨基酸序列(seqidno：30)。

图23：pscascfv-l-cd28tm-4ibb-zeta的氨基酸序列(seqidno：31)。

发明详述

以下描述的是靶向psca的各种嵌合抗原受体的结构，构建和表征。嵌合抗原(car)是重组生物分子，其至少含有胞外识别域，跨膜区和胞内信号传导域。因此，术语“抗原”不限于结合抗体的分子，而是能够特异性结合靶标的任何分子。例如，car可以包括特异性结合细胞表面受体的配体。胞外识别域(也称为胞外域或简单地通过其所含的识别元件)包含特异性结合存在于靶细胞的细胞表面上的分子的识别元件。跨膜区将car锚定在膜上。胞内信号传导域包含来自人cd3复合物的ζ链的信号传导域，并且任选地包含一个或多个共刺激信号传导域。car既可以结合抗原，又可以转导t细胞活化，而不依赖于mhc限制。因此，car是“普遍的”免疫受体，其可以治疗具有抗原阳性肿瘤的患者群体，而不论其hla基因型如何。使用表达肿瘤特异性car的t淋巴细胞的过继免疫治疗可以是用于治疗癌症的强大治疗策略。

在几种测定中产生和测试了各种各样的pscacar以鉴定在不引起过量的细胞因子产生的情况下具有适当活性和特异性的car。

在一些情况下，可以使用其中car开放阅读框之后是t2a核糖体跳跃序列和缺少细胞质信号传导尾(在氨基酸323处截短)的截短型cd19(cd19t)的载体来产生本文所述的car。在这种排列中，cd19t的共表达提供了惰性非免疫原性表面标志物，其允许对基因修饰的细胞进行准确测量，并且能够阳性选择基因修饰的细胞，以及在过继转移后在体内对治疗性t细胞进行有效的细胞追踪和/或成像。cd19t的共表达提供了标志物，其用于使用临床可用的抗体和/或免疫毒素试剂在体内将转导的细胞免疫学靶向以选择性删除治疗性细胞并由此发挥自杀开关的功能。

本文所述的car可以通过本领域已知的任何方式产生，尽管优选使用重组dna技术产生。方便时，可以通过本领域已知的分子克隆的标准技术(基因组文库筛选，pcr，引物辅助连接，定点诱变等)制备编码嵌合受体几个区域的核酸并将其组装成完整的编码序列。所产生的编码区优选插入表达载体并用于转化合适的表达宿主细胞系，优选t淋巴细胞系，并最优选自体t淋巴细胞系。

可以用car表达的载体转导从患者分离的各种t细胞亚群(subset)，包括未选择的pbmc或富集的cd3t细胞或富集的cd3或记忆t细胞亚群。中央记忆t细胞是一种有用的t细胞亚群。可以通过选择cd45ro+/cd62l+细胞，使用例如装置免疫磁性选择表达所需受体的细胞从外周血单个核细胞(pbmc)分离中央记忆t细胞。富含中央记忆t细胞的细胞可以用抗cd3/cd28激活，用例如指导car以及截短的人cd19(cd19t)表达的sin慢病毒载体转导，所述截短的人cd19是用于体内检测和潜在的离体选择两者的非免疫原性表面标志物。活化/遗传修饰的中央记忆t细胞可以用il-2/il-15体外扩增，然后冷冻保存。

实施例

实施例1：靶向rtpsca的car的构建

图1示意性地描绘了用于表达各种car(上图)和所得car(下图)的表达载体的开放阅读框中的元件。car使用靶向psca的mb1scfv。a11scfv未被使用，但是是合适的选择。使用三种不同的间隔区：igg4(eq)，其包括igg4fc区域，包括ch3，ch4和铰链区，并具有减少与天然fc受体结合的两个氨基酸取代；igg4(hl-ch3)，其与igg4(eq)相似，但缺少ch2域并具有位于铰链区和ch3区之间的短接头序列；和l，其是短接头序列。表1中详细描述了所有三种间隔区。使用了两种可选的跨膜域：cd4和cd28，两者均在表2中更详细地描述。使用两种替代的共刺激域：cd28gg，cd28共刺激域的变体域和4-ibb。两者均在表3中详细地描述。所有car均包括cd3ζ细胞质信号传导域，也在表3中描述。car编码序列之后是t2a核糖体跳跃序列和截短的cd17序列以允许共表达表面、无信号传导能力的、截短的cd19作为标志物。

用表达表4中描述的六种不同car之一的慢病毒转导包括cd4+细胞和cd8+细胞的整体中央记忆t细胞。因此，car包括4-ibb共刺激域(和cd4跨膜域)或cd22gg共刺激域(和cd28跨膜域)和三种不同的间隔区域之一：igg4(eq)，igg4(hl-ch3)或l(在图2中表示为eq，δch2或l)。进行facs来测量表达cd19(cd19t)以检测car和表达蛋白l以检测scfv的t细胞以确定稳定性。在图2中描述了该分析的结果。

实施例2：表达psca的前列腺肿瘤细胞

工程化改造两种不同的前列腺癌肿瘤细胞系pc-3和du145以表达psca。图3a提供了亲本细胞和工程细胞以及lcl细胞的psca表达数据。

实施例3：通过各种psca靶向性t细胞产生inf-γ

图3b-e提供了与肿瘤靶标(du145细胞，pc3细胞，用psca表达载体转染的du145细胞或用psca表达载体转染的pc3细胞)共培养5小时后两种不同car的ifnγ产生数据和cd107a脱粒数据，如通过流式细胞术所测量。图4d-e提供了通过elisa测量的与重组psca蛋白或肿瘤靶标进行24小时培养后cart细胞的ifnγ产生的数据。这里也可以看出，具有4-ibb共刺激域的car比具有cd28共刺激域的car产生更少的ifnγ和更低水平的脱粒标志物。

脱粒和胞内ifn-γ产生的这种评估揭示，包括cd22gg共刺激域的所有car均表现出针对野生型du145细胞和野生型pc3细胞的非特异性活性，而包括4-ibb共刺激域的car表现出少得多的非特异性活性。此外，包括cd22gg共刺激域的car比包括4-ibb共刺激域的car总共产生更多的细胞因子。

实施例4：由各种car的细胞杀伤

具有cd28共刺激域的car与具有4-ibb共刺激域的car的比较(图3a中所述)表明，含有4-1bb共刺激域的psca-car表现出优异的特异性，增殖和肿瘤细胞杀伤能力。这种分析的结果示于图4a-e中。如通过对未用psca表达构建体转染的细胞的较低杀伤所示，肿瘤杀伤对于具有4-ibb共刺激域的car比具有cd28共刺激域的car更特异(图4a)。具有4-ibb的car也表现出较低水平的pd-1诱导(图4b)。在与肿瘤靶标(du145，pc-3，du145-psca和pc-3-psca)共培养72小时后测量杀伤和pd-1诱导。图4c显示0.25：1-4∶1的效应物：肿瘤(e：t)比率的肿瘤杀伤的分析结果。图4d描述了与肿瘤靶标共培养72小时后cart细胞增殖的分析结果，图4e显示了与肿瘤靶标(du145，左；du145-psca，右)共培养1，2或3天后在cart细胞中的肿瘤杀伤和pd-1诱导的动力学。

实施例5：间隔区对car功能的影响

图5a-b中描绘的研究显示间隔区可影响cd107a表达(脱粒)和ifn-γ产生。本文中的car均包括cd4跨膜域和4-ibb共刺激域。

实施例6：前列腺癌异种移植物和原位模型中的抗肿瘤功效

上述两个psca-cart在前列腺癌异种移植和原位模型中表明有力的抗肿瘤功效。在nsg雄性小鼠中皮下注射pc-3-psca(2x10⁶)细胞，并且当肿瘤达到约30-50mm³时，瘤内注射cartcm(5x10⁶)，并通过卡尺测量监测肿瘤生长(图6a)。在nsg雄性中皮下注射du145-psca(2x10⁶)细胞，并且静脉内递送carpbmc细胞(5x10⁶)细胞(图6b)。为了创建原位模型，将pc-3-psca(2x10⁵)细胞胫骨内注射到nsg雄性中，并且静脉内递送carpbmc细胞(2x10⁶或5x10⁶)(图6c)。评估来自b组的每组中肿瘤注射后58天时血液中的crt细胞持久性(图6d)。

实施例7：与cd28域相比，含有4-1bb域的psca靶向性car显示出优异的选择性并减少t细胞耗竭

两种psca-car构建体包括来源于1g8(a11克隆)的人源化pscascfv[lepinetal.2010eurjnuclmedmolimaging37：529)，δch2胞外间隔区，cd3ζ细胞溶解域和cd19t细胞追踪物，并且仅在它们的共刺激域中有区别(比较4-1bb与cd28(图7a))。本实施例和实施例8-11描述了使用在pbmc来源的t细胞中工程化改造的psca-car的研究，除非另有说明。例如，具有不同起始细胞表面t细胞表型的中央记忆t细胞(tcm))用于一些研究中(图12)。

如通过scfv和cd19t的流式细胞术检测确定的，这两种psca-car是稳定表达的(图7b)，尽管与psca(δch2)28ζ相比，psca(δch2)bbζ的水平较低。这些cart细胞表现出可比较的离体t细胞增殖动力学(图7c)和类似的细胞表面t细胞表型(图7d)。

接下来，稳定工程化改造为在ef1α启动子控制下表达人psca基因的几种人前列腺癌细胞系，psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞的肿瘤杀伤能力(图8a)。pc-3肿瘤细胞也工程化改造为具有由突变体pgk启动子(frigaultetal.2015cancerimmunolres3：356)驱动的psca以得到低抗原密度细胞系(表示为pgk100p)。lapc-9是来源于患有骨转移性前列腺癌的患者的原代肿瘤异种移植物(craftetal.1999cancerres59：503)，其内源性表达psca。将psca(δch2)28ζ或psca(δch2)bbζcart细胞与各种肿瘤靶标共培养。细胞成像定性地证明这两种car都以相似的动力学杀伤(图8b)。在分开的肿瘤杀伤测定中，使用流式细胞术来定量psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞对肿瘤的杀伤。尽管psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞两者以相似的功效杀伤表达psca的肿瘤细胞，但psca(δch2)28ζ显示靶向野生型非psca表达性du145和pc-3肿瘤细胞(图8c)。在所有肿瘤靶标上进行psca表达的定量实时pcr分析，并且显示尽管在野生型du145和pc-3细胞中通过流式细胞术检测不到psca蛋白表达，但是在这些系中检测到mrna表达(图13)，这可能有助于由含有cd28的car的靶向。

检查了备选pscascfvmb1[33]的影响。(图14a)。尽管基于mb1和a11的含4-1bb的psca-car都以相似的稳定性表达(图14b)，但与含有a11scfv的car相比，含有mb1scfv的car显示野生型肿瘤细胞的显著靶向(图14c)。这些数据提示抗原靶向和共刺激域协同起作用以提供car的肿瘤选择性，并且一个域的非选择性可能压倒(override)由另一个域驱动的选择性。

除了野生型非psca表达性肿瘤细胞的增强的选择性和杀伤缺乏之外，与psca(δch2)28ζcart细胞相比，psca(δch2)bbζcart细胞展示更少的耗竭证据，如通过减少的程序性死亡-1(pd-1)表达所示(图8d)。psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζ之间pd-1表达的差异主要见于cart细胞的cd8+亚群(图8e)。此外，使用其他耗竭标志物(包括lag3和tim3)观察到类似的趋势，尽管不太稳健(数据未显示)。

时间过程杀伤测定法，其中使用在与肿瘤细胞共培养一天，两天和三天时psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζ的杀伤能力来检查pd-1表达的动力学(图8f)。这些数据定量地证实，psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζ随时间等量杀伤du145-psca，但psca(δch2)28ζ具有更高的pd-1表达。

在另一项研究中，psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζ在不同效应物：靶标(e：t)比率下针对低psca表达性肿瘤系(pc-3-pgk100p)和高psca表达性肿瘤系(pc-3-psca)共培养。该研究显示在较低的e：t比率下，与psca(δch2)28ζ相比，psca(δch2)bbζ对于高psca表达性肿瘤细胞更具选择性(图8g)。使用pbmc-或tcm-衍生的psca-cart细胞观察到类似的发现(数据未显示)。这些数据共同提示4-1bb共刺激允许在使针对较低psca表达性细胞的活性最小化的情况下有效且选择性杀伤高psca表达性肿瘤细胞，而含有cd28的car缺乏这种靶向选择性。

实施例8：与含有cd28的psca-car相比，含有4-1bb的psca-car表明减弱但选择性的细胞因子产生。

为了进一步研究含有cd28和4-1bb的psca-car之间的差异，进行了研究以比较它们各自的t细胞活化和细胞因子产生。这些研究揭示了在与du145-psca肿瘤细胞过夜共培养后psca(δch2)bbζcart细胞与psca(δch2)28ζcart细胞相比ifnγ产生的显著减弱(图9a)。对针对pc-3-psca的含有4-1bb的car观察到细胞因子产生的类似减弱。尽管含有cd28的psca-cart细胞针对低和高psca表达性肿瘤细胞产生等同ifnγ水平，但是含有4-1bb的cart细胞针对低psca表达性肿瘤细胞产生了较低ifnγ(图9b)。为了排除对由肿瘤细胞的细胞因子产生的潜在的非car介导的影响，进行了针对平板结合的重组人psca蛋白的、由psca(δch2)bbζcart细胞的类似ifnγ测量。尽管含有cd28的cart细胞显示出针对低或高水平psca的饱和响应，但含有4-1bb的psca-cart细胞的ifnγ产生取决于抗原密度(图9c)。观察到相似的细胞因子响应，其不依赖于用于产生psca-cart细胞的t细胞亚群(图15)。

与含有cd287的car相比，含有4-1bb的psca-car针对表达psca的肿瘤细胞显示出cd107a脱粒的轻微减少(图9d和图9e)。观察到psca(δch2)28ζ对非psca表达性肿瘤细胞的显著靶向，如通过cd107a表达测量的。如通过3天肿瘤杀伤测定中的4-1bb(cd137)表达所测量的，psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞的活化状态是相当的(图9f)。为确保psca-cart细胞的差异是由于抗原靶向而不是t细胞活性的固有缺陷，我们证实了在与平板结合的抗人cd3抗体，okt3刺激的t细胞中的类似活化(cd137)和耗竭(pd-1)(图16)。

实施例9：psca(δch2)bbζcart细胞在皮下前列腺癌模型中表明稳健的治疗功效。

在这项研究中，用单次瘤内注射5x10⁶psca(δch2)bbζcart细胞处理携带皮下pc-3-psca肿瘤的小鼠。在瘤内t细胞注射后两周内观察到完全肿瘤消退。尽管肿瘤消退在30天以上是明显的，但肿瘤在大多数动物中以与原发肿瘤相似的动力学最终复发(图17a)，我们将在下面解决这点。为了建立在该实体瘤模型中是否可实现cart细胞的全身治疗，静脉内递送不同剂量的psca(δch2)bbζcart细胞。尽管5x10⁶psca-cart细胞显示肿瘤完全消退，但在car剂量低至0.25×10⁶时观察到类似但延迟的治疗功效(图10a)。为了将发现延伸至大的肿瘤负荷，用单次静脉内注射5x10⁶psca(δch2)bbζcart细胞处理大的pc-3-psca肿瘤(约500mm³)。在此观察到快速肿瘤消退(图10b)。在cart细胞输注后11天观察到人t细胞的显著肿瘤浸润(图10c，上图)，其也表达粒酶b(图10d，下图)，即t细胞活性的标志物。来自模拟物处理的小鼠的肿瘤在同一时间点显示非常少的人t细胞或粒酶b表达。

考虑到实体瘤的异源抗原谱，单一抗原特异性cart细胞治疗后的复发可能是一种预期的现象，但是仍在探索抗性/复发下的机制。为了更好地理解在图10a中观察到的延迟肿瘤复发，使用免疫组织化学来评估抗原在肿瘤细胞上的持续存在以及psca-cart细胞持续性。有趣的是，尽管模拟物处理的肿瘤对psca呈高度阳性，但在psca(δch2)bbζcart细胞处理后复发的肿瘤呈psca阴性(图17b，上图)。然而，在相同的复发性肿瘤中，人t细胞是丰富的(图17b，中图)，即使这些肿瘤在cart细胞输注后至少2个月收获。pc-3细胞在体外也表达her2(图17c)，并且证实模拟物和psca(δch2)bbζ-处理的复发肿瘤两者在体内以等同的水平表达her2(图17b，下图)。为了确定肿瘤是否为psca阴性且仍然对cart细胞治疗易感，通过肿瘤内注射模拟物，psca定向性或her2定向性cart细胞处理复发性肿瘤。尽管复发性psca阴性肿瘤对psca-car无反应，但它们对her2-cart细胞处理易感(图17d)。

实施例10：psca(δch2)bbζcart细胞向骨运输并在骨转移性前列腺癌中表现出抗肿瘤功效。

细胞免疫治疗的主要障碍之一是免疫抑制微环境，其可阻碍实体瘤中t细胞的有效运输和存活。为了直接评估骨转移性前列腺肿瘤中的运输和抗原依赖性cart细胞扩增，将萤火虫萤光素酶标记的psca(δch2)bbζcart细胞静脉内注射到携带胫骨内野生型pc-3(解剖学右胫骨)和pc-3-psca(解剖学左胫骨)肿瘤的小鼠中。有趣的是，尽管模拟物和psca-cart细胞显示出对这两种肿瘤的相等的早期运输(在t细胞输注后4小时)，但psca-cart细胞主要在t细胞注射后1天时在表达psca的肿瘤中发现，其在动态成像的4天内增加(图10d)，表明在psca阳性肿瘤中抗原依赖性运输和/或cart细胞增殖。接下来，进行了其中将pc-3-psca肿瘤细胞注射到胫骨内空间的研究。在肿瘤植入后第14天，用剂量递减(de-escalation)的psca(δch2)bbζcart细胞(0.5x10⁶-5x10⁶)对这些携带肿瘤的小鼠进行静脉内处理(图10e)。用5×10⁶或2.5×10⁶cart细胞处理的大部分小鼠显示完全肿瘤消退，而用1×10⁶或0.5×10⁶cart细胞处理的小鼠具有更加异质的治疗响应(图10f)。当将来自原位研究的有效剂量与皮下模型中使用的剂量进行比较时，该模型的临床相关性是明显的，在所述皮下模型中利用低至0.25x10⁶的cart细胞剂量观察到完全消退。这些模型中观察到的整体治疗差异可能是由于这些肿瘤微环境中cart细胞的浸润和存活的差异。

实施例11：4-1bb共刺激在临床相关的骨转移性前列腺癌模型中提供psca-car的优异的持久性和持久的抗肿瘤响应

使用内源psca表达性骨转移性前列腺癌患者来源的肿瘤异种移植物lapc-9扩展上述研究。在肿瘤植入后第14天，用单一静脉内注射5x10⁶psca(δch2)bbζcart细胞处理的小鼠显示肿瘤在胫骨内肿瘤部位处几乎完全消退(图11a)。尽管胫骨内肿瘤被有效靶向，但lapc-9肿瘤传播到体内的其他部位，发现它们在各种淋巴结(腋窝和腹股沟)和胸腺中特别明显，如通过免疫组织化学证实的(数据未显示)。尽管这些看起来在骨中初始肿瘤消退后几周内生长，但它们最终被psca(δch2)bbζcart细胞消除。

基于psca-car的完全抗肿瘤活性要求持久性t细胞，进行了一项研究以比较含有cd28或4-1bb共刺激域的psca-car。虽然psca(δch2)28ζ和psca(δch2)bbζcart细胞均显示出骨转移的显著消退，但接受含cd28的psca-car的小鼠显示在原发性肿瘤部位以及转移性疾病处的复发，而含4-1bb的psca-car处理的小鼠显示完全的抗肿瘤应答(图11a和图11b)。通过在cart细胞处理后第76天定量血液中的psa水平证实psca(δch2)28ζcart细胞处理的小鼠中的肿瘤复发(图10c)。在处理的动物的血液中定量cart细胞，而在肿瘤注射后第24天在这两组中均观察到cart细胞，在第76天psca(δch2)bbζcart细胞明显更丰富，表明更大的持久性(图10d)。总体而言，这些研究证明在多种肿瘤系统(包括前列腺癌的原位骨转移模型)中利用psca(δch2)bbζcart细胞的有效且持久的抗肿瘤功效。

实施例12：用于表达car的ephiv7的构建和结构

phiv7质粒是亲本质粒，在希望之城(cityofhope，coh)的t细胞治疗研究实验室(tcelltherapeuticsresearchlaboratory，tctrl)从所述亲本质粒衍生各种car表达载体。用于表达car的ephiv7载体由phiv7载体产生。重要的是，这种载体使用人类ef1启动子来驱动car的表达。载体的5′和3′序列都源自pv653rsn，如先前来源于hxbc2原病毒的。聚嘌呤段(tract)dna瓣(flap)序列(cppt)来源于nihaids试剂保藏所(reagentrepository)的hiv-1株pnl4-3。先前描述了土拨鼠转录后调控元件(wpre)序列。

如下进行phiv7的构建。简言之，如下将含有来自gag-pol的653bp加上5’和3’长末端重复(ltr)以及居间的sl3-新霉素磷酸转移酶基因(neo)的pv653rsn亚克隆到pbluescript中：在步骤1中，从5’ltr到rev-应答元件(rre)的序列制备p5’hiv-151，然后通过去除tata盒上游的序列修饰5’ltr，并首先连接到cmv增强子，然后连接到sv40复制起点(p5’hiv-2)。在步骤2中，在将3’ltr克隆到pbluescript中以制备p3’hiv-1之后，在3’ltr增强子/启动子中进行400-bp缺失以除去hivu3中的顺式调控元件并形成p3’hiv-2。在步骤3中，连接从p5’hiv-3和p3’hiv-2分离的片段以制备phiv-3。在步骤4中，通过去除额外的上游hiv序列来进一步修饰p3’hiv-2以产生p3’hiv-3，并且将含有wpre的600-bpbamhi-sali片段添加到p3’hiv-3中以制备p3’hiv-4。在步骤5中，通过pcr将phiv-3rre的大小减小，并连接到来自phiv-3的5’片段(未显示)以及连接到p3’hiv-4，以制备phiv-6。在步骤6中，从pnl4-3扩增含有来自hiv-1pnl4-3(55)的cpptdna瓣序列的190-bpbglii-bamhi片段，并将其置于phiv6中的rre和wpre序列之间以制备phiv-7。使用该亲本质粒phiv7-gfp(gfp，绿色荧光蛋白)，使用4-质粒系统包装亲本载体。

包装信号psiψ是将病毒基因组有效包装到载体中所需的。rre和wpre增强rna转录物转运和转基因表达。与wpre组合的瓣序列已被证明增强哺乳动物细胞中慢病毒载体的转导效率。

产生病毒载体所需的辅助功能被分到三个分开的质粒中以降低通过重组产生有复制能力的慢病毒的可能性：1)pcgp编码病毒载体装配所需的gag/pol蛋白；2)pcmv-rev2编码rev蛋白，其作用于rre序列以帮助运输病毒基因组以高效包装；和3)pcmv-g编码病毒载体的感染性所需的水泡-口炎病毒(vsv)的糖蛋白。

在phiv7编码的载体基因组和辅助质粒之间具有最小的dna序列同源性。同源性区域包括位于pcgp辅助质粒的gag/pol序列中的大约600个核苷酸的包装信号区域；所有三种辅助质粒中的cmv启动子序列；和辅助质粒pcgp中的rre序列。非常不可能的是由于这些区域中的同源性而可以产生具有复制能力的重组病毒，因为其需要多次重组事件。此外，任何产生的重组体都将缺失慢病毒复制所需的功能性ltr和tat序列。

cmv启动子被ef1α-htlv启动子(ef1p)取代，并且新质粒被命名为ephiv7。ef1p具有563bp并在切除cmv启动子后使用nrui和nhei被引入ephiv7。

已经从该系统中除去了慢病毒基因组，排除野生型病毒的致病性所必需的且靶细胞的生产性感染所需的gag/pol和rev。此外，clrx-igg4fc(eq)-cd28-zeta-t2acd19t_ephiv7载体构建体不含有完整的3’ltr启动子，因此在靶定细胞中得到的表达的且反转录的dna原病毒基因组将具有无活性的ltr。由于这种设计，无hiv-1衍生的序列将从原病毒转录，并且只有治疗序列将从它们各自的启动子表达。sin载体中ltr启动子活性的去除显著降低宿主基因的无意激活的可能性。

实施例13：用于转导t细胞的载体的产生

对于表达car的每种质粒，产生种子库，其用于接种发酵罐以产生足够量的质粒dna。在用于产生慢病毒载体之前，测试质粒dna的身份，无菌性和内毒素。

简言之，从293t工作细胞(wcb)中扩增细胞，所述293t工作细胞经测试证实无菌并且没有病毒污染。将来自293twcb的一小瓶293t细胞解冻。培养并扩增细胞直到存在足够数量的细胞来铺板适当数量的10层细胞厂(cf)，用于载体生产和细胞培养维持。细胞的单培养(singletrain)可用于生产。

在最多10cf的亚批次中产生慢病毒载体。可以在同一周内产生两个亚批次，导致产生约20l慢病毒上清液/周。在下游加工阶段期间合并由全部亚批次产生的材料，以产生一批产品。将293t细胞平铺在293t培养基(含有10％fbs的dmem)中的cf中。将厂放置在37℃培养箱中并水平放平以获得cf的所有层上细胞的均匀分布。两天后，使用capo4方法用上述四种慢病毒质粒转染细胞，所述方法涉及tris：edta，2mcacl2，2xhbs和四种dna质粒的混合物。转染后第3天，收集含有分泌的慢病毒载体的上清液，纯化并浓缩。从cf中除去上清液后，从每个cf收集最终生产的细胞。将细胞从每个厂用胰蛋白酶消化处理并通过离心收集。将细胞重悬浮于冷冻培养基中并冷冻保存。这些细胞后来用于有复制能力的慢病毒(rcl)测试。

为了纯化和配制载体，通过膜过滤澄清粗制上清液以除去细胞碎片。通过核酸内切酶消化()降解宿主细胞dna和残留质粒dna。使用0.45μm过滤器对病毒上清液澄清细胞碎片。将澄清的上清液收集到预先称重的已经加入有的容器中(终浓度50u/ml)。残留质粒dna和宿主基因组dna的核酸内切酶消化在37℃下进行6小时。使用核酸内切酶处理的上清液的初始切向流超滤(tff)浓缩从粗上清液中去除残留的低分子量组分，而将病毒浓缩约20倍。将澄清的核酸内切酶处理的病毒上清液循环以被设计来维持约4,000秒-1或更低的剪切速率的流速通过nmwco为500kd的中空纤维筒，同时使流量速度最大。在浓缩过程期间启动核酸酶处理的上清液的渗滤以维持筒性能。使用pbs中4％乳糖作为渗滤缓冲液，建立了80％的渗透物置换率。使病毒上清液达到目标体积，代表粗制上清液的20倍浓缩，并渗滤再继续4个交换体积，渗透物置换率为100％。

通过使用高速离心技术实现病毒产物的进一步浓缩。使用sorvallrc-26plus离心机以6000rpm(6，088rcf)在6℃将每个亚批次的慢病毒团粒16-20小时。然后将来自每个亚批次的病毒团粒在pbs中具有4％乳糖的50ml体积中重建。该缓冲液中的重建的团粒代表病毒制备物的最终配制剂。整个载体浓缩过程导致约200倍的体积减少。在所有亚批次完成之后，然后将材料置于-80℃，同时对来自每个亚批次的样品测试无菌性。确认样品无菌性后，将亚批次在37℃频繁搅拌下迅速融化。然后将材料合并，并且在病毒载体套装中手动在ii类a/b3生物安全柜中等分取样。使用在无菌usp6类、外螺纹的o形环冷冻管中的1ml浓缩慢病毒的填充构造。coh的应用技术部中心(centerforappliedtechnologydevelopment，catd)的质量系统(qs)根据关于cbg的政策和标准操作规程(policiesandstandardoperatingproceduresforthecbg)并符合当前的良好制造实践(currentgoodmanufacturingpractices，cgmps)释放所有材料。

为了确保慢病毒载体制剂的纯度，测试了残留宿主dna污染物和残留宿主和质粒dna的转移。在其他测试中，通过rt-pcr评估载体身份以确保存在正确的载体。对于用于本研究的载体，符合所有的释放标准。

实施例14：制备适于表达psca靶向性car的t细胞

通过白细胞分离术(leukopheresis)从患者获得t淋巴细胞，并且将合适的同种异体或自体t细胞亚群(例如中央记忆t细胞(tcm))遗传改变以表达car，然后通过任何临床上可接受的手段将其施用回患者以实现抗癌治疗。

可以如下产生合适的tcm。从同意的研究参与者获得的单采血液成分术产物用ficoll处理，洗涤并温育过夜。然后使用gmp级抗-cd14，抗-cd25和抗-cd45ra试剂(miltenyibiotec)和clinimacs^tm分离装置消减细胞中的单核细胞，调节性t细胞和幼稚()t细胞群。消减后，在clinimacs^tm分离装置上使用dreg56-生物素(coh临床级)和抗生物素微珠(miltenyibiotec)针对cd62l+tcm细胞富集的阴性级分细胞。

富集后，在完全x-vivo15加50iu/mlil-2和0.5ng/mlil-15中配制tcm细胞，并将其转移至teflon细胞培养袋中，其中用dynalclinex^tmvivocd3/cd28珠刺激它们。刺激后长达五天，以感染复数(moi)为1.0至0.3用表达所需的car的慢病毒载体转导细胞。在加入完全x-vivo15和如细胞扩增所需的il-2和il-15细胞因子的情况下将培养物维持长达42天(将细胞密度保持在3x10⁵和2x10⁶活细胞/ml之间，并且培养的每周一，周三和周五补充细胞因子)。细胞在21天内在这些条件下通常扩增至约10⁹个细胞。在培养期结束时收集细胞，洗涤两次并配制在临床级冷冻保存培养基(cryostorecs5，biolifesolutions)中。

在t细胞输注的当天，将冷冻保存并释放的产物融化，洗涤并配制用于再输注。将含有释放的细胞产物的冷冻保存的小瓶从液氮储存中取出，融化，冷却并用pbs/2％人血清白蛋白(hsa)洗涤缓冲液洗涤。离心后，除去上清液并将细胞重悬浮于不含防腐剂的生理盐水(pfns)/2％hsa输注稀释剂中。取出样品用于质量控制测试。

实施例7-11中使用的技术

细胞系：将人转移性前列腺癌细胞系du145(atcchtb-81)和pc-3(atcccrl-1435)在含有10％胎牛血清(fbs，hyclone)和含有100u/ml青霉素，100ug/ml链霉素和0.25ug/ml氟比洛芬的1x抗生素-抗真菌药(gibco)的rpmi-1640(lonza)(完全rpmi)中培养。将人纤维肉瘤细胞系ht1080(atccccl-121)和人胚肾细胞293t(atcccrl-3216)在含有10％fbs，1x抗生素-抗真菌药，25mmhepes(irvinescientific)和2mml-谷氨酰胺(fisherscientific)的dulbecco改良eagles培养基(dmem，lifetechnologies)(完全dmem)中培养。将人前列腺癌异种移植物lapc-9(来自dr.robertreiter，ucla的馈赠)在含有20％fbs和1x抗生素-抗霉菌药的iscove改良dulbecco培养基(imdm，irvinescientific)(完全imdm)中培养。在雄性nod.cg-prkdc^scidil2rg^tmlwjl/szj(nsg)小鼠中连续传代lapc-9细胞，并如先前所述制备单细胞悬浮液(craftetal.1999cancerres59：5030)。简言之，收集肿瘤组织，在培养皿中切碎，并用1％链霉蛋白酶e(roche)消化。用完全imdm洗涤后，通过40μm细胞过滤器(falcon)过滤单细胞悬浮液，再次洗涤，并立即冷冻。在完全rpmi中培养ebv转化的类成淋巴细胞系(lcl)和含有膜锚定cd3ε特异性scfv激动剂okt3(lcl-okt3)的lcl细胞(wangetal.2011blood117：1888)。所有细胞在37℃，5％co2下培养。通过str概貌分析(profiling)验证du145和pc-3细胞并验证为支原体阴性(ddcmedical，oh)。

dna构建体和慢病毒产生：工程化改造du145和pc-3肿瘤细胞以表达psca，通过用携带在ef1α启动子控制下的人psca基因(登录号：nm_005672.4)的ephiv7慢病毒转导来进行。如下所述用小鼠抗人psca抗体(1g8)染色psca⁺细胞(参见“细胞内/细胞外染色和流式细胞术”部分)，然后使用bdfacsaria^tmspecialorderresearchproduct(sorp)细胞分选仪对facs进行分选。为了产生具有低psca表达的肿瘤细胞，如先前所述将psca基因置于突变形式的pgk启动子的控制下(frigaultetal.2015cancerimmunolres3：356)。a11scfv(lepinetal.2010eurjnuclmedmolimaging37：529)序列由annawu和robertreiter博士(ucla)友情提供。先前公开了mb1scfv序列(feldmannetal.2012jimmunol189：3249)。将具有由t2a核糖体跳跃序列分隔开的截短的cd19基因(cd19t)的car构建体克隆到ephiv7慢病毒骨架中。抗原靶向域包括a11或mb1scfv。细胞外间隔域包括igg4fc间隔区的129个氨基酸的中等长度ch2缺失形式(δch2)(jonnalagaddaetal.2015molther23：757)，胞内共刺激信号传导域含有具有cd28跨膜域的cd28或具有cd4跨膜域的4-1bb的。先前描述了cd3ζ细胞溶解域(cooperetal.2003blood101：1637)。

在用包装质粒和所需的car慢病毒骨架质粒转染之前1天在t-225组织培养瓶中接种293t细胞产生慢病毒。3至4天后收集上清液，过滤并离心以去除细胞碎片，并与2mm镁和25u/ml核酸内切酶(emdmillipore)温育以去除污染性核酸。将上清液组合并通过高速离心(6080g)在4℃过夜浓缩。然后将慢病毒沉淀重新悬浮于磷酸盐缓冲盐水(pbs)-乳糖溶液(4g乳糖/100mlpbs)中，等分取样并在-80℃贮存以供后来使用。通过使用ht1080细胞定量由cd19t表达确定的慢病毒滴度。

t细胞分离，慢病毒转导和离体扩增：根据希望之城(coh)内部审查委员会(intemalreviewboard)(irb)批准的方案，从同意的研究参与者(健康捐献者)获得白细胞分离术产物。在白细胞分离术当天，在ficoll-paque(gehealthcare)上通过密度梯度离心分离外周血单个核细胞(pbmc)，然后在pbs/edta(miltenyibiotec)中多次洗涤。细胞在旋转器上在室温(rt)下静置过夜，随后洗涤并重悬于完全x-vivo中。对于利用总pbmc的研究，将细胞立即冷冻在cs5冷冻保存培养基(biolifesolutions)中。将多达5x10⁹个pbmc与抗cd14，抗cd25和抗cd45ra微珠(miltenyibiotec)在室温温育30分钟并使用系统(miltenyibiotec)根据制造商的方案磁性消减。然后通过与生物素化的抗cd62l抗体(由希望之城生物药物和遗传学中心(centerforbiomedicineandgeneticsatcityofhope)产生)在室温温育30分钟，然后与抗生物素微珠(miltenyibiotec)在室温下再温育30分钟来对经消减的pbmc富集中央记忆t细胞(tcm)。然后使用系统(miltenyibiotec)根据制造商的方案磁性富集tcm。对于利用tcm的研究，如上所述立即冷冻细胞。通过流式细胞术验证pbmc和tcm的纯度和表型。

将新鲜融化的pbmc或tcm洗涤一次，并在含有100u/ml重组人il-2(rhil-2，novartisoncology)和0.5ng/ml重组人il-15(rhil-15，cellgenix)的具有10％fb的x-vivo-15(lonza)(完全x-vivo)中培养。对于car慢病毒转导，将t细胞与cd3/cd28(lifetechnologies)，硫酸鱼精蛋白(apppharmaceuticals)，细胞因子混合物(如上所述)和期望的慢病毒以不同moi在珠刺激当天或次日进行培养。通过在32℃下以2000rpm无制动离心30分钟来进行旋转接种(spinoculation)。然后在含有细胞因子的新鲜完全x-vivo中培养细胞并且每2-3天用所述含有细胞因子的新鲜完全x-vivo进行补充。7-9天后，将磁珠磁性去除，并将细胞进一步在含细胞因子的完全x-vivo中扩增以实现所需的细胞产量。使用easysep^tmcd19阳性富集试剂盒i或ii(stemcelltechnologies)根据制造商的方案针对cd19t阳性选择cart细胞。进一步扩增后，在体外功能测定和体内肿瘤模型之前冷冻细胞。通过流式细胞术验证cart细胞的纯度和表型。

细胞内/细胞外染色和流式细胞术：为了进行流式细胞术分析，将细胞重悬浮于含有2％fbs和1x抗生素和抗真菌药的facs缓冲液(不含ca²⁺，mg²⁺或酚红的hank平衡盐溶液(hbss^-/-，lifetechnologies)中。对于psca染色，小鼠抗人psca抗体(1g8)由robertreiter博士，ucla友情提供。为了检测carscfv，如先前所述[35]使用生物素化蛋白-l(genscriptusa)。细胞与一抗在黑暗中于4℃下温育30分钟，然后进行二次染色。对于细胞外和二次染色，将细胞在与异硫氰酸荧光素(fitc)，藻红蛋白(pe)，多甲藻素叶绿素蛋白复合体(percp)，percp-cy5.5，pe-cy7，别藻蓝蛋白(apc)，和从biolegend，ebioscience，bdbiosciences或fisherscientific购买的apc-cy7(或apc-efluor780)-偶联的抗体(cd3，cd4，cd8，cd14，cd19，cd25，小鼠或小鼠特异性cd45，cd45ra，cd45ro，cd62l，cd95，cd107a，cd137，lag3(cd223)，pd-1(cd279)，tim3(cd366)，ccr7，ifnγ，山羊抗小鼠ig，和链霉抗生物素)于4℃黑暗中温育30分钟前洗涤两次。使用4’，6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi，sigma)测定细胞活力。对于细胞内染色，将细胞固定，透化并根据peactive-caspase-3凋亡试剂盒(bdbiosciences)制造商的方案处理。然后将细胞与荧光基团偶联的抗体在4℃在黑暗中温育30分钟，并洗涤两次，之后重悬浮于facs缓冲液中和在macsquant分析仪10(miltenyibiotec)上采集。使用flowjo软件(v10，treestar)分析数据。

体外t细胞功能测定：对于脱粒和细胞内细胞因子测定，在圆底96孔组织培养物处理的板(corning)中，在没有外源细胞因子的完全x-vivo中以不同效应物：靶标比率共培养cart细胞和肿瘤靶标。将fitc-cd107a加入到培养物中，并在37℃温育4-6小时后，将细胞固定并透化，之后通过流式细胞术分析，如上所述。对于肿瘤杀伤测定，将cart细胞和肿瘤靶标在96孔板中在没有外源细胞因子的完全x-vivo中以不同效应物：靶标比率共培养1-5天并通过流式细胞术进行分析，如上所述。通过相对于由模拟物t细胞观察到的cd45阴性细胞比较cd45阴性细胞计数来计算cart细胞的肿瘤杀伤。

elisa和多重细胞因子测定：在高亲和力96孔平底板(corning)上，在1xpbs中4℃下将不同浓度的重组人psca蛋白质(氨基酸23-95；abnova)包被过夜。将孔用1xpbs洗涤两次，用10％fbs封闭1小时，并再次洗涤。将cart细胞(200μl中5×10³)加入到包被的孔中。在规定时，将肿瘤靶标(5×10³)与未包被的孔中的t细胞(终体积为200μl)温育。在37℃温育过夜后，收获上清液并根据humanifnγelisaready-set-go!(ebioscience)制造商的方案进行处理。使用wallacvictor31420multilabelcounter(perkin-elmer)和wallac1420workstation软件在450nm处读取平板。或者，使用multiplexbeadimmunoassaykit(invitrogen)根据制造商的方案分析上清液的多种细胞因子。根据制造商的方案运行小鼠血清上的人psa/klk3elisa(abcam)。

定量pcr：在rna分离之前，将肿瘤细胞(以0.25×10⁶/ml铺板)培养1天。使用minikit柱纯化(qiagen)提取rna。使用superscript^tmiv第一链合成系统(invitrogen)制备cdna。使用对psca(hs04166224g1，lifetechnologies)或gapdh(hs02758991_g1，lifetechnologies)特异的基因表达测定法产生rna引物。在viia^tm7实时pcr系统(thermofisher)上进行qpcr。在具有单一熔解曲线峰的指定动态范围内使用标准曲线验证引物组。将靶基因的表达相对于gapdh标准化。

体内肿瘤研究：所有动物实验都是在希望之城机构动物护理和使用委员会(cityofhopeinstitutionalanimalcareandusecommittee)批准的方案下进行。对于皮下肿瘤研究，在hbss^-/-中制备pc-3和du145细胞(2.5×10⁶)，并将其皮下注射到雄性nsg小鼠的左侧脱毛腹部中。通过卡尺测量每周监测肿瘤生长3次。一旦肿瘤体积达到50-500mm³，在pbs中制备cart细胞并通过瘤内(i.t.)或静脉内(i.v.)进行注射。一旦肿瘤直径达到15mm，将小鼠实施安乐死，收集肿瘤并如下所述处理用于免疫组织化学。当皮下肿瘤复发时，用psca-car或her2-car瘤内注射处理小鼠。通过经由肝素化毛细管(chasescientific)的眶后(ro)放血从异氟烷麻醉的小鼠收集外周血并且放入含有肝素/pbs溶液(1000单位/ml，sagentpharmaceuticals)的聚苯乙烯管中。每只小鼠收集大约150μl的血液。用1x红细胞裂解缓冲液(sigma)根据制造商的方案裂解血液，然后洗涤，染色并如上所述通过流式细胞术分析。

对于原位胫骨内肿瘤研究，用携带增强型绿色荧光蛋白(egfp)/萤火虫萤光素酶(ffluc)的慢病毒转导lapc-9和pc-3-psca以允许在一旦植入小鼠中便进行非侵入性光学成像(产生命名为lapc-9-egfp-ffluc和pc-3-psca-egfp-ffluc的系)。简言之，将这些系与聚凝胺(4mg/ml，sigma)和egfp-fluc慢病毒(参见上文)温育，然后使用bdfacsaria^tmsorp细胞分选仪对gfp⁺细胞进行细胞分选。如上所述，新鲜分选的lapc-9-egfp-fluc细胞在nsg小鼠中连续传代。如在皮下模型中那样制备pc-3-psca-egfp-fluc细胞(2×10⁵)或lapc-9-egfp-fluc细胞(1.5×10⁵)。在肿瘤注射之前通过腹膜内(i.p.)注射氯胺酮/甲苯噻嗪和气体异氟醚麻醉小鼠。将肿瘤细胞(在30mlhbss^-/-中)注射到小鼠后腿的胫骨内空间中。14天后，利用cart细胞静脉内注射小鼠。通过每两周光学成像(ivis，xenogen)监测肿瘤生长，并用livingimage软件(xenogen)分析流量信号。为了成像，利用pbs中悬浮的150μld-萤光素钾盐(perkinelmer)以4.29mg/小鼠腹膜内注射小鼠。

对于t细胞运输研究，利用野生型pc-3细胞(2×10⁵)植入小鼠的右侧胫骨内空间中，并用pc-3-psca细胞(2×10⁵)植入左侧胫骨内空间中。14天后，利用5x10⁶模拟物或已经利用携带egfp-ffluc的慢病毒共转导的psca(δch2)bbζcart细胞经静脉内注射小鼠。t细胞是经car富集的，并通过流式细胞术确定为约30％egfp⁺。在t细胞输注后4小时，1天，2天和4天通过非侵入性光学成像(xenogen)监测t细胞运输。如上所述分析流量信号。

免疫组织化学：将肿瘤组织在4％多聚甲醛(bostonbioproducts)中固定长达3天，并储存在70％乙醇中直至进一步处理。组织学由希望之城病理学中心(pathologycoreatcityofhope)进行。简言之，用小鼠抗人cd3(dako)，小鼠抗人psca(abcam)，大鼠抗人her2(dako)和大鼠抗人粒酶-b(ebioscience)染色石蜡包埋的切片。使用nanozoomer2.0ht数字载玻片扫描仪和相关的ndp.view2软件(hamamatzu)获得图像。

统计分析：数据以平均值±sem表示，除非另有说明。使用未配对的双尾student’st检验进行组间统计学比较以计算p值。*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001；ns，不显著。