本发明涉及酶的改造，特别涉及一种热稳定无机焦磷酸酶的改造。
背景技术：
在生物体内，NTPs/dNTPs参与核酸的生物合成会生成副产物焦磷酸盐，体内存在的焦磷酸盐会在焦磷酸酶的催化作用下分解，减少焦磷酸累积可能造成的负面效应。PCR利用嗜热酶模拟体内核酸复制的体外反应，伴随dNTPs的参入，焦磷酸的累积同样会降低PCR扩增的效率。
焦磷酸的积累，会导致反应混合物的pH降低，影响荧光染料的稳定性(罗氏，200510099911.5)。为了去除这些焦磷酸对PCR的抑制，人们在PCR反应中添加无机焦磷酸酶，用以将焦磷酸(PPi)会水解为正磷酸(Pi)。
这种反应，会使反应混合液的pH增加，并是的荧光染料变得更稳定。
为了适应PCR的高温，这种焦磷酸酶必须能耐受95℃的高温。
赵丹彤等人重组表达了超嗜热古菌(Pyrococcus horikoshii)的PPase基因(赵丹彤.重组超嗜热无机焦磷酸酶的表达、纯化及酶学性质研究[D].吉林大学,2003.)，这种酶最适温度为88℃，最适pH为10.3，并不适合PCR的使用。
牟航等人重组表达了嗜热栖热菌(Thermus thermophiles)HB27株的PPase基因(牟航,夏勇,吴学强,等.耐热无机焦磷酸酶的表达纯化与性质研究[C]//全国酶学学术讨论会暨邹承鲁诞辰85周年纪念会.2008.)，王磊等人重组表达了嗜热栖热菌HB8株的PPase基因。这种酶的最适温度在65℃，最适pH为8.0，适合PCR的使用。然而这种酶的95℃下的半衰期仅20min，不足以满足预变性时间较长，以及循环数较多的PCR反应。
由此，基于嗜热栖热菌的PPase基因，构建一种改造的热稳定无机焦磷酸酶，这种酶可以应用于需要更多循环数以及反应时间的超敏PCR扩增，增加反应的扩增效率。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的具有更高扩增效率的热稳定无机焦磷酸酶。
本发明所采取的技术方案是：
一种热稳定无机焦磷酸酶，由序列为SEQ ID NO:1的无机焦磷酸酶改造而来，其改造方法为下述方法中的至少一种：
1)将第6位氨基酸T改造为氨基酸S；
2)将第11位氨基酸E改为氨基酸K；
3)将第72位氨基酸L改为氨基酸I；
4)将第73位氨基酸V改为氨基酸I；
5)将第124位氨基酸D改造为氨基酸A；
6)将第160位氨基酸A改造为Q或K。
一种热稳定无机焦磷酸酶，其序列为：
MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:2)。
一种热稳定无机焦磷酸酶，其序列为：
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:3)。
本发明的有益效果是：改造后的无机焦磷酸酶，相较于改造之前，具有更高的扩增效率，热稳定性也更好。
附图说明
图1为焦磷酸酶扩增实验图；其中a为无机焦磷酸酶1扩增曲线，b为无机焦磷酸没2扩增曲线，c为改造前无机焦磷酸酶扩增曲线，d为不添加无机焦磷酸酶的扩增曲线。
具体实施方式
实施例热稳定无机焦磷酸酶的改造
商品化的热稳定无机焦磷酸酶(MCLAB，货号TL-100)，其序列为：MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIADVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRAAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:1)。
将上述酶的位点进行改造，改造位点及改造方法如下：
将原酶的序列的第6位氨基酸T改造为氨基酸S；第11位氨基酸E改为氨基酸K；第72位氨基酸L改为氨基酸I或者第73位氨基酸V改为氨基酸I；第124位氨基酸D改造为氨基酸A；第160位氨基酸A改造为Q或K。
获得两条氨基酸序列如下的热稳定焦磷酸酶：
无机焦磷酸酶1：
MANLKSLPVGKKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGIVLSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRQAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:2)。
无机焦磷酸酶2
MANLKTLPVGEKAPEVVNMVIEVPRGSGNKYEYDPGLGVIKLDRVLPGAQFYPGDYGFIPSTLAEDGDPLDGLILSTYPLLPGVVVEVRVVGLLLMEDEKGGDAKIIGVVAEDQRLDHIQDIAAVPEGVKQEIQHFFETYKALEAKKGKWVRVTGWRDRKAALEEVKACIARYGK(SEQ ID NO:3)。
按照上述焦磷酸酶的氨基酸序列人工合成对应的碱基序列，扩增构建表达载体，表达蛋白并进行纯化。
实验例改造酶效果的检测
将本专利中改造的热稳定无机焦磷酸酶，以及商品化的热稳定无机焦磷酸酶(MCLAB，货号TL-100)，0.05U，0.5μL用酶透析液稀释成0.1U/μL。
使用广州海力特的HBV DNA检测试剂盒(国械注准20163400199)，检测HBV病毒，按下表进行实验：
除添加无机焦磷酸酶以外，按试剂盒说明书进行操作，使用ABI 7500荧光PCR仪进行扩增，实验结果如图1所示，结果表明，焦磷酸酶1扩增时Ct值为11.38，焦磷酸酶2扩增时Ct值为11.61，原始热稳定无机磷酸酶扩增时Ct值为15.55，而不添加无机磷酸酶的扩增时Ct值为17.45。由此可见经过改造后的无机焦磷酸酶扩增效率更高，热稳定性更好。
SEQUENCE LISTING
<110> 广州海力特生物科技有限公司
<120> 一种改造的热稳定无机焦磷酸酶
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 175
<212> PRT
<213> 无机焦磷酸酶
<400> 1
Met Ala Asn Leu Lys Thr Leu Pro Val Gly Glu Lys Ala Pro Glu Val
1 5 10 15
Val Asn Met Val Ile Glu Val Pro Arg Gly Ser Gly Asn Lys Tyr Glu
20 25 30
Tyr Asp Pro Gly Leu Gly Val Ile Lys Leu Asp Arg Val Leu Pro Gly
35 40 45
Ala Gln Phe Tyr Pro Gly Asp Tyr Gly Phe Ile Pro Ser Thr Leu Ala
50 55 60
Glu Asp Gly Asp Pro Leu Asp Gly Leu Val Leu Ser Thr Tyr Pro Leu
65 70 75 80
Leu Pro Gly Val Val Val Glu Val Arg Val Val Gly Leu Leu Leu Met
85 90 95
Glu Asp Glu Lys Gly Gly Asp Ala Lys Ile Ile Gly Val Val Ala Glu
100 105 110
Asp Gln Arg Leu Asp His Ile Gln Asp Ile Ala Asp Val Pro Glu Gly
115 120 125
Val Lys Gln Glu Ile Gln His Phe Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Leu Glu
130 135 140
Ala Lys Lys Gly Lys Trp Val Arg Val Thr Gly Trp Arg Asp Arg Ala
145 150 155 160
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