映－三白草酮类衍生物及其在制备抗肿瘤药物中的应用的制作方法

本发明属于药物合成领域，涉及映-三白草酮类衍生物及其制备方法以及在制备抗肿瘤药物中的应用，尤其是映-三白草酮类衍生物在制备抑制肿瘤细胞生长的药物方面的应用或在制备抑制肿瘤细胞转移药物方面的应用。

背景技术：

癌转移是指恶性肿瘤细胞脱离原发肿瘤，通过各种转移方式到达继发组织或器官后得以继续增殖生长，形成与原发肿瘤相同性质的继发肿瘤的全过程。癌转移是恶性肿瘤的基本生物学特征，同时也是临床上绝大多数肿瘤患者的致死因素。目前国内没有专门抑制癌转移的药物上市，寻求开发新型抗癌转移药物刻不容缓。

肿瘤发生侵袭转移现象主要包括以下十一个步骤：1.肿瘤细胞降解基底膜，侵袭周围组织。2.肿瘤细胞脱离原发瘤。3.肿瘤细胞向周围侵袭、迁移。4.肿瘤细胞侵入血管或淋巴管。上述四个步骤可以作为一个阶段，即入血管前的阶段。5.肿瘤细胞在血液、淋巴循环中运行。6.肿瘤细胞在血液、淋巴循环中存活。由于血液里有一些免疫细胞和免疫因子，以及血液的剪切力等，因此并不太容易存活，有大量的细胞侵入，只有少部分能够存活，存活下来的细胞才能继续转移。7.肿瘤细胞在靶部位与血管内皮黏附。这三个步骤为在血管里的阶段。8.肿瘤细胞穿出血管。9.肿瘤细胞与实质器官组织黏附、生长形成继发瘤。10.继发瘤向周围侵袭。11.全身转移扩散。最后四个步骤为穿出血管后的阶段。其中，最可怕是最后的两个步骤，即形成转移瘤并全身转移扩散。

映-三白草酮，是从三白草中分离纯化出的一种结构独特的木脂素。分子式：C₂₀H₂₀O₆，分子量：356，性状：白色晶体，其结构式如下：

目前对于映-三白草酮的相关研究主要集中在抗炎，肝保护等方面。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一系列映-三白草酮类衍生物。

本发明的目的可通过以下措施来达到：

如式I所示的映-三白草酮类衍生物：

其中，n＝1-5。

优选的，本发明所述的映-三白草酮类衍生物为：2′-亚胺基-氧-乙酰羟胺-映-三白草酮、2′-亚胺基-氧-丙酰羟胺-映-三白草酮、2′-亚胺基-氧-丁酰羟胺-映-三白草酮、2′-亚胺基-氧-戊酰羟胺-映-三白草酮、2′-亚胺基-氧-己酰羟胺-映-三白草酮。

本发明的另一个目的是提供式I所示的映-三白草酮类衍生物的制备方法，包括：以映-三白草酮为原料，与盐酸羟胺(hydroxylamine hydrochioride)溶于吡啶(pyridine)溶剂中加热回流反应生成2′-肟基-映-三白草酮，在冰浴条件下，将2′-肟基-映-三白草酮与Br(CH₂)_nCOOCH₂CH₃(n＝1-5)溶于N，N-二甲基甲酰胺(DMF)中，加入氢化钠(NaH)作为缚酸剂，反应得到黄色粘稠物，将其溶于二氯甲烷/甲醇(1∶1V/V)混合溶剂中，加入盐酸羟胺和氢氧化钠(NaOH)，室温反应过夜，生成2′-亚胺基-氧-乙酰羟胺-映-三白草酮，其反应式为：

所述的映-三白草酮与盐酸羟胺的摩尔比为1∶1～2，优选为1∶1.5。

所述的2′-肟基-映-三白草酮、氢化钠、Br(CH₂)_nCOCH₂CH₃、盐酸羟胺、氢氧化钠的摩尔比为1∶1～3∶1～2∶1～3∶1～3，优选为1∶2∶1.5∶2∶2.5。其中氢氧化钠作为缚酸剂中和盐酸羟胺中的盐酸。

进一步的，反应结束后，反应液减压浓缩，采用硅胶柱层析、以二氯甲烷/甲醇＝30∶1V/V为洗脱液进行洗脱，得到式I所示的目标化合物。

发明人细胞模型筛选实验，对合成的映-三白草酮类衍生物进行了体外人肝癌SMMC-7721细胞、HCCLM3细胞的细胞毒活性测试，化合物均表现出很强的细胞毒活性，且明显强于姜黄素和映-三白草酮。进一步对合成的衍生物以非细胞毒剂量进行抗癌细胞迁移、侵袭活性测试，结果表明化合物在极低浓度下对SMMC-7721细胞表现出极强的抑制迁移、侵袭能力，具有明显的抑制作用，且明显强于映-三白草酮。

因此，本发明的另一个目的是提供式I所示的映-三白草酮类衍生物在制备治疗肿瘤药物方面的应用。

优选的，所述的应用为在制备抑制肿瘤细胞生长的药物方面的应用或所述的应用为在制备抑制肿瘤细胞转移药物方面的应用。所述的肿瘤细胞转移指肿瘤细胞迁移、侵袭。

所述的肿瘤为肝癌。

本发明的有益效果：

本发明以活性成分映-三白草酮为先导，合成了一系列映-三白草酮类衍生物，合成的映-三白草酮类衍生物在抑制细胞增殖和抑制癌细胞转移方面表现出极强的活性，有望成为治疗肿瘤侵袭转移方面的新型候选药物。

附图说明

图1为化合物对肝癌细胞迁移能力的影响。

图2为化合物抑制癌细胞迁移能力的测试结果量化分析图。

图3为化合物对肝癌细胞侵袭能力的影响。

图4为化合物抑制癌细胞侵袭能力的测试结果量化分析图。

具体实施方式

结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步详细的说明，但本发明并不限于以下实施例。

实施例1 2′-亚胺基-氧-乙酰羟胺-映-三白草酮(化合物1)的制备

在50mL单颈瓶中加入映-三白草酮350mg(0.010mol)，盐酸羟胺100mg(0.015mol)，吡啶5mL，搅拌溶解，加热回流10h。反应液降至室温，减压回收溶剂，残渣加10mL水混悬，用二氯甲烷萃取3次，每次10mL。合并有机层，无水Na₂SO₄干燥，浓缩二氯甲烷，得粘稠状物。用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷洗脱，得白色粉末结晶210mg，产率58.3％。经鉴定为2′-肟基-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：372.2[M+H]⁺相对分子质量：371.2。

¹H-NMR(300MHz，DMSO-d₆)δ：8.94(1H，s)，6.87(1H，s)，6.40(1H，s)，6.34(1H，s)，5.95(1H，s)，5.90(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，3.09(1H，d，J＝3Hz)，2.81(1H，s)，2.51(1H，d，J＝6Hz)，2.30(1H，m)，1.91(1H，m)，1.88(1H，m)，1.68(1H，s)，1.24(3H，d，J＝6Hz)，0.77(3H，d，J＝6Hz)。

将2′-肟基-映-三白草酮200mg(0.540mmol)溶解在5mL DMF中，冰浴下加入氢化钠12.9mg(1.080mmol)，溴乙酸乙酯65.6μL(0.594mmol)，搅拌反应2h，TLC监测至反应完全，减压浓缩得黄色粘稠物。用10mL二氯甲烷/甲醇混合溶剂将其溶解，加入盐酸羟胺74.9mg(1.08mmol)，氢氧化钠43.1mg(1.08mmol)，室温反应过夜。TLC监测至反应结束，减压浓缩得黄色粘稠物。用硅胶柱层析纯化，二氯甲烷/甲醇＝30∶1V/V洗脱，得黄色油状物52.6mg，产率22.0％。经鉴定为2′-亚胺基-氧-乙酰羟胺-映-三白草酮。

ESI-MS m/z：467.2[M+Na]⁺，相对分子质量为444.2

¹H-NMR(300MHz，CDCl₃)δ：6.85(1H，s)，6.49(1H，s)，6.18(1H，s)，5.93(1H，s)，5.89(1H，s)，5.61(1H，s)，5.54(1H，s)，4.65(2H，s)，3.09(1H，d，J＝3Hz)，2.77(1H，m)，2.50(1H，m)，2.30(1H，m)，1.97(1H，m)，1.89(1H，m)，1.69(1H，m)，1.25(3H，d，J＝6Hz)，0.76(3H，d，J＝6Hz).

实施例2化合物体外抑制肿瘤细胞增殖实验(MTT法)

1、实验方法

(1)细胞株及试剂

人肝癌细胞株SMMC-7721，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；

人肝癌细胞株HCCLM3，购自中国科学院上海生命科学研究院细胞库；

高糖DMEM培养液，购自美国Gibco公司；

胎牛血清，购自杭州四季青公司；

胰酶细胞消化液，购自上海碧云天生物技术有限公司；

噻唑蓝(MTT)，购自sigma公司。

PBS缓冲盐溶液：磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.27g，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.42g，氯化钠(NaCl)8g，氯化钾(KCl)0.2g，加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸调pH至7.4，最后定容到1L，高温高压灭菌后置于4℃冰箱保存待用。

(2)受试药品溶液

以姜黄素对照药，姜黄素、映-三白草酮、化合物1分别用DMSO溶解配制成80mM的溶液，用高糖DMEM培养液稀释为80μM的母液，在此基础上依次用高糖DMEM培养液稀释得80，60，40，20，10，5，2.5，1，0.5μM的受试药品溶液，4℃保存备用。

(3)细胞培养

人肝癌细胞SMMC-7721，HCCLM 3在含10％胎牛血清的DMEM培养液中，37℃、5％CO₂保持饱和湿度培养，2-3天传代一次。

分别取对数生长期癌细胞一瓶，加入胰酶细胞消化液消化，使贴壁细胞脱落，配制成浓度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，96孔细胞培养板中每孔加入100μL细胞悬液(每孔5×10³个细胞)，板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养24小时。弃去培养液，PBS缓冲盐溶液清洗2次，受试组每孔加入100μL相应的含不同浓度受试药品溶液的高糖DMEM培养液；阴性对照组只加等量高糖DMEM培养液。

96孔板置于37℃，5％CO₂培养箱中培养72小时，每孔加入10μL MTT溶液(5mg/mL)，在培养箱继续培养4小时。弃去培养基，每孔加入150μL DMSO溶解，摇床10分钟轻轻混匀；每孔的吸光度(OD值)用1500酶标仪在490nm波长下进行检测，计算抑制率和IC₅₀值。

抑制率(％)＝(阴性对照组OD值-受试组OD值)/阴性对照组OD值×100％

应用GraphPad Prism 5软件计算IC₅₀。

2、实验结果

表1化合物1对肝癌细胞的细胞毒活力测试结果

由表1可知，与姜黄素和映-三白草酮相比，化合物1对肝癌SMMC-7721，HCCLM3细胞表现出非常强的抑制肿瘤细胞增殖作用，且明显强于姜黄素和映-三白草酮。

实施例3体外细胞水平检测化合物对肝癌细胞SMMC-7721迁移能力的影响

1、实验方法

运用细胞划痕法，以姜黄素作、映-三白草酮为对照药，对姜黄素、映-三白草酮、以及化合物1进行体外抗肝癌细胞SMMC-7721迁移活性筛选。具体实验步骤为：用marker笔在6孔板背后，用直尺比着均匀的划横线；将培养在含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基中细胞接种于6孔板中培养单层细胞至100％，使用无菌枪头(100μL)尖端比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜；用PBS清洗细胞3次，弃去划下的细胞，分别加入20μmol/L姜黄素，20μmol/L映-三白草酮和2μmol/L化合物1受试药品溶液，并设置不加药物的对照孔，置于培养箱中培养24h后，放在光学显微镜上于固定位置取样，拍照，记录划痕两端细胞间距的变化。

2、实验结果

图1和图2表明，与20μmol/L姜黄素和20μmol/L映-三白草酮相比，2μmol/L化合物1在极低浓度下表现出极强的抑制癌细胞迁移能力，且明显强于姜黄素和映-三白草酮。

实施例4体外细胞水平检测化合物对肝癌细胞SMMC-7721侵袭能力的影响

1、实验方法

(1)准备：实验前将冻存在-20℃的BD Matrigel基质胶置入4℃的冰箱内过夜，让其融化成液体状态备实验用。

(2)包被基底膜：Transwell小室上室内层的底部膜面用50mg/L Matrigel 1∶30稀释液(用DMEM培养基稀释，60μL)包被，常温条件下晾干。

(3)水化基底膜：弃去培养板中的液体，给每孔中加入高糖DMEM培养液100μL，37℃恒温孵箱中放置30min。

(4)取对数生长期的SMMC-7721细胞，用胰酶细胞消化液消化收集，放入4℃离心机以800rpm离心5min，然后加入高糖DMEM培养液重悬细胞，将细胞浓度调整为1×10⁵个/mL的单细胞悬液。

(5)细胞计数：使用血细胞计数板法计数：将血细胞计数板和盖玻片用75％洒精消毒擦净，待其干燥后将盖玻片放在计数室上。用微量加样器吸取细胞悬液后于计数板上盖玻片一端将细胞悬液注入其下方的计数室内，避免产生气泡，在显微镜下计数四角大格内的细胞数。将计数结果套入如下公式计算出细胞密度：

细胞数/ml＝4大格细胞总数/4×10000×稀释倍数

(6)在Transwell小室上室中接种细胞悬液100μL。分别给24孔板内加入含10％胎牛血清的DMEM培养液或药液600μL，将Transwell小室置于其中，放入37℃孵箱继续培养24h。

(7)取出小室，吸出上室内残余的液体，用PBS淋洗，然后4％多聚甲醛固定30min，接着用4g/L的结晶紫溶液染色15min后再用PBS缓冲盐溶液淋洗。最后用PBS缓冲盐溶液浸湿的棉签小心擦去小室内部微孔膜上的细胞。

(8)在倒置显微镜下随机选取5个视野(200×)进行拍照，实验重复3次。

(9)统计方法：计数时，每空选取5个视野分别计数，取平均值。

2、实验结果

图3表示抑制细胞侵袭活性随着映-三白草酮和化合物1浓度的上升而呈现梯度增强，即化合物对细胞侵袭呈现出浓度依赖性的抑制活性。图4表示映-三白草酮和化合物1抑制癌细胞侵袭能力测试结果量化分析。化合物1在极低浓度下表现出极强的抑制癌细胞侵袭能力，且明显强于映-三白草酮。