一种8‑氮杂香豆素的合成方法及其在抗肿瘤药物中的应用与流程

本发明属于新化合物合成和药物应用领域，涉及8-氮杂香豆素类化合物，包括合成、评价及应用。

技术背景

香豆素，又称1,2-苯并吡喃酮，是一种用途广泛的香料。研究表明：香豆素具有广泛的药理作用，如抗肿瘤、抗艾滋病、抗细菌、抗凝血、抗氧化、增强人体免疫功能，光敏等作用，具有潜在的药用价值，因而被广泛应用于农业，医药，制药等行业。但经典的香豆素类化合物具有水溶性差的明显缺点，限制了其应用。虽然可以通过在底物母体上引入水溶性基团而提高水溶性，但由于引入多余的官能团往往造成化合物活性降低，此外增加了成本。氮杂香豆素是香豆素的电子等排体，但由于结构中含有吡啶环而具有较好的水溶性，且有文献报道该类化合物具有比香豆素更好的光化学性质。因此，开发氮杂香豆素类化合物的合成方法受到许多化学家的关注。

1978年，Ronald L.Atkins等人用von Pechmann反应，以2,6-二羟基吡啶为原料，乙醇为溶剂，与乙酰乙酸乙酯在加热条件下反应合成4-甲基-7-羟基-8-氮杂香豆素。该反应条件较为苛刻,反应时间长,收率很低。此外，该方法仅能合成7-位具有给电子基的8-氮杂香豆素类化合物，限制了其应用。1993年，D.Billeret等以4-羟基-3-吡啶醛为原料，首先用Knoevenagel-Doebner反应条件得到反式-4-羟基-3-吡啶丙烯酸，再在吡啶盐酸盐高温条件下脱水关环得到6-氮杂香豆素。该反应需要高温,且收率较低。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种8-氮杂香豆素的合成方法，本方法是以氮氧化物为底物，乙酸酐为溶剂，碳酸钾为碱，在120～140度下，反应生成8-氮杂香豆素类化合物。本方法具有操作简便，反应选择性高，底物适用性广，产率高等显著优点。此外，该类化合物水溶性显著提高，相关抗肿瘤活性研究发现其活性并未降低，甚至有提高。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一类8-氮杂香豆素类化合物的结构，结构通式如下：

其中，R₁为取代的氢、芳基或烷基，R₂为在吡啶环4,5,6位取代的氢，卤素，硝基，芳基，羧基，三氟甲基，酯基，烷基或烷氧基，R₃为在喹啉环4,5,6,7,8位取代的氢，卤素，硝基，芳基，羧基，三氟甲基，酯基，烷基或烷氧基。R₃和R₄为氢原子，或者碳原子并与所连接的吡啶环上的两个碳形成5-7元芳香环或芳香杂环；

化合物I是通过以下合成路线得到的：

该反应所用的溶剂为乙酸酐。反应温度为120～140度，反应时长为6～14小时。

氮氧化物(II)是通过以下合成路线得到的：

即以III为原料，在醋酸钯催化下，与丙烯酸甲酯类化合物发生Heck反应得到IV，IV在碱作用下水解得到羧酸V，再用间氯过氧苯甲酸(mCPBA)氧化得到II。

已合成的8-氮杂香豆素类化合物的命名与结构如下表所示：

表1一类8-氮杂香豆素类化合物

本发明的优点和积极效果：

1、本发明采用价廉易得的氮氧化物为原料，所发明的反应方法具有位置选择性高，底物适用性广，产率高等显著优点。

2、本发明的反应不需无水无氧操作，操作简便，适合大规模生产和开发。

3、本发明方法能得到不同位置取代的8-氮杂香豆素类化合物，且适用于各类取代基。可以按照本发明的原理进行推广使用，适用性很好。

4、本发明所涉及的氮杂香豆素类化合物比相应的香豆素类化合物水溶性得到明显改善，但并未在母体结构中引入多余的水溶性基团。

5、本发明所涉及的氮杂香豆素类化合物具有较好的抗肿瘤活性，个别活性较相应香豆素类化合物有较大的提高。

附图说明

图1为化合物4在氘代三氯甲烷中的核磁氢谱图；

图2为化合物4在氘代三氯甲烷中的核磁碳谱图；

图3为化合物10在氘代三氯甲烷中的核磁氢谱图；

图4为化合物10在氘代三氯甲烷中的核磁碳谱图；

图5为化合物13在氘代甲醇中的核磁氢谱图；

图6为化合物13在氘代甲醇中的核磁碳谱图。

具体的实施方式

为了理解本发明，下面结合实施例对本发明作进一步说明：下述实施例是说明性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

化合物I是通过以下合成路线得到的：

即以III为原料，在醋酸钯催化下，与丙烯酸甲酯类化合物发生Heck反应得到IV；IV在碱作用下水解得到羧酸V；再用间氯过氧苯甲酸(mCPBA)氧化得到II；最后以乙酸酐为溶剂，碳酸钾为碱，发生关环反应得到终产物8-氮杂香豆素I。

1、Heck反应操作

将3-溴吡啶类底物III(1.0equiv),丙烯酸甲酯类底物(1.5equiv)用除氧DMF溶解(底物浓度0.2mol/L)，依次向溶液中加入DABCO(0.04equiv)，K₂CO₃(1.0equiv)，Pd(OAc)₂(0.02equiv),氩气保护，125℃反应12小时。冷却到室温后，将不溶物过滤掉，滤饼用少量水和乙酸乙酯淋洗。母液中加入适量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗，干燥，过滤，浓缩得到粗产品。柱层析纯化(10:1～3:1)得到产物IV。

2、水解反应操作

在圆底烧瓶中依次加入化合物III(1.0eq.)，氢氧化钠水溶液(3M，3.0eq.),加入甲醇(底物浓度1.0mol/L)，然后加热至回流搅拌数个小时，TLC跟踪反应直至反应结束(需要1～5h)。反应完全后冷却至室温，减压蒸馏除掉甲醇。水相用3mol/L盐酸水溶液调节pH 5～6.析出大量固体，用布氏漏斗抽滤，滤饼用适量水淋洗。再用真空干燥得到相应产物IV。直接投入下一步反应。

3、氧化反应操作

在圆底烧瓶中加入化合物IV，再加入溶剂二氯甲烷(底物浓度0.5mol/L)。然后温度降至0℃，加间氯过氧苯甲酸(1.2eq.)。室温搅拌过夜，析出白色固体，次日TLC跟踪反应直到反应结束。用布氏漏斗抽滤，固体用乙醚打浆2～3次。在45℃真空干燥，得到相应产物II。

4、关环反应操作

在圆底烧瓶中依次加入化合物II(1.0eq.)，碳酸钾(3.0eq.)、水(7.0eq.)，加入乙酸酐(底物浓度0.2mol/L)，然后加热至120～140度反应，TLC跟踪反应直到反应结束(需要6～14h)。降至室温后，减压蒸干溶剂。加入乙酸乙酯与水，取上层有机相。对水相萃取两次后，合并有机相，干燥，浓缩后得粗产品。用二氯甲烷：甲醇＝100:1～30:1作为流动相，柱层析得到I(表1所示各化合物)，产率31-92％。

下面通过实施例具体说明。

实施例1

化合物1的合成。

将3-溴喹啉(2.3g,1.0eq.),丙烯酸甲酯(1.5equiv)用除氧DMF溶解(底物浓度0.2mol/L)，依次向溶液中加入三乙烯二胺(0.04equiv)，K₂CO₃(1.0equiv)，Pd(OAc)₂(0.02equiv),氩气保护，125℃反应12小时。冷却到室温后，将不溶物过滤掉，滤饼用少量水和乙酸乙酯淋洗。母液中加入适量水，用乙酸乙酯萃取3次，合并有机相，饱和食盐水洗，干燥，过滤，浓缩得到粗产品。柱层析纯化(10:1～3:1)得到产物3-喹啉丙烯酸甲酯(1.7g,73％)。

在圆底烧瓶中依次加入3-喹啉丙烯酸甲酯(2.90g,1.0eq.)，氢氧化钠水溶液(3M,3.0eq.)，甲醇(底物浓度1.0mol/L)，然后加热至回流，TLC跟踪反应直至反应结束(需要1～5h)。反应完全后冷却至室温，减压蒸馏除掉甲醇。水相用3mol/L盐酸水溶液调节pH 5～6.析出大量固体，用布氏漏斗抽滤，滤饼用适量水淋洗。再用真空干燥得到3-喹啉丙烯酸(2.12g,80％)。直接投入下一步反应。

在圆底烧瓶中加入上步所得产物(2.12g，1.0eq.)，再加入二氯甲烷溶解(底物浓度0.5mol/L)。然后温度降至0℃，加入间氯过氧苯甲酸(1.2eq.)。室温搅拌过夜，析出白色固体。用布氏漏斗抽滤，固体用乙醚打浆2～3次。在45℃真空干燥，得到相应产物II(2.1g，92％)。

在圆底烧瓶中依次加入上步所得产物(150mg，1.0eq.)，碳酸钾(3.0eq.)，水(7.0eq.)，乙酸酐(底物浓度0.2mol/L)，然后加热至140度搅拌过夜。降至室温后，减压蒸干溶剂。加入乙酸乙酯与水，取上层有机相。对水相萃取两次后，合并有机相，干燥，浓缩后得粗产品。用二氯甲烷：甲醇＝100:1～30:1作为流动相，柱层析得到化合物1(124mg)，产率90％。结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.38(s,1H),8.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.93(d,J＝8.4Hz,1H),7.85-7.82(m,2H),7.59(t,J＝7.2Hz,1H),6.55(d,J＝9.6Hz,1H).符合标准品的结构特征。

实施例2

化合物2的合成。

实施例2的合成方法同上述合成通法。

4-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]quinolin-2-one

收率：61％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),8.09(d,J＝8.8Hz,1H),7.84–7.82(m,2H),7.61–7.52(m,6H),6.50(s,1H)；HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₁₈H₁₁NO₂H⁺[(M+H)⁺]:274.0863,found 274.0863.

实施例3

化合物3的合成。

实施例3的合成方法同上述合成通法。

2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：70％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl3)δ8.53(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.90(dd,J＝7.2,1.6Hz,1H),7.72(d,J＝9.6Hz,1H),7.31(dd,J＝7.6,4.8,1H),6.51(d,J＝9.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.2,159.0,150.8,142.1,137.3,121.2,118.5,114.2.符合标准品的结构特征。

实施例4

化合物4的合成。

实施例4的合成方法同上述合成通法。

6-fluoro-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：65％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.39(d,J＝2.8Hz,1H),7.70(d,J＝9.6Hz,1H),7.63(dd,J＝7.2,3.2Hz,1H),6.58(d,J＝9.6Hz,1H)；HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₈H₄NO₂FH⁺[(M+H)⁺]:166.0299,found 166.0305.

实施例5

化合物5的合成。

实施例5的合成方法同上述合成通法。

6-chloro-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：80％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.47(d,J＝2.4Hz,1H),7.87(d,J＝2.4Hz,1H),7.66(d,J＝9.6Hz,1H),6.57(d,J＝9.2Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.6,157.1,149.2,140.9,136.1,128.4,119.6,114.8.HRMS(ESI-TOF)m/zcalcd.for C₈H₄NO₂ClH⁺[(M+H)⁺]:182.0003,found 182.0009.

实施例6

化合物6的合成。

实施例6的合成方法同上述合成通法。

6-bromo-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：49％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.01(d,J＝2.4Hz,1H),7.66(d,J＝9.6Hz,1H),6.56(d,J＝9.6Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.5,157.5,151.4,140.9,139.0,119.5,116.1,115.4.HRMS(ESI-TOF)m/zcalcd.for C₈H₄NO₂BrH⁺[(M+H)⁺]:225.9498,found 225.9495.

实施例7

化合物7的合成。

实施例7的合成方法同上述合成通法。

6-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：76％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.36(s,1H),7.66-7.69(m,2H),6.50(d,J＝9.6Hz,1H),2.43(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.5,157.2,151.0,142.0,137.2,130.9,118.4,113.6,17.8.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found 162.0552.

实施例8

化合物8的合成。

实施例8的合成方法同上述合成通法。

ethyl 2-oxo-2H-pyrano[2,3-b]pyridine-6-carboxylate

收率:55％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ9.14(d,J＝2.0Hz,1H),8.51(d,J＝2.4Hz,1H),7.78(d,J＝9.6Hz,1H),6.59(d,J＝9.6Hz,1H),4.46(q,J＝7.2Hz,2H),1.44(t,J＝7.2Hz,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ164.0,161.1,159.4,152.2,141.7,138.6,124.3,119.2,113.6,62.1,14.4.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₁₁H₉NO₄H⁺[(M+H)⁺]:220.0604,found 220.0598.

实施例9

化合物9的合成。

实施例9的合成方法同上述合成通法。

6-methoxy-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：59％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.23(d,J＝2.8Hz,1H),7.67(d,J＝9.6Hz,1H),7.34(d,J＝2.8Hz,1H),6.52(d,J＝9.6Hz,1H),3.92(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ160.5,153.6,153.1,141.8,138.6,119.9,118.9,113.9,56.5.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd for C₉H₇NO₃H⁺[(M+H)⁺]:178.0499,found 178.0502.

实施例10

化合物10的合成。

实施例10的合成方法同上述合成通法。

6-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：88％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.75(s,1H),8.04(s,1H),7.78(d,J＝9.6Hz,1H),7.60–7.58(m,2H),7.52(t,J＝7.2Hz,2H),7.45(t,J＝7.2Hz,1H),6.57(d,J＝9.6Hz,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.2,158.2,149.2,142.1,136.2,135.2,134.9,129.5,128.8,127.3,118.8,113.9.

实施例11

化合物11的合成。

实施例11的合成方法同上述合成通法。

7-(trifluoromethyl)-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率:73％；；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.13(d,J＝6.8Hz,1H),7.82(d,J＝9.2Hz,1H),7.70(d,J＝7.2Hz,1H),6.65(d,J＝9.2Hz,1H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ158.7(d,J＝50Hz),148.3(d,J＝36Hz),140.9,139.0,122.1,120.5,119.3,117.7(d,J＝3.00Hz),116.8.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₄NO₂F₃H⁺[(M+H)⁺]:216.0267,found 216.0257.

实施例12

化合物12的合成。

实施例12的合成方法同上述合成通法。

4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：85％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.54(dd,J＝4.8,1.6Hz,1H),7.99(dd,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.33(dd,J＝8.0,4.8Hz,1H),6.37(s,1H),2.46(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,158.5,151.2,150.8,134.3,121.0,116.6,115.5,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found162.0558.

实施例13

化合物13的合成。

实施例13的合成方法同上述合成通法。

3-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：53％；结构参数:¹H NMR(400MHz,MeOD)δ8.41(d,J＝3.6Hz,1H),8.07(d,J＝7.6Hz,1H),7.79(s,1H),7.40(dd,J＝7.6,4.8Hz,1H),2.20(s,3H).¹³C NMR(100MHz,MeOD)δ163.1,159.4,149.8,139.5,138.5,128.7,122.5,116.7,16.9.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₂H⁺[(M+H)⁺]:162.0550,found 162.0547.

实施例14

化合物14的合成。

实施例14的合成方法同上述合成通法。

4-phenyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：87％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(dd,J＝4.8,1.2Hz,1H),7.91(dd,J＝7.6,1.2Hz,1H),7.57–7.55(m,3H),7.45–7.43(m,2H),7.28(d,J＝4.8,1H),6.47(s,1H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,159.1,154.5,150.9,136.6,134.2,130.3,129.3,128.5,121.0,116.5,114.6.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₁₄H₉NO₂H⁺[(M+H)⁺]:224.0706,found 224.0709.

实施例15

化合物15的合成。

实施例15的合成方法同上述合成通法。

3-(3,4-dimethoxyphenyl)-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：92％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.51(d,J＝4.8Hz,1H),7.93(d,J＝7.6Hz,1H),7.76(s,1H),7.33–7.28(m,3H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H),3.95(s,3H),3.93(s,3H)；¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ160.1,158.2,150.3,149.9,148.9,137.0,136.8,129.7,126.8,121.5,121.3,115.2,111.9,111.2,56.2,56.1.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₁₆H₁₃NO₄H⁺[(M+H)⁺]:284.0917,found 284.0922.

实施例16

化合物16的合成。

实施例16的合成方法同上述合成通法。

6-chloro-4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：91％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.46(d,J＝2.4Hz,1H),7.93(d,J＝2.4Hz,1H),6.41(s,1H),2.44(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.5,156.7,150.2,149.1,133.5,128.4,117.5,116.3,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₆NO₂Cl H⁺[(M+H)⁺]:196.0160,found 196.0154.

实施例17

化合物17的合成。

实施例17的合成方法同上述合成通法。

6-bromo-4-methyl-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：76％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.56(d,J＝2.4Hz,1H),8.08(d,J＝2.0Hz,1H),6.40(s,1H),2.45(s,3H).¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)δ159.4,157.1,151.3,150.2,136.3,117.4,116.9,116.0,18.2.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.forC₉H₆NO₂Br H⁺[(M+H)⁺]:239.9655,found 239.9659.

实施例18

化合物18的合成。

实施例18的合成方法同上述合成通法。

5-methoxy-2H-pyrano[2,3-b]pyridin-2-one

收率：31％；结构参数:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.40(d,J＝5.6Hz,1H),8.02(d,J＝9.6Hz,1H),6.77(d,J＝5.6Hz,1H),6.41(d,J＝9.6Hz,1H),4.02(s,3H)；¹³CNMR(100MHz,CDCl₃)δ163.8,160.5,160.4,152.0,137.3,116.0,104.5,103.6,56.7.HRMS(ESI-TOF)m/z calcd.for C₉H₇NO₃H⁺[(M+H)⁺]:178.0499,found 178.0493.

化合物抑制肿瘤细胞增殖实验(MTT法测定细胞存活率)

1.1原理

利用活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶可以使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的结晶物质甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞线粒体中此种酶失去活性从而无此功能。二甲基亚砜(DMSO)或盐酸-异丙醇溶液能溶解细胞中沉积的结晶物质甲瓒，用酶标仪在490nm(630nm)或570nm(630nm)波长处测定其光密度值(OD值)，可间接反映活细胞数量。在一定的细胞数范围内，MTT结晶形成的晶体物质的量与细胞数成正比。

1.2实验步骤

取处于对数生长期的细胞，调整细胞浓度为5×10⁴cell/mL接种于96孔板上，每孔100μL，同时设置空白孔和对照孔。于37℃、5％CO₂培养箱中培养一定时间(悬浮细胞培养2h，贴壁细胞培养24h)，分别加入终浓度为0.001，0.01，0.1，1，10μM的化合物，每孔0.5μL，每个药物浓度设置3个复孔。空白孔为单纯培养基孔不含有细胞、DMSO以及化合物。对照孔为仅加入含相同浓度DMSO的完全培养基作用于细胞。置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中，分别于6h，12h，24h，48h后，每孔加入5mg/mL的MTT溶液20μL(用PBS配制，0.22μm滤膜过滤除菌)，置于37℃，5％CO₂恒温培养箱中继续孵育4h，终止培养。贴壁细胞处理方式小心移除孔内培养上清液，每孔加入100μL DMSO，悬浮细胞处理方式就是在每孔中继续加入100μL盐酸-异丙醇溶液反复吹打混匀，37℃放置10min后，使紫色结晶物充分溶解，用酶标仪(490nm,630nm或570nm,630nm)测定各孔的吸光度(OD)值，按以下公式计算细胞抑制率。

细胞存活率(％)＝(实验组OD-空白组OD)/(对照组OD-空白组OD)×100％

IC₅₀：即细胞存活率为50％时的药物浓度，又称半数有效抑制浓度。根据MTT结果求直线回归方程，并计算每个化合物的IC₅₀值。

IC₅₀值与化合物的抑制肿瘤细胞生长的活性呈反比例关系，即IC₅₀值越小，化合物的抑制肿瘤细胞生长的活性越高，越有可能具有高效的抗肿瘤活性。

化合物3-6以及相应香豆素的体外抗肿瘤活性结果如表2所示。

表2体外抗肿瘤活性(100μM的抑制率)

表2结果表明，氮杂香豆素化合物3,6及7的脂水分配系数LogP比相应的香豆素要小约0.6个单位，因此氮杂香豆素的水溶性比相应香豆素均得到明显改善。此外，该类化合物对人白血病细胞(K562)及肝癌细胞(HepG2)均有抑制活性，尤其对人白血病细胞(K562)的抑制，氮杂香豆素3比香豆素有显著提高。