一种可在肿瘤细胞溶酶体内发生形貌转换的多肽脂质体的制作方法

本发明涉及自组装纳米材料，具体地说，涉及一种高肿瘤特异性、溶酶体靶向的pH响应形貌变换的多肽自组装纳米体系。

背景技术：

分子组装过程在自然界中非常常见，蛋白质的盘旋、折叠，DNA分子的双螺旋，都是在自组装控制下的生物化学过程，其精细、神秘的作用力甚至蕴含着生命起源的奥秘。分子自组装的过程是一个不受外力影响的过程：其依赖于分子与分子或分子中某一片段与另一片段之间的分子识别，通过如氢键、范德华力、静电力、疏水作用、π-π堆积作用等非共价的弱相互作用力形成具有特定排列顺序的分子聚集体，分子有序排列的过程一旦开始，将自动进行到某个终点，即使是形成复杂的功能体系也不需要外力的作用。近年来，自组装技术已经成为“自下而上”构建纳米材料的重要手段，得到了快速发展。利用自组装技术制备纳米材料具有以下几方面的优势：尺寸可控，分散性好；纯度高，废物少；产物较稳定，不易发生团聚现象；操作仪器简单，但对条件的控制要求精确。因此，组装单体的设计显得尤为重要，它有利于进一步调控自组装过程，得到功能性结构。

由于其良好的生物相容性，多功能性，生物识别能力及可修饰性，多肽及多肽衍生物作为组成成分构建的功能性材料被广泛的用于各个领域，包括组织工程，药物输运等。大量的研究表明，通过合理设计序列或者修饰一些特殊的化学基团，多肽不仅可以自组装成各种各样的纳米结构，还可以被赋予特殊的靶向性，环境响应性或者治疗活性。组成多肽的氨基酸残基有着种类丰富的侧链基团，通过选择不同侧链的氨基酸，可精确调控组装的发生，组装体的形貌和尺寸；此外，氨基酸侧链的基团可以提供配体识别功能，是自组装体能够在各种各样的条件下对外界环境产生响应，广泛存在的反应活性基团例如羧基，氨基，巯基等更是赋予了多肽的可修饰性。同时，多肽来源于生物体，可实现可控的降解过程，降解后的短肽和氨基酸还能被人体吸收，相对于其他自组装体系，多肽自组装有着更为广阔的应用前景。

溶酶体是细胞内重要的细胞器之一，为单层膜包被的囊状结构，内含多种水解酶，专为分解各种外源和内源的大分子物质。比起正常细胞中的溶酶体，肿瘤细胞中的溶酶体数量更多，体积更大，组织蛋白酶活性更高。肿瘤细胞内溶酶体的异常行为与肿瘤的侵袭，转移，复发以及不良预后有着巨大的关联性。溶酶体在细胞死亡的过程中也扮演着重要角色。溶酶体可以释放的组织蛋白酶到细胞质中，引发细胞凋亡或者细胞凋亡类似的过程。另外，肿瘤细胞中的溶酶体某些磷脂酶的缺少或者活性的降低使得溶酶体变得脆弱，对刺激敏感。因此，特异性地作用于肿瘤细胞的溶酶体以杀伤肿瘤细胞的肿瘤治疗策略有着巨大的应用前景。

技术实现要素：

为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种特异性结合肿瘤细胞的多肽脂质体，可在溶酶体酸性条件下发生形貌转变形成纳米纤维，对溶酶体产生扰动，释放组织蛋白酶引发细胞凋亡，同时包载一些药物于多肽脂质体的亲水内腔中，进一步加强细胞毒性作用。以此开发一种安全高效、特异性好、具有较高医用价值的肿瘤治疗策略。

为了实现本发明目的，本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供了一种多肽，其主体为6个丙氨酸形成的肽链，所述肽链的N端修饰有一个含苯环的基团，所述肽链的C端连接有RGD多肽序列。

进一步地，为了控制苯环与肽链N段的距离，以更好的实现所述多肽的自组装，本发明利用苯甲酸、苯乙酸，苯丙酸，2-苯基丙酸，邻甲基苯甲酸，对甲基苯甲酸，间甲基苯甲酸，邻甲基苯乙酸，对甲基苯乙酸，间甲基苯乙酸，邻甲基苯丙酸，对甲基苯丙酸，间甲基苯丙酸，对乙基苯甲酸，对乙基苯乙酸或对乙基苯丙酸进行所述肽链的N端修饰。

第二方面，本发明提供了一种可在肿瘤细胞溶酶体内发生形貌转换的多肽脂质体，其由前述多肽自组装形成。该多肽自组装形成多肽脂质体，生物兼容性好，自组装过程中不生成共价健，没有逆反应，形成高度有序的纳米结构，具有广阔的应用前景。

具体为，将所述多肽在室温下溶于水中，调节溶液的pH至7.35-7.45使其自组装，即得。

本发明利用固相合成制备所述多肽，在室温下将其溶于水中，并用NaOH溶液调节溶液的pH至7.4使其组装，然后在电镜下观察其为脂质体形貌。接下来将溶液pH调至5.0，在电镜下观察到其可发生形貌变换，形成纳米纤维结构。

本发明所述多肽，在弱碱性生理pH下，可自组装形成类似脂质体的结构，在被肿瘤细胞识别通过内吞作用进入溶酶体后，多肽响应溶酶体内的酸性pH，自组装形貌脂质体结构变换成为纳米纤维，这些纳米纤维引起了溶酶体膜的透化作用，使得更多的组织蛋白酶被释放到了细胞质中。

本发明制备的自组装多肽脂质体可以特异性地靶向肿瘤细胞，并在肿瘤溶酶体内形貌变换成纳米纤维，破坏溶酶体，释放组织蛋白酶，产生细胞毒性。

除了多肽本身具备毒性，多肽脂质体的亲水内腔还可以载带其他亲水药物，与多肽纳米纤维协同作用，增强毒性；作为载体的多肽脂质体，药物释放效率高。

作为优选，所述药物能够抑制溶酶体修复，或加速溶酶体释放组织蛋白酶。

更为优选，将Hsp 70抑制剂分子包载到多肽脂质体中。将多肽与肿瘤细胞孵育，制成细胞电镜样品，在透射电子显微镜下观察多肽在细胞内的组装情况。然后将包载有Hsp 70抑制剂的多肽脂质体与肿瘤细胞孵育，利用CCK-8试剂盒检测其对细胞的毒性程度。

具体操作为：将所述多肽和Hsp70抑制剂按照1～2:0.1～0.8的质量比溶于二甲基亚砜中，然后将其加入中性磷酸缓冲液中，100W超声条件下超声处理1分钟使其分散，在室温下孵育1小时，然后在10000g下离心15分钟，收集上清，即得。

第三方面，本发明提供了前述多肽或前述多肽脂质体在制备抑制肿瘤/治疗肿瘤药物中的应用。

本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。

本发明的有益效果在于：

本发明设计了一种高肿瘤特异性、溶酶体靶向的pH响应形貌变化的自组装多肽，在弱碱性生理pH下，该多肽可自组装形成类似脂质体的结构，在被肿瘤细胞识别通过内吞作用进入溶酶体后，多肽响应溶酶体内的酸性pH，自组装形貌脂质体结构变换成为纳米纤维，这些纳米纤维引起了溶酶体膜的透化作用，使得更多的组织蛋白酶被释放到了细胞质中。抑制溶酶体自修复作用的分子Hsp 70抑制剂可被包载到多肽脂质体的亲水内腔中，在多肽自组装体形貌转换的同时释放药物，抑制溶酶体自修复，增强组织蛋白酶的作用。除了Hsp 70抑制剂，其他亲水性小分子药物也可以被包载到多肽脂质体的内腔中，与组织蛋白酶协同作用，增强细胞毒性。本发明提出了一种新的肿瘤治疗策略，同时还能结合传统的抗肿瘤药物进行协同治疗，并且具有良好的特异性，高的药物释放效率以及良好的治疗效果。

附图说明

图1显示多肽在不同pH环境中自组装纳米结构的形貌。

图2显示多肽在细胞内形貌转换形成纳米纤维。

图3显示多肽自组装体系对细胞的毒性；其中，A、没有包载Hsp70抑制剂，B、包载了Hsp 70抑制剂。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

利用苯甲酸和Fmoc保护的L-氨基酸(Fmoc-Lys(Boc)-OH，Fmoc-Asp(tBu)-OH，Fmoc-Gly-OH，Fmoc-Ala-OH，购自吉尔生化(上海)有限公司)为原料，在二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)上，在本领域常用的耦合试剂和裂解试剂存在的条件下，通过固相合成法在树脂上制备多肽(主体为6个丙氨酸、主体C端连接肿瘤细胞靶向肽RGD、主体N端修饰有一个苯环的多肽)。再经过简单的裂解反应，将多肽从树脂上分离下来，经后续的沉淀、洗涤、干燥处理后制得纯白色多肽粉末。

具体的实验过程如下：

首先，取1.01g二氯三苯甲基氯树脂(购自吉尔生化(上海)有限公司)至多肽合成装置(购自西格玛奥德里奇公司)，加入无水的的N,N-二甲基甲酰胺(购自西格玛奥德里奇公司)浸泡树脂半小时，使之充分溶胀，最后排出溶剂N,N-二甲基甲酰胺。

称取0.2g Fmoc-Asp(tBu)-OH用5mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到含有处理过的树脂的多肽合成装置中，再加入2mL催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Asp(tBu)-OH与树脂相互作用约1.5小时，使其充分固定在树脂上。

用N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，加入甲醇搅拌30分钟，封闭树脂上未反应的活性位点，并再次用N,N-二甲基甲酰胺溶胀树脂。

然后用体积比为1:4的哌啶(购自西格玛奥德里奇公司)：N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除，反应3次，前两次各持续3分钟，第三次持续20分钟。

之后再用5mL的N,N-二甲基甲酰胺重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟，直到N,N-二甲基甲酰胺洗液的pH显中性。

称取0.5g Fmoc-Gly-OH，0.72g 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-四甲基脲六氟磷酸酯(购自吉尔生化(上海)有限公司)，0.27g 1-羟基苯并三唑(购自吉尔生化(上海)有限公司)，用10mL N,N-二甲基甲酰胺溶解，然后将该溶液转入到多肽合成装置中，再加入2毫升催化剂二异丙基乙胺(DIEA)，室温下让Fmoc-Gly-OH与树脂相互作用约2小时，使其充分连接到上一个氨基酸上，N,N-二甲基甲酰胺冲洗树脂3次，取少许树脂加入10％茚三酮的无水甲醇(购自国药集团化学试剂北京有限公司)中加热至沸腾，观察树脂颜色变化，若树脂颜色无明显变化，则说明第二个氨基酸已完全同上一个氨基酸偶联，若树脂变蓝甚至发黑，则说明第二个氨基酸没有与前一个氨基酸完全反应，需重复连接。

重复以上步骤分别缩合Fmoc-Lys(Boc)-OH，六个Fmoc-Ala-OH。用体积比为1:4的哌啶：N,N-二甲基甲酰胺溶液(5mL)进行保护基的脱除之后，加入苯甲酸(购自国药集团化学试剂北京有限公司)/4mL吡啶(购自西格玛奥德里奇公司)的混合液，反应两次、每次2小时。

做完茚三酮测试，确保苯甲酸已经完全反应完了多肽的N末端，再用5mL的二氯甲烷重复洗涤树脂5次，每次持续1分钟。最后，将多肽从树脂上裂解下来，具体过程如下：首先配制裂解液：9.5mL三氟乙酸(购自西格玛奥德里奇公司)+0.85mL 1,2-乙二硫醇(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL茴香硫醚(购自西格玛奥德里奇公司)+0.5mL去离子水。将树脂放入上述混合液中进行裂解反应3小时，之后过滤掉树脂，在收集到的液体中加入乙醚(购自国药集团化学试剂北京有限公司)，立即出现白色沉淀。然后，离心分离上述悬浊液，转速为5000rpm、离心时间5分钟，除去上清液，进行冷冻干燥，收集白色多肽粉末，制得多肽分子。

实施例2

将0.1mg实施例1所述多肽溶于1mL超纯水，用0.1M HCl溶液和0.1M NaOH溶液将pH调到7.4，超声1分钟，静置30分钟，制备电镜样，在透射电子显微镜下观察自组装形貌，显示为脂质体类似的结构(见图1)。

然后将溶液pH调至5.0，静置30分钟，制备电镜样品，通过透射电子显微镜观察，显示为纳米纤维形貌(见图1)。

实施例3

透射电子显微镜观察细胞内自组装纳米纤维：将多肽与肿瘤细胞MCF-7孵育，6个小时后将细胞收集起来，4℃，1000r/min离心3分钟，除去上层旧培养基。然后分别用2.5％戊二醛，1％锇酸固定细胞，用不同浓度的乙醇梯度脱水，环氧树脂包埋。然后用钻石岛将细胞切成60-90nm厚度的超薄切片，将切片置于铜网上，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色，在生物透射电子显微镜(HT7700)下观察细胞内纤维形成情况(见图2)。

实施例4

亲水药物包载：将1.0mg实施例所得多肽和0.2mg Hsp70抑制剂溶于10μL二甲基亚砜中，然后将其加入1mL中性磷酸缓冲液中，超声1分钟使其分散，在室温下孵育1小时。然后在10,000g下离心15分钟，收集上清，即为包载了Hsp70抑制剂的多肽脂质体。

实验例1

1、实验分组：

实验组1：Hsp70抑制剂；

实验组2：Hsp70抑制剂与未包载Hsp70抑制剂的多肽脂质体；

其中，未包载Hsp70抑制剂的多肽脂质体由实施例1所述多肽自组装；将0.1mg实施例1所述多肽溶于1mL水，用0.1M HCl溶液和0.1M NaOH溶液将pH调到7.4，超声1分钟，在室温下静置孵育30分钟，然后在10,000g下离心15分钟，收集上清，即得。

实验组3：包载Hsp70抑制剂的多肽脂质体。

2、实验方法：

将肿瘤细胞MCF-7接种到96孔板中，当细胞长到70％左右时，分别加入不同浓度的实验组1～3，孵育24小时。

然后用CCK-8试剂盒处理细胞1小时，用酶标仪测定其在454nm出的吸光度，在抑制剂和多肽的协同作用大幅增强了多肽的毒性。

依据细胞生存活力与实验组浓度的相关性绘制图3，由图3可知多肽脂质体包载的Hsp 70抑制剂对肿瘤细胞的杀伤效果比单独的抑制剂或者多肽脂质体和抑制剂分开作用更明显。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。