本发明属于生物医药领域，具体涉及一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。
背景技术：
熊去氧胆酸(UDCA)是1927年日本正田氏从熊胆汁中首次分离出纯结晶产品，1957年UDCA被成功合成并作为利胆剂用于临床。1973年日本发现UDCA有溶解胆结石的作用,且具有毒性小、剂量小的优点，从而引起世界各国的关注。熊去氧胆酸是一种无毒性亲水胆酸，能竞争性的抑制毒性内源性胆酸在回肠的吸收，通过激活钙离子、蛋白激酶C组成的信号网络，并通过激活分裂活性蛋白激酶来增强胆汁淤积肝细胞的分泌能力，使血液及肝细胞中的内源性疏水胆酸浓度降低，达到抗胆汁淤积的作用。
熊去氧胆酸的国外市场需求量大，尤其是日本、韩国、欧美等国家，出口形势较好，国内市场也渐渐在扩大。据统计资料显示，全球对熊去氧胆酸需求量约为1200吨，每年均有15％的增长，尽管日本人口较少，但是每年消耗熊去氧胆酸高达300吨，韩国也高达100吨以上。因此越来越多的科研工作者开始探索熊去氧胆酸的新制备工艺，力求降低熊去氧胆酸的现有产品价格。
目前熊去氧胆酸的制备方法分为化学法和生物法，由于化学法合成路线较长、反应条件苛刻、收率低、产物立体选择性差导致后处理纯化步骤增多，人们逐渐关注于生物法制备UDCA的研究。
CN103012532公开了以牛羊胆酸为原料，经酯化、3,7位乙酰化、12位氧化、脱氧、7位氧化、还原得到UDCA的方法，总收率为32％，产品纯度最高为98.5％，合成路线如下：
该化学合成方法路线冗长，总收率较低，反应条件苛刻，对环境影响较为严重，放大生产对设备要求较高，能耗较大，生产成本大幅度提高。
CN105861613公开了以鹅去氧胆酸(CDCA)为原料，在两种酶7-αHSDH和7-βHSDH、辅酶NADP的作用下经重结晶精制一步得到熊去氧胆酸的方法，收率最高为81％，合成路线如下：
该方法虽然收率较高为81％，但是由于原料CDCA通常都是用从禽胆汁中分离、提取、纯化，而现实生活中存在禽胆汁量较少，难以收集的问题，所以该路线工业化放大生产受阻，难以满足人们的需求。
CN102791876公开了原料胆酸(CA)经氧化、7β-HSDH还原、3α-HSDH还原、12位化学法脱氧四步反应得到UDCA，合成路线如下：
该路线的酶法制备步骤中底物浓度较低只有20g/L，仅停留在实验室研究阶段，难以进行工业化应用。
技术实现要素：
为了克服现有技术存在的上述缺陷，本发明公开了一种化学-酶法制备熊去氧胆酸的方法。
具体工艺路线如下所示：
合成步骤包括：
步骤a：去氧胆酸(化合物II)在12α-羟基类固醇脱氢酶(12α-HSDH)、辅酶、第一辅酶再生体系、磷酸盐缓冲液的作用下发生氧化反应得到12-酮去氧胆酸(化合物III)；
步骤b：化合物III进行脱羰基还原反应得到胆石酸(化合物IV)；
步骤c：化合物IV在7α-羟化酶(7α-LCAH)催化作用下进行羟基化反应得到熊去氧胆酸(化合物I)。
进一步说，步骤a中所述辅酶为NAD或NADP。
进一步说，步骤a中所述第一辅酶再生体系为醇脱氢酶/丙酮体系或乳酸脱氢酶/丙酮酸体系，优选为醇脱氢酶/丙酮体系。
进一步说，步骤a中化合物II的浓度为20～100g/L，12α-羟基类固醇脱氢酶的浓度为5～10g/L，丙酮浓度为5～20％(V/V)，辅酶的浓度为0.01～0.1g/L，醇脱氢酶的浓度为1～5g/L，磷酸盐缓冲液的浓度为40～80mM。
进一步说，步骤a的氧化反应在pH＝6～8，温度为30～40℃进行。
进一步说，所述12α-羟基类固醇脱氢酶和醇脱氢酶源自尚科生物医药(上海)有限公司，优选12α-HSDH101和KRED195。
进一步说，步骤b中所述脱羰基还原反应在180～220℃、水合肼作用下进行。
进一步说，步骤b中水合肼与化合物III的摩尔比为1:1～1:3。
进一步说，步骤c的羟基化反应是将化合物IV、7α-LCAH、辅酶、第二辅酶再生体系、磷酸盐缓冲液按一定比例混合反应得到。
进一步说，步骤c中所述第二辅酶再生体系为醇脱氢酶/异丙醇体系。
进一步说，步骤c中化合物IV的浓度为20～100g/L，7α-LCAH的浓度为2.5～10g/L，异丙醇浓度为5～20％(V/V)，辅酶的浓度为0.01～0.1g/L，醇脱氢酶的浓度为0.5～5g/L，磷酸盐缓冲液的浓度为40～80mM。
进一步说，步骤c的羟基化反应在pH＝6～8，温度为30～40℃进行。
进一步说，步骤c中的7α-羟化酶和醇脱氢酶源自尚科生物医药(上海)有限公司，优选7α-LCAH101和KRED195。
进一步说，12α-羟基类固醇脱氢酶以酶粉形式、含12α-羟基类固醇脱氢酶的细胞破碎液或全细胞的形式加入，优选以酶粉形式加入。
进一步说，醇脱氢酶以酶粉形式、含醇脱氢酶的细胞破碎液或全细胞的形式加入，优选以酶粉形式加入。
进一步说，7α-羟化酶以酶粉形式、含7α-羟化酶的细胞破碎液或全细胞的形式加入，优选以酶粉形式加入。
与现有技术相比，本发明原料价廉易得、反应条件温和、步骤较少、后处理简单、底物浓度高达100g/L，总收率为73％，产品纯度大于99％，工业放大生产具有非常好的应用前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术内容作进一步的阐述，其目的是为了更好的理解本发明的内容，但本发明的保护范围不限于此。
实施例一 熊去氧胆酸(化合物I)的合成
(1)12-酮去氧胆酸(化合物III)的制备
于30mL反应容器中加入50mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝8.0)，加入化合物II(1.5g)、NADP(1.5mg)、丙酮(1.5mL)，搅拌均匀后加入12α-HSDH101酶粉(0.15g)和醇脱氢酶KRED195(30mg)定容至15mL，35℃下磁力搅拌敞口反应24小时。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得12-酮去氧胆酸(化合物III，1.38g，收率92％)。
(2)胆石酸(化合物IV)的制备
在30ml反应容器中加入化合物III(1.38g)，乙二醇(10ml)，85％水合肼(0.42g)回流3-5h，后升温至195℃-200℃回流2h，冷却至室温，加入水(20ml)稀释，然后用稀硫酸调节PH＝2.0，结晶析出，过滤，70℃真空干燥得胆石酸(化合物IV，1.17g，收率88％)。
(3)熊去氧胆酸(化合物I)的制备
于30mL反应容器中加入40mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝7.0)，加入化合物IV(1g)、NADP(1mg)、异丙醇(1mL)，搅拌均匀后加入7α-LACH101酶粉(100mg)和醇脱氢酶KRED195(20mg)定容至10mL，30℃下磁力搅拌敞口反应24小时。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得熊去氧胆酸(化合物I，0.94g，收率90％)，HPLC检测纯度为99.2％。
实施例二 熊去氧胆酸(化合物I)的合成
(1)12-酮去氧胆酸(化合物III)的制备
于50mL反应容器中加入60mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝7.0)，加入化合物II(1.5g)、NADP(1.5mg)、丙酮(1.5mL)，搅拌均匀后加入12α-HSDH101酶粉(150mg)和醇脱氢酶KRED195(30mg)定容至30mL，40℃下磁力搅拌敞口反应24小时。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得12-酮去氧胆酸(化合物III，1.43g，收率94％)。
(2)胆石酸(化合物IV)的制备
在30ml反应容器中加入化合物III(1.43g)，乙二醇(15ml)，85％水合肼(0.48g)回流3-5h，后升温至195℃-200℃回流2h，冷却至室温，加入水(20ml)稀释，然后用稀硫酸调节PH＝2.0，结晶析出，过滤，70℃真空干燥得胆石酸(化合物IV，1.18g，收率86％)。
(3)熊去氧胆酸(化合物I)的制备
于30mL反应容器中加入60mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝7.0)，加入化合物IV(1g)、NADP(1mg)、异丙醇(1mL)，搅拌均匀后加入7α-LACH101酶粉(100mg)和醇脱氢酶KRED195(20mg)定容至20mL，35℃下磁力搅拌敞口反应18小时，反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得熊去氧胆酸(化合物I，0.92g，收率88％)，HPLC检测纯度为99.1％。
实施例三 熊去氧胆酸(化合物I)的合成
(1)12-酮去氧胆酸(化合物III)的制备
于100mL反应容器中加入40mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝7.0)，加入化合物II(1.5g)、NADP(1.0mg)、丙酮(1.5mL)，搅拌均匀后加入12α-HSDH101酶粉(300mg)和醇脱氢酶KRED195(50mg)定容至50mL，30℃下磁力搅拌敞口反应20小时。反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得12-酮去氧胆酸(化合物III，1.34g，收率90％)。
(2)胆石酸(化合物IV)的制备
在30ml反应容器中加入化合物III(1.34g)，乙二醇(15ml)，85％水合肼(0.45g)回流3-5h，后升温至195℃-200℃回流2h，冷却至室温，加入水(20ml)稀释，然后用稀硫酸调节PH＝2.0，结晶析出，过滤，70℃真空干燥得胆石酸(化合物IV，1.12g，收率87％)。
(3)熊去氧胆酸(化合物I)的制备
于100mL反应容器中加入50mM的磷酸钾缓冲液(10mL，pH＝7.0)，加入化合物IV(1g)、NADP(1mg)、异丙醇(1mL)，搅拌均匀后加入7α-LACH101酶粉(100mg)和醇脱氢酶KRED195(20mg)定容至40mL，40℃下磁力搅拌敞口反应24小时，反应结束后70℃保温2h使反应液中蛋白质变性，过滤去除蛋白质，用1M盐酸调节pH＝3，等体积乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压蒸馏获得熊去氧胆酸(化合物I，0.94g，收率90％)，HPLC检测纯度为99.4％。