产生2‑羟基异丁酸的重组细胞的制作方法

本申请是申请日为2009年4月28日、申请号为200980124253.7、发明名称为“产生2-羟基异丁酸的重组细胞”的发明专利申请的分案申请。

发明领域

本发明的目标为细胞，其如此地经基因工程改造，从而与其野生型相比，它能够形成更多的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸，其特征在于，2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的形成经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a来实现。

现有技术

甲基丙烯酸、其酯和聚合物在丙烯酸玻璃板、压铸模产品、涂层和许多其他产品的生产中有着广泛的应用。

已知多种用于制备甲基丙烯酸的方法。然而，世界上大部分的商业生产基于用于水解从相应的2-羟基腈产生的甲基丙烯酸的酰胺-硫酸盐的化学方法，其中为了产生1kg甲基丙烯酸需要大约1.6kg硫酸。

在us3,666,805和us5,225,594中描述了2-羟基异丁酸(2-hib)至甲基丙烯酸的化学转化，其中产率为至多96％。

通过在使用水解腈的酶的情况下将2-羟基腈水解为2-羟基异丁酸而得到用于生产甲基丙烯酸的备选方法。所述水解腈的酶为腈水解酶或者腈水合酶和酰胺酶的组合(a.banerjee,r.sharrna,u.c.banerjee,2002,"thenitrile-degradingenzymes:currentstatusandfutureprospects",appl.microbiol.biotechnol.,60:33-44；和us6,582,943)。这种方法的一个严重缺点是在对于有效的水解腈的酶活性来说所需的中性ph范围内腈的不稳定性。在反应混合物中腈的降解导致酮和氰化物的积累，这两者都抑制水解腈的酶活性。

这两种方法(即目前占主导地位的基于酰胺-硫酸盐的方法和酶促的水解腈的方法)的普遍缺点是需要2-羟基腈。这必须首先从对环境有害的反应物(即酮和氰化物)来制备。

从ca2,510,657中获知用于经由酶促的降解叔丁醇的代谢途径来提供2-羟基异丁酸的备选方法。

从pct/ep2007/052830中获知用于提供2-羟基异丁酸的其他酶促方法。在那里，借助于变位酶将作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a(3-hbcoa)转变为2-羟基异丁酸。所述方法具有下列缺点：所述方法是不连续的，作为反应物外源地添加3-羟基丁酸(3-hb)，以及工艺条件需要惰性气体。转化率为大约20％。

因此，克服了所述缺点的用于制备2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的方法是有利的。

因此，本发明的任务是提供用于形成2-羟基异丁酸的方法，其保证了对于用于2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的初产物的需求，所述2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸可以被进一步加工为甲基丙烯酸、其酯和聚合物。

发明描述

令人惊讶地发现，经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a来形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸为解决上述任务作出了贡献。

如此处所使用的，术语“初产物(vorprodukt)”定义了这样的化合物，其可以通过使用仅一种酶以酶促方式被转化为所希望的产物；而术语“中间产物”定义了这样的化合物，其可以通过使用至少两种酶以酶促方式被转化为所希望的产物，其中作为“化合物”，具有或没有辅酶a-硫酯官能度的那些应当被认为是等价的，并因此形成或裂解硫酯的酶不被考虑在内。

因此，本发明的目标为细胞，其如此地经基因工程改造，从而与其野生型相比，它能够形成更多的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸，其特征在于，2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的形成经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a来实现。

本发明的另一个目标为用于制备根据本发明的细胞的方法，和用于用根据本发明的细胞来制备2-羟基异丁酸的方法，以及用于制备甲基丙烯酸的方法。

本发明的一个优点是，2-羟基异丁酸或者甲基丙烯酸不仅可以从可再生原料例如碳水化合物和/或甘油来制备，而且可以从源自化石燃料的原料例如甲醇来制备，并因此可以避开化石原料的可用性不稳定的问题。

本发明的另一个优点是，在根据本发明的方法中可以以热负荷很低的步骤和通常以少数几个工艺步骤来获得甲基丙烯酸。

本发明的另外一个优点是，避免了许多毒性或攻击性物质，如它们在常规的用于制备2-羟基异丁酸的化学方法中产生。

在下面将通过实施例来描述本发明，但不应当将本发明局限于这些示例性的实施方案。

除非另外说明，所有给出的百分比(％)均为质量百分比。

如此处所使用的，术语“2-羟基异丁酸”总是描述以这样形式的相应的c4-羧酸，所述形式为c4-羧酸在由相应的微生物形成之后依赖于ph值而呈现的形式。因此，该术语总是包括纯的酸形式(2-羟基异丁酸)、纯的碱形式(2-羟基异丁酸盐)以及由酸的质子化和脱质子化形式所组成的混合物。

此外，术语“3-羟基丁酰辅酶a”原则上不仅包括(r)-立体异构体而且包括(s)-立体异构体，其中特别优选的是(r)-立体异构体。

表述“与其野生型相比，它能够形成更多的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸”还涉及这样的情况：经基因工程改造的细胞的野生型完全不能形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸，或者至少不能形成可检测量的这些化合物；并且在经过基因工程改造之后才能形成可检测量的这些组分。

细胞的“野生型”优选地是指这样的细胞，其基因组以如同它自然地通过进化而形成的那种状态存在。该术语不仅用于整个细胞，而且用于单个基因。因此，术语“野生型”特别地不包括这样的细胞或这样的基因，其基因序列已由人借助于重组方法至少部分地进行了改变。

随后，可以通过小心的脱水反应从2-羟基异丁酸获得甲基丙烯酸。在包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的情况下，可以分离出细胞中所包含的充满这些聚羟基链烷酸的颗粒，随后裂解所述聚合物从而获得2-羟基异丁酸，其然后可以进行脱水从而获得甲基丙烯酸。

在此，根据本发明优选的是，所述经基因工程改造的细胞是如此地经基因工程改造的，从而所述细胞在确定的时段内，优选地在2小时内，更优选地在8小时内，和最优选地在24小时内，所形成的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的量为所述细胞的野生型的至少2倍，特别优选地至少10倍，更优选地至少100倍，更加优选地至少1000倍，和最优选地至少10000倍。在此，产物形成的增加可以例如通过下列方式来测定：将根据本发明的细胞和野生型细胞各自分开地在相同的条件(相同的细胞密度、相同的培养基、相同的培养条件)下，在合适的培养基中培养经过确定的时段；随后测定细胞上清液中(在2-羟基异丁酸的情况下)或者细胞中(在包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的情况下)目标产物(2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸)的量。

根据本发明的细胞可以是原核生物细胞或真核生物细胞。所述细胞可以为哺乳动物细胞(例如来自人的细胞)，植物细胞，或者微生物例如酵母、真菌或细菌，其中特别优选的是微生物，最优选的是细菌和酵母。

作为细菌、酵母或真菌，以细菌、酵母或真菌菌株形式保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(deutschensammlungvonmikroorganismenundzellkulturengmbh(dsmz),braunschweig,deutschland)中的那些细菌、酵母或真菌是特别合适的。根据本发明合适的细菌属于在http://www.dsmz.de/species/bacteria.htm中所列出的那些类别，根据本发明合适的酵母属于在http://www.dsmz.de/species/yeasts.htm中所列出的那些类别，和根据本发明合适的真菌属于在http://www.dsmz.de/species/fungi.htm中所列出的那些类别。

根据本发明优选的细胞是下列属的那些细胞：曲霉属(aspergillus)、棒杆菌属(corynebacterium)、短杆菌属(brevibacterium)、芽孢杆菌属(bacillus)、不动杆菌属(acinetobacter)、产碱菌属(alcaligenes)、乳杆菌属(lactobacillus)、副球菌属(paracoccus)、乳球菌属(lactococcus)、假丝酵母属(candida)、毕赤酵母属(pichia)、汉逊酵母属(hansenula)、克鲁维酵母属(kluyveromyces)、糖酵母属(saccharomyces)、埃希氏菌属(escherichia)、发酵单胞菌属(zymomonas)、耶氏酵母属(yarrowia)、甲基杆菌属(methylobacterium)、罗尔斯通氏菌属(ralstonia)、假单胞菌属(pseudomonas)、红螺菌属(rhodospirillum)、红细菌属(rhodobacter)、伯克霍尔德氏菌属(burkholderia)、梭菌属(clostridium)和贪铜菌属(cupriavidus)，其中构巢曲霉(aspergillusnidulans)、黑曲霉(aspergillusniger)、广泛产碱菌(alcaligeneslatus)、巨大芽孢杆菌(bacillusmegaterium)、枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)、黄色短杆菌(brevibacteriumflavum)、乳发酵短杆菌(brevibacteriumlactofermentum)、大肠杆菌(escherichiacoli)、酿酒糖酵母(saccharomycescerevisiae)、乳酸克鲁维酵母(kluveromyceslactis)、布兰克假丝酵母(candidablankii)、皱落假丝酵母(candidarugosa)、谷氨酸棒杆菌(corynebacteriumglutamicum)、有效棒杆菌(corynebacteriumefficiens)、运动发酵假单胞菌(zymomonasmobilis)、解脂耶氏酵母(yarrowialipolytica)、多形汉逊酵母(hansenulapolymorpha)、扭脱甲基杆菌(methylobacteriumextorquens)、富养罗尔斯通氏菌(ralstoniaeutropha)(特别是富养罗尔斯通氏菌h16)、深红红螺菌(rhodospirillumrubrum)、类球红细菌(rhodobactersphaeroides)、善变副球菌(paracoccusversutus)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、恶臭假单胞菌(pseudomonasputida)、乙酸钙不动杆菌(acinetobactercalcoaceticus)和巴斯德毕赤酵母(pichiapastoris)是特别优选的。

因此，与其野生型相比能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成更多的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的根据本发明的细胞具有酶e1的活性，所述酶e1催化乙酰乙酰辅酶a转化为3-羟基丁酰辅酶a。

所述酶e1优选地为选自包含下列的酶：

3-羟基酰基辅酶a脱氢酶(ec1.1.1.35)，

乙酰乙酰辅酶a还原酶(ec1.1.1.36)，

长链-3-羟基酰基辅酶a脱氢酶(ec1.1.1.211)，和

3-羟基丁酰辅酶a脱氢酶(ec1.1.1.157)。

优选地，该酶由选自下列的基因编码：phab、phbb、fabg、phbn1、phbb2，其中特别优选的是phab、phbb。这些基因的核苷酸序列可以例如从“基因和基因组京都百科全书(kyotoencyclopediaofgenesandgenomes)”(kegg数据库)、国家医学图书馆(nationallibraryofmedicine)(bethesda,md,usa)的国家生物技术信息中心(nationalcenterforbiotechnologyinformation)(ncbi)的数据库或者欧洲分子生物学实验室(europeanmolecularbiologieslaboratories)(embl,heidelberg,deutschland或cambridge,uk)的核苷酸序列数据库获取。

对于根据本发明的细胞可以是有利的是，根据本发明的细胞具有相比于其野生型而言增加的酶e1的活性，所述酶e1催化乙酰乙酰辅酶a转化为3-羟基丁酰辅酶a。

术语“增加的酶的活性”，如其在上文中在酶e1方面和在下面的关于酶e2等方面的论述中所使用的，优选地理解为增加的细胞内活性。

现在接下来的关于提高细胞中的酶活性的论述不仅适用于提高酶e1的活性，而且适用于下文提及的其活性任选地可以被提高的所有酶。

原则上，可以如此来获得酶活性的增加，即通过增加编码所述酶的基因序列的拷贝数，使用强启动子，改变基因的密码子使用，以各种方法类型和方式增加mrna或酶的半寿期，修饰基因表达的调节，或者利用编码具有增加的活性的相应酶的基因或等位基因，以及任选地将这些措施相组合。根据本发明经基因工程改造的细胞例如通过用载体进行转化、转导、接合或这些方法的组合来产生，所述载体包含所期望的基因、该基因的等位基因或其部分和使该基因能够表达的启动子。特别地，异源表达通过将所述基因或等位基因整合到细胞的染色体中或染色体外复制型载体中来获得。

de-a-10031999给出了关于用于提高细胞中的酶活性(例如丙酮酸羧化酶的酶活性)的可能性的综述，该文献在此引入作为参考，并且其关于用于提高细胞中的酶活性的可能性的公开内容构成本发明公开内容的一部分。

上文所提及的以及所有下文所提及的酶或基因的表达可借助于下列方式来检测：1-和2-维蛋白质凝胶分离，和随后用相应的评价软件来光学鉴定凝胶中的蛋白质浓度。如果酶活性的提高仅基于相应基因的表达的提高，那么可以简单地通过在野生型细胞和经基因工程改造的细胞之间比较1-或2-维蛋白质分离来定量酶活性的提高。用于制备蛋白质凝胶(在棒状杆菌的情况下)和用于鉴定蛋白质的常用方法为hermann等人(electrophoresis,22:1712.23(2001))所描述的程序。也可以通过下列方式来分析蛋白质浓度：用对于待检测的蛋白质特异的抗体来进行western-印迹杂交(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.usa,1989)，随后用相应的用于浓度测定的软件来进行光学评价(lohaus和meyer(1989)biospektrum,5:32-39；lottspeich(1999),angewandtechemie111:2630-2647)。dna结合蛋白的活性可以借助于dna条带移位分析(也称为凝胶阻滞)来测量(wilson等人,(2001)journalofbacteriology,183:2151-2155)。dna结合蛋白对于其他基因的表达的影响可以通过各种经充分描述的报道基因分析方法来检测(sambrook等人,molecularcloning:alaboratorymanual,第二版,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.usa,1989)。细胞内的酶活性可以通过各种经描述的方法来测定(donahue等人,(2000)journalofbacteriology182(19):5624-5627；ray等人,(2000)journalofbacteriology182(8):2277-2284；freedberg等人,(1973)journalofbacteriology115(3):816-823)。如果在后面的论述中，没有说明用于测定特定酶的活性的具体方法，那么优选地借助于下列文献中所描述的方法来测定酶活性的增加以及酶活性的降低：hermann等人,electophoresis,22:1712-23(2001)；lohaus等人,biospektrum532-39(1998)；lottspeich,angewandtechemie111:2630-2647(1999)；和wilson等人,journalofbacteriology183:2151-2155(2001)。

如果酶活性的提高是通过内源基因的突变而实现的，那么这样的突变可以要么根据传统方法随机产生，例如通过uv辐射或通过诱发突变的化学药品；要么借助于基因工程方法例如删除、插入和/或核苷酸交换来达到。通过这些突变获得经改造的细胞。特别地，特别优选的酶突变体还是这样的酶，其不再是反馈可抑制的或者至少与野生型酶相比较而言其反馈可抑制性降低了。

如果酶活性的提高是通过提高酶的合成而实现的，那么就例如增加相应基因的拷贝数，或者使启动子和调控区域或位于结构基因上游的核糖体结合位点突变。同样地，嵌入至结构基因上游的表达盒也起作用。通过诱导型启动子另外还可能在任一时间点处增强表达。此外，也可以给酶基因分派所谓的“增强子”作为调控序列，其通过rna聚合酶和dna之间改善的相互作用也导致提高的基因表达。通过用于延长mrna寿命的措施也可改善表达。此外，通过防止酶蛋白质的降解也可增强酶活性。在此，基因或基因构建体要么存在于具有不同拷贝数的质粒中，要么整合在染色体中并于其中进行扩增。备选地，所涉及的基因的过表达此外还可以通过改变培养基组成和培养条件来达到。本领域技术人员尤其可在martin等人(bio/technology5,137-146(1987))中，在guerrero等人(gene138,35-41(1994))中，在tsuchiya和morinaga(bio/technology6,428-430(1988))中，在eikmanns等人(gene102,93-98(1991))中，在ep-a-0472869中，在us4,601,893中，在schwarzer和pühler(bio/technology9,84-87(1991))中，在reinscheid等人(appliedandenvironmentalmicrobiology60,126-132(1994))中，在labarre等人(journalofbacteriology175,1001-1007(1993))中，在wo-a-96/15246中，在malumbres等人(gene134,15-24(1993))中,在jp-a-10-229891中，在jensen和hammer(biotechnologyandbioengineering58,191-195(1998))中，以及在已知的遗传学和分子生物学教科书中找到关于此的指导。与突变一样，上面所描述的措施产生经基因工程改造的细胞。

为了提高各基因的表达，使用例如附加型质粒。作为质粒或载体，原则上所有随时可供本领域技术人员为此目的使用的技术方案是合适的。这样的质粒和载体可以从例如novagen，promega，newenglandbiolabs，clontech或gibcobrl这些公司的小册子中获知。其他优选的质粒和载体可以在下列文献中找到：glover,d.m.(1985),dnacloning:apracticalapproach,vol.i-iii,irlpressltd.,oxford；rodriguez,r.l.和denhardt,d.t(编辑)(1988),vectors:asurveyofmolecularcloningvectorsandtheiruses,179-204,butterworth,stoneham；goeddel,d.v.(1990),systemsforheterologousgeneexpression,methodsenzymol.185,3-7；sambrook,j.；fritsch,e.f.和maniatis,t.(1989),molecularcloning:alaboratorymanual,第2版,coldspringharborlaboratorypress,newyork。

随后，包含待扩增的基因的质粒载体通过接合或转化而转移到所期望的菌株中。接合的方法例如在等人,appliedandenvironmentalmicrobiology60:756-759(1994)中进行了描述。转化的方法例如在thierbach等人,appliedmicrobiologyandbiotechnology29:356-362(1988)；dunican和shivnan,bio/technology7:1067-1070(1989)；和tauch等人,femsmicrobiologyletters123:343-347(1994)中进行了描述。在借助于“交换(cross-over)”事件进行同源重组后，所得的菌株包含至少两个拷贝的所涉及的基因。

在上文中和在下面的论述中所使用的表述“相比于其野生型而言增加的酶ex的活性”优选地总是指，各酶ex的活性增加到至少2倍，特别优选地至少10倍，更优选地至少100倍，更加优选地至少1000倍和最优选地至少10000倍。此外，具有“相对于其野生型而言增加的酶ex的活性”的根据本发明的细胞特别地也包括这样的细胞，所述细胞的野生型不具有该酶ex的活性或至少不具有可检测的该酶ex的活性，并且在提高所述酶活性之后(例如通过过表达)才显示出可检测的该酶ex的活性。在这种情况下，术语“过表达”或者在下面的论述中所使用的表述“表达的提高”也包括这样的情况，即起始细胞例如野生型细胞不具有表达或至少不具有可检测的表达，并且只有通过重组方法才诱导出可检测的酶ex的合成。

相应地，下面所使用的表述“降低的酶ex的活性”优选地是指，降低为至少0.5倍，特别优选地至少0.1倍，更优选地至少0.01倍，更加优选地至少0.001倍和最优选地至少0.0001倍的活性。表述“降低的活性”也包括没有可检测的活性(“零活性”)。特定酶的活性的降低可以例如通过定向突变，通过添加竞争性或非竞争性抑制剂，或者通过本领域技术人员已知用于降低特定酶的活性的其他措施来实现。

优选的是，与其野生型相比能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成更多的2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的根据本发明的细胞能够利用碳水化合物、甘油、油和脂肪、二氧化碳、羧酸或甲醇作为碳源。

进一步地，对于能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的根据本发明的细胞来说优选的是，除了酶e1的活性外，所述细胞任选地还具有酶e2的活性，优选地相比于其野生型而言增加的酶e2的活性，所述酶e2催化两个乙酰辅酶a转化为乙酰乙酰辅酶a。

酶e2优选地为乙酰辅酶ac-乙酰转移酶(ec-编号2.3.1.9)。该酶优选地由选自下列的基因编码：acat1、acat2、loc484063、loc489421、mgc69098、mgc81403、mgc81256、mgc83664、kat-1、erg10、ygef、atob、fadax、phba-1、phba-2、atob-2、pcaf、pcaf-2、phb-a、bktb、phaa、tiol、thla、fada、paaj、phbaf、pimb、mmga、yhfs、thl、vrab、th1、mvac、thil、paaj、fada3、fada4、fada5、fada6、cgl12392、catf、sc8f4.03、thil1、thil2、acab1、acab2、acab3或acab4，其中a-cat1、acat2、atob、thla、thlb、phaa和phba是优选的，phaa和phba是特别优选的。

这些基因的核苷酸序列可以例如从“基因和基因组京都百科全书”(kegg数据库)、国家医学图书馆(bethesda,md,usa)的国家生物技术信息中心(ncbi)的数据库或者欧洲分子生物学实验室(embl,heidelberg,deutschland或cambridge,uk)的核苷酸序列数据库获取。

优选地，根据本发明的细胞具有酶e3的至少一种活性，优选地，相比于其野生型而言增加的酶e3的活性，所述酶e3催化3-羟基丁酰辅酶a转化为2-羟基异丁酰辅酶a。酶e3优选地为羟基异丁酰辅酶a变位酶、异丁酰辅酶a变位酶(ec5.4.99.13)或甲基丙二酰辅酶a变位酶(ec5.4.99.2)，各优选地为辅酶b12依赖性变位酶。

酶e3优选地为这样的酶，其从下列微生物中分离出：aquincolatertiaricarbonisl108、dsm18028、dsm18512、methylibiumpetroleiphilumpm1、methylibiumsp.r8、自养黄色杆菌(xanthobacterautotrophicus)py2、类球红细菌(atcc17029)、类诺卡氏菌属物种(nocardioidessp.)js614、居藻海杆菌(marinobacteralgicola)dg893、苜蓿中华根瘤菌(sinorhizobiummedicae)wsm419、玫瑰变色菌属物种(roseovariussp.)217、激烈火球菌(pyrococcusfuriosus)dsm3638，特别优选地为在pct/ep2007/052830中所描述的辅酶b12依赖性变位酶，以及这样的酶，其在至少一个其部分序列中在氨基酸水平上与在pct/ep2007/052830中所描述的变位酶的小或大亚基的氨基酸序列(登录号dq436457.1和dq436456.1)具有至少60％，优选地至少80％，特别优选地至少95％，十分特别优选地至少99％的序列同一性，这根据blastp算法来测定，其中采用10的期望阈值，3的字长，存在的缺口代价为11和延伸的缺口代价为1的blosum62矩阵，以及条件合成得分矩阵调整(conditionalcompositionalscorematrixadjustment)。

在根据本发明的细胞(其能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸)的一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞在作为野生型的情况下具有酶e4的活性，优选地具有相比于其野生型而言降低的至少一种酶e4的活性，所述酶e4催化3-羟基丁酰辅酶a转化为聚羟基丁酸。

酶e4优选地为聚羟基链烷酸合酶，特别优选地为聚羟基丁酸合酶。该酶优选地由基因phbc或phac编码，其中phac是特别优选的。

在根据本发明的细胞(其能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸)的另一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞在作为野生型的情况下具有酶e5的活性，优选地具有相比于其野生型而言降低的酶e5的活性，所述酶e5催化3-羟基丁酰辅酶a转化为巴豆酰辅酶a。

酶e5优选地为巴豆酸酶(ec-编号4.2.1.55)或(3r)-3-羟基丁酰辅酶a脱水酶(ec-编号4.2.1.17)。该酶优选地由选自crt、crt1、crt2、fadb、paaf的基因编码，其中crt以及来自梭菌的相应基因是优选的，来自丙酮丁醇梭菌(clostridiumacetobutylicum)的crt是特别优选的。

在根据本发明的细胞(其能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸)的另外一个优选的实施方案中，根据本发明的细胞具有酶e6的活性，优选地具有相比于其野生型而言降低的酶e6的活性，所述酶e6催化r-3-羟基丁酰辅酶a转化为s-3-羟基丁酰辅酶a。

酶e6优选地为3-羟基丁酰辅酶a差向异构酶(ec5.1.2.3)。该酶优选地由选自fadb、fadb1、fadb2、fadj、fabj-1、faoa、yfcx的基因编码，其中fadb、fadj、yfcx是优选的，fadb、fadj是特别优选的。

此外，对于能够经由作为中间产物的乙酰乙酰辅酶a和作为初产物的3-羟基丁酰辅酶a形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的根据本发明的细胞来说优选的是，根据本发明的细胞具有相比于其野生型而言降低的至少一种酶e7的活性，所述酶e7接受3-羟基丁酰辅酶a作为底物。

一种用于制备2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的方法为解决开头所提及的任务作出了进一步的贡献，所述方法包括下列步骤：

a)在从碳源形成2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸的条件下，使根据本发明的细胞与包含碳源的培养基相接触，以及任选地

b)从培养基中纯化出2-羟基异丁酸，或者从细胞中纯化出包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸。

作为碳源，可以使用例如碳水化合物(例如单糖(例如葡萄糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖)、寡糖(例如麦芽糖、蔗糖、乳糖)和多糖(例如淀粉、经水解处理的淀粉、纤维素、经水解处理的纤维素、半纤维素、经水解处理的半纤维素))，以及其反应产物，例如糖醇和多羟基酸；二氧化碳；有机的、任选地携带1个或多个(例如1、2、3或4个)羟基的单、二和三羧酸，例如乙酸、酒石酸、衣康酸、琥珀酸、丙酸、乳酸、3-羟基丙酸、富马酸、马来酸、2,5-呋喃二羧酸、戊二酸、乙酰丙酸、葡糖酸、乌头酸、琥珀酸和二氨基庚二酸、柠檬酸；脂质；油或脂肪，例如菜籽油、大豆油、棕榈油、向日葵油、花生油和椰子油；具有优选地10至22个c-原子的饱和和不饱和脂肪酸，例如γ-亚麻酸、二高-γ-亚麻酸、花生四烯酸、棕榈酸、硬脂酸、亚油酸、二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸；烃，例如甲烷；醇，例如具有1至22个c-原子的醇，例如丁醇、甲醇、乙醇；具有优选地3至8个c-原子的二醇，例如丙二醇和丁二醇；具有3个或更多个(例如3、4、5或6个)oh基团的多元醇(也称为多价或高价醇)，例如甘油、山梨醇、甘露醇、木糖醇和阿拉伯糖醇)；具有优选地3至10个c-原子和任选地1个或多个羟基的酮，例如丙酮和乙偶姻；内酯，例如γ-丁内酯，环糊精，生物聚合物，例如聚羟基乙酸，聚酯，例如聚交酯，多糖，聚类异戊二烯，聚酰胺；芳香化合物，例如芳香胺、香草醛和靛蓝；蛋白质，例如酶，例如淀粉酶，果胶酶，酸性、杂合或中性纤维素酶，酯酶(例如脂肪酶)，胰酶，蛋白酶，木聚糖酶，和氧化还原酶(例如漆酶、过氧化氢酶和过氧化物酶)，葡聚糖酶，植酸酶；类胡萝卜素，例如番茄红素、β-胡萝卜素、虾青素、玉米黄素和角黄素；成蛋白质性和非成蛋白质性氨基酸，例如赖氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸和苏氨酸；嘌呤和嘧啶碱基；核苷和核苷酸，例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)和腺苷-5'-单磷酸(amp)；以及上述化合物的前体和衍生物，例如在所述酸的情况下为其盐。

这些物质可以单独地或者作为混合物进行使用。特别优选的是使用碳水化合物，特别是单糖、寡糖或多糖(如例如在us6,136,576中所描述的)；使用c5-糖；或者使用甘油。

甲醇是优选的待使用的醇，这是因为它可以由许多各种不同来源例如沼气、生物质、天然气或煤来制备。

可以在处理(蒸汽爆破、酸预处理、酶预处理)之前或之后，从不同的加工阶段(例如甘蔗汁，糖浆，糖蜜，粗糖，砂糖；玉米粒，磨粉，淀粉，糊精，葡萄糖)，以不同的形式(纯的或者以溶液/悬浮液)和以不同的组成(纯化的或作为粗产物)来使用碳源。

在一个优选的备选实施方案中，碳源包括co2或co，特别是合成气。在这种情况下使用的根据本发明的细胞为产乙酸细胞，例如醋酸杆菌属(acetobacterium)的物种，例如伍氏醋酸杆菌(a.woodii)，和醋酸梭菌(clostridiumaceticum)。特别地，所述产乙酸细胞选自凯伍热厌氧菌(thermoanaerobacterkivui)、伍氏醋酸杆菌、acetoanaerobiumnotera、醋酸梭菌、食甲基丁酸杆菌(butyribacteriummethylotrophicum)、丙酮丁醇梭菌、热醋穆尔氏菌(moorellathermoacetica)、粘液真杆菌(eubacteriumlimosum)、产生消化链球菌(peptostreptococcusproductus)、扬氏梭菌(clostridiumljungdahlii)和食羰基化物梭菌(clostridiumcarboxidivorans)。在这种情况下，特别合适的细胞为在食羰基化物梭菌，特别是诸如“p7”和“p11”这样的菌株。这样的细胞例如在us2007/0275447和us2008/0057554中进行了描述。其他在这种情况下特别合适的细胞为扬氏梭菌，特别是选自扬氏梭菌petc、扬氏梭菌eri2、扬氏梭菌c0l和扬氏梭菌o-52的菌株，并且它们在wo98/00558和wo00/68407中进行了描述。

可以以分批方法(分批培养)或者以补料分批方法(给料方法)或重复补料分批方法(重复给料方法)，使根据本发明的经基因工程改造的细胞连续地或不连续地与培养基相接触并因此进行培养，以便产生2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸。还可以考虑半连续的方法，如例如在gb-a-1009370中所描述的。关于其他已知的培养方法的概括描述在chmiel的教科书(“bioprozesstechnik1.einführungindiebioverfahrenstechnik”(gustavfischerverlag,stuttgart,1991))或storhas的教科书(“bioreaktorenundperiphereeinrichtungen”,viewegverlag,braunschweig/wiesbaden,1994)中。

待使用的培养基必须以合适的方式满足各菌株的要求。关于各种微生物的培养基的描述包含在americansocietyforbacteriology的手册“manualofmethodsforgeneralbacteriology”(washingtond.c.,usa,1981)中。

作为氮源，可以使用有机含氮化合物例如蛋白胨、酵母提取物、肉膏、麦芽汁、玉米浆、大豆粉和尿素，或者无机化合物例如硫酸铵、氯化铵、磷酸铵、碳酸铵和硝酸铵。这些氮源可以单独地或者作为混合物来进行使用。

作为磷源，可以使用磷酸、磷酸二氢钾或磷酸氢二钾或者相应的含钠盐。此外，培养基还必须包含金属盐例如硫酸镁或硫酸铁，它们是生长所必需的。最后，除了上面所述的物质外，还可以使用必需的生长物质例如氨基酸和维生素。另外，可以向培养基中添加合适的前体。所述材料可以以单次添加的形式补充给培养物或者在培养期间以合适的方式供料给培养物。

关于培养物的ph控制，可以以合适的方式使用碱性化合物例如氢氧化钠、氢氧化钾、氨或氨水，或者酸性化合物例如磷酸或硫酸。为了控制泡沫形成，可以使用防沫剂例如脂肪酸聚乙二醇酯。为了维持质粒的稳定性，可以向培养基中添加合适的具有选择作用的物质例如抗生素。为了维持有氧条件，向培养物中输入氧或含氧气体混合物例如空气。培养温度通常为20℃至45℃，和优选地25℃至40℃。特别地，在使用能转化作为底物的甘油的细胞的情况下，可以是优选的是，使用在us6,803,218中所描述的此类细胞作为细胞。在该情况下，所述细胞可以在40至100℃的温度下进行培养。

优选地，连续地从营养液中纯化出2-羟基异丁酸，其中，在这方面进一步优选的是，也连续地进行通过发酵来制备2-羟基异丁酸，从而由2-羟基异丁酸的制备到从发酵液中纯化出2-羟基异丁酸的整个过程可以连续地进行。为了从发酵液中连续地纯化出2-羟基异丁酸的制备，将发酵液连续地引导通过用于分离在发酵中所使用的微生物的装置，优选地通过具有20至200kda的排阻大小的过滤器，在其中发生固/液分离。还可以设想使用离心机、合适的沉降装置或这些装置的组合，其中特别优选的是，首先通过沉降来分离出至少一部分微生物，随后将从中部分地去除了微生物的发酵液输送至超滤或离心装置。

在分离出微生物之后，将在其2-羟基异丁酸比例方面经富集的发酵产品输送至优选地多步骤的分离设备。在该分离设备中，设置有多个相继衔接的分离阶段，从这些分离阶段中各自汇出被引回至发酵罐的回输管路。此外，从各个分离阶段中引出排出管路。单个分离阶段可以根据电渗析、反渗透、超滤或纳米过滤的原理进行工作。通常，在单个分离阶段中涉及膜分离设备。基于发酵副产物和底物残留物的类型和规模来选择单个分离阶段。

除了借助于电渗析、反渗透、超滤或纳米过滤(在其过程中作为终产物获得了2-羟基异丁酸水溶液)来分离2-羟基异丁酸外，还可以通过萃取方法由从中去除了微生物的发酵液中分离出2-羟基异丁酸，其中在该情况下最终可以获得纯的2-羟基异丁酸。为了通过萃取来分离2-羟基异丁酸，可以向发酵液中添加例如铵化合物或胺，以形成2-羟基异丁酸的铵盐。然后，可以通过下列方式从发酵液中分离出该铵盐：添加有机萃取剂，并随后加热如此获得的混合物，由此铵盐富集在有机相中。然后，例如通过进一步的萃取步骤可以从该相中分离出2-羟基异丁酸，从而获得纯的2-羟基异丁酸。关于该分离方法的更精确的细节可从wo-a-02/090312获取，该专利关于从发酵液中分离出羟基羧酸的公开内容在此引入作为参考，并且构成本申请公开内容的一部分。

根据从发酵液中分离2-羟基异丁酸的方法类型和方式，要么获得包含2至90重量％，优选地7.5至50重量％和特别优选地10至25重量％的2-羟基异丁酸的2-羟基异丁酸水溶液，要么获得纯的2-羟基异丁酸。

随着浓度增加，2-羟基异丁酸倾向于形成其环状二聚体(四甲基乙交酯，tmg)。该二聚体可以在根据本发明的方法的脱水步骤中与2-羟基异丁酸类似地进行处理，并因此应当在下文中对于该步骤来说总是包括在术语“2-羟基异丁酸”之中。

此外，还可以在纯化之前、期间或之后中和通过根据本发明的方法制备的2-羟基异丁酸，其中为此可以使用例如碱，例如碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物，例如氢氧化钙或氢氧化钠，或者还例如nh3或nh4oh。

特别地，一种用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法也为解决开头所提及的任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤：

ia)通过上文所描述的方法来制备2-羟基异丁酸，以及任选地，纯化和/或中和2-羟基异丁酸，

ib)使2-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸，以及任选地，使甲基丙烯酸盐或者甲基丙烯酸酯化。

根据步骤ib)，使2-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸，其中为此可以使用从发酵液中分离出的纯的2-羟基异丁酸，或者使用在处理发酵液时分离出的2-羟基异丁酸水溶液，其中任选地，该2-羟基异丁酸水溶液还在脱水之前，任选地在合适的共沸剂存在下，例如通过蒸馏进行浓缩。

原则上，脱水可以在液相或气相中进行。此外，根据本发明优选的是，脱水在催化剂存在下进行，其中所使用的催化剂的类型取决于施行气相反应还是液相反应。

作为脱水催化剂，不仅可以考虑酸性催化剂，而且还可以考虑碱性催化剂。特别地，由于低的寡聚物形成倾向，酸性催化剂因而是优选的。脱水催化剂不仅可以作为均相催化剂而且可以作为多相催化剂进行使用。当脱水催化剂作为多相催化剂存在时，优选的是，所述脱水催化剂与支持物x相接触。作为支持物x，可以考虑本领域技术人员认为合适的所有固体材料。在这种情况下，优选的是，该固体材料具有合适的孔体积，其适合于良好地系住和接纳脱水催化剂。此外，在0.01至3ml/g范围内的根据din66133的总孔体积是优选的，和在0.1至1.5ml/g范围内的总孔体积是特别优选的。此外，优选的是，按照根据din66131的bet测试，适合作为支持物x的固体材料具有0.001至1000m²/g，优选地0.005至450m²/g，和更优选地0.01至300m²/g的表面积。作为用于脱水催化剂的支持物，首先可以使用具有0.1至40mm,优选地1至10mm，和更优选地1.5至5mm的平均颗粒直径的疏松材料。进一步地，脱水反应器的壁可以充当支持物。此外，支持物本身可以是酸性的或碱性的，或者可以在惰性支持物上涂覆酸性或碱性的脱水催化剂。作为涂覆技术，特别可以提及浸没或浸渍或者掺入到支持物基质中。

作为还可以具有脱水催化剂特性的支持物x,特别合适的是天然或合成的硅酸盐物质，例如特别是丝光沸石、蒙脱石、酸性沸石；用一、二或多碱价无机酸(特别是磷酸)或者无机酸的酸式盐涂布的支持物材料，例如氧化物或硅酸盐类型的物质，例如al2o3、tio2；氧化物和混合氧化物，例如γ-al2o3和杂多酸的zno-al2o3混合氧化物。

相应于一个根据本发明的实施方案，支持物x至少部分地由氧化物类型的化合物组成。这样的氧化物类型的化合物应当具有元素si、ti、zr、al、p中的至少一种元素或者其中至少两种元素的组合。这样的支持物由于其酸性或碱性特性而本身还可以用作脱水催化剂。优选的既用作为支持物x也用作脱水催化剂的化合物类别包括硅/铝/磷氧化物。优选的既用作脱水催化剂也用作支持物x的碱性物质包括碱金属、碱土金属、镧、镧系元素或其中至少两种(以其氧化物形式)的组合。这样的酸性或碱性脱水催化剂不仅可以从evonikdegussagmbh，而且可以从südchemieag商购获得。其他类别为离子交换剂。同样地，这不仅可以以碱性形式，而且可以以酸性形式存在。

特别地，作为均相脱水催化剂，可以考虑无机酸，优选地含磷的酸，和更优选地磷酸。这些无机酸可以通过浸没或浸渍而固定在支持物x上。

特别地，在气相脱水的情况下，使用多相催化剂经证明是特别有利的。然而，在液相脱水的情况下，既使用均相脱水催化剂也使用多相脱水催化剂。

此外，优选的是，在根据本发明的方法中，所使用的脱水催化剂具有+1至-10，优选地+2至-8.2，和更优选地，在液相脱水的情况下+2至-3，和在气相脱水的情况下-3至-8.2的h0-值。h0-值相应于根据的酸性功能并且通过所谓的胺滴定和使用指示剂，或通过气体形式的碱的吸收来算出(参见“studiesinsurfacescienceandcatalytics”,vol.51,1989:“newsolidacidsandbases,theircatalyticproperties”,k.tannabe等人)。

依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，作为酸性固体催化剂，使用与无机酸，优选地与磷酸，或与超酸例如硫酸化或磷酸化的锆氧化物相接触的多孔支持体，所述多孔支持体以优选地至少90重量％,更优选地至少95重量％，和最优选地至少99重量％基于硅氧化物，优选地基于sio2。多孔支持体与无机酸的接触优选地通过用酸对支持体进行浸渍来实现，其中优选地以相对于支持体的重量而言10至70重量％，特别优选地20至60重量％，和更优选地30至50重量％的量，使所述酸与所述多孔支持体相接触，并随后进行干燥。在干燥后，加热所述支持体以固定无机酸，优选地在300至600℃，更优选地在400至500℃的温度下。

依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，脱水在气相中进行。在此，可以使用常规的装置(如本领域技术人员已知其用于气相反应)，例如管式反应器。特别优选的是，使用管束热交换器以及包含热交换板(thermobleche)作为热交换器的反应器。

根据气相脱水的一个实施方案，将纯的2-羟基异丁酸引入到反应器中，所述反应器包含上文所提及的固定床催化剂中的一种。根据另一个实施方案，将以下述形式的2-羟基异丁酸引入到反应器中：包含2至80重量％，特别优选地5至50重量％，和更加优选地10至25重量％的2-羟基异丁酸的水溶液(各基于水溶液的总重量计)。如此地来选择反应器内的压力和温度条件，即从而使得2-羟基异丁酸或水溶液在其进入反应器中时以气态形式存在。气相中的脱水优选地在200至400℃，特别优选地250至350℃的温度范围内来进行。在气相脱水的情况下，反应器内的压力优选地在0.1至50巴的范围内，特别优选地在0.2至10巴的范围内，和最优选地在0.5至5巴的范围内。

在气相脱水的情况下，引入反应器中的2-羟基异丁酸的量优选地在10至100体积％的范围内,特别优选地在20至100体积％的范围内，和最优选地在30至100体积％的范围内。

依照根据本发明的方法的另一个特别的实施方案，脱水在液相中进行。液相脱水同样可以在本领域技术人员已知的所有装置中进行，在所述装置中可以将流体加热至所希望的反应温度，其中可以向所述装置施加这样的压力，所述压力足以使反应组分在所希望的温度条件下保持液态。

依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，液相脱水的方法包括第一步骤，在所述步骤中，将纯的2-羟基异丁酸或者包含5至100重量％，特别优选地20至100重量％和最优选地50至100重量％的2-羟基异丁酸的水溶液(基于水溶液的总重量计)引入到反应器中。如此地来选择反应器内的压力和温度条件，即从而使得2-羟基异丁酸或水溶液在其进入反应器中时以液体形式存在。依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案(其中脱水在液相中进行)，使2-羟基异丁酸或水溶液在脱水反应器内如此地经过催化剂固定床，从而使得液相滴流经过催化剂颗粒的表面。这样的程序例如可以在滴流床反应器中进行。

液相中的脱水优选地在200至350℃，特别优选地250至300℃的温度范围内进行。在液相脱水的情况下，反应器内的压力优选地在1至50巴的范围内，特别优选地在2至25巴的范围内，和最优选地在3至10巴的范围内。

不仅在气相脱水的情况下，而且在液相脱水的情况下，脱水过程的催化可以均相地或多相地来进行。

在均相催化的情况下，首先将催化剂与纯的2-羟基异丁酸或者与包含2-羟基异丁酸的水溶液相接触，在此所述催化剂优选地为无机酸例如磷酸或硫酸。随后，将如此获得的组合物引入到反应器中，并在所希望的压力和温度条件下转变成甲基丙烯酸。还可以考虑独立于2-羟基异丁酸或所述水溶液地将无机酸引入到反应器中。在该情况下，反应器具有至少两个输入管道，一个用于2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸的水溶液，而另一个用于催化剂。如果在滴流床反应器中在液相中进行脱水，那么优选的是，将催化剂与2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸的水溶液一起引入至反应器的顶部区域。

在异相催化的情况下，催化剂在反应室中以固体基质的形式存在，例如以固定床填料的形式，以涂覆有催化剂的板(优选地，被布置于反应器内的热交换板)的形式，或者以涂覆有催化剂的反应器壁的形式。可能的反应器例如描述于de-a-19848208、de-a-10019381和ep-a-i234612中。在异相催化的情况下，作为催化剂，优选的是与无机酸相接触的(优选地，用无机酸浸渍的)多孔支持体。然后，将2-羟基异丁酸或包含2-羟基异丁酸的水溶液以蒸汽或液体形式与固体催化剂材料的表面相接触。

依照根据本发明的方法的一个特别优选的实施方案，2-羟基异丁酸在液相中的脱水，在200至500毫巴的压力下，在160至300℃，优选地200至240℃的温度下，并在作为催化剂的碱金属离子存在下进行。

在当前的反应条件下，可以将所产生的甲基丙烯酸以气态形式与水一起蒸馏出来，紧接着冷凝为水溶液，从而可以获得不包含任何催化剂成分的甲基丙烯酸水溶液。

依照根据本发明的方法的一个特别的实施方案，可以任选地使如此获得的甲基丙烯酸溶液进行酯化，而无需进一步的处理。在此，使甲基丙烯酸溶液与相应的醇以及合适的本领域技术人员已知的酯化催化剂(例如浓酸)在加热下相接触，并且以这种方式将甲基丙烯酸转变成相应的酯。

优选的醇尤其为各具有至少一个碳原子，优选地2至12个，和特别优选地4至9个碳原子的醇。所述醇可以具有线性的、支化的或环状的结构。此外，所述醇可以包含芳族基团或取代基，例如卤素原子。优选的醇特别地为甲醇、乙醇、正丙醇、异丙醇、正丁醇、1-甲基-丙醇、2-甲基-丙醇、叔丁醇、正戊醇、1-甲基-丁醇、2-甲基-丁醇、3-甲基-丁醇、2,2-二甲基-丙醇、正己醇、1-甲基-戊醇、2-甲基-戊醇、3-甲基-戊醇、4-甲基-戊醇、1,1-二甲基-丁醇、2,2-二甲基-丁醇、3,3-二甲基-丁醇、1,2-二甲基-丁醇、正庚醇、1-甲基-己醇、2-甲基-己醇、3-甲基-己醇、4-甲基-己醇、1,2-二甲基-戊醇、1,3-二甲基-戊醇、1,1-二甲基-戊醇、1,1,2,2-四甲基-丙醇、苄醇、正辛醇、2-乙基-己醇、正壬醇、l-甲基-辛醇、2-甲基-辛醇、正癸醇、正十一烷醇、1-甲基-癸醇、2-甲基-癸醇、正十二烷醇、2,4-二乙基-辛醇、环戊醇、环己醇、4-叔丁基-环己醇、环庚醇、环十二烷醇、2-(二甲基氨基)-乙醇、3-(二甲基氨基)-丙醇、4-(二甲基氨基)-丁醇、5-(二甲基氨基)-戊醇、6-(二甲基氨基)-己醇、8-(二甲基氨基)-辛醇、10-(二甲基氨基)-癸醇、12-(二甲基氨基)-十二烷醇、2-(二乙基氨基)-乙醇、3-(二乙基氨基)-丙醇、4-(二乙基氨基)-丁醇、5-(二乙基氨基)-戊醇、6-(二乙基氨基)-己醇、8-(二乙基氨基)-辛醇、10-(二乙基氨基)-癸醇、12-(二乙基氨基)-十二烷醇、2-(二-(异丙基)-氨基)-乙醇、3-(二-(异丙基)-氨基)-丙醇、4-(二-(异丙基)-氨基)-丁醇、5-(二-(异丙基)-氨基)-戊醇、6-(二-(异丙基)-氨基)-己醇、8-(二-(异丙基)-氨基)-辛醇、10-(二-(异丙基)-氨基)-癸醇、12-(二-(异丙基)-氨基)-十二烷醇、2-(二丁基氨基)-乙醇、3-(二丁基氨基)-丙醇、4-(二丁基氨基)-丁醇、5-(二丁基氨基)-戊醇、6-(二丁基氨基)-己醇、8-(二丁基氨基)-辛醇、10-(二丁基氨基)-癸醇、12-(二丁基氨基)-十二烷醇、2-(二己基氨基)-乙醇、3-(二己基氨基)-丙醇、4-(二己基氨基)-丁醇、5-(二己基氨基)-戊醇、6-(二己基氨基)-己醇、8-(二己基氨基)-辛醇、10-(二己基氨基)-癸醇、12-(二己基氨基)-十二烷醇、2-(甲基-乙基-氨基)-乙醇、2-(甲基-丙基-氨基)-乙醇、2-(甲基-异丙基-氨基)-乙醇、2-(甲基-丁基-氨基)-乙醇、2-(甲基-己基-氨基)-乙醇、2-(甲基-辛基-氨基)-乙醇、2-(乙基-丙基-氨基)-乙醇、2-(乙基-异丙基-氨基)-乙醇、2-(乙基-丁基-氨基)-乙醇、2-(乙基-己基-氨基)-乙醇、2-(乙基-辛基-氨基)-乙醇、3-(甲基-乙基-氨基)-丙醇、3-(甲基-丙基-氨基)-丙醇、3-(甲基-异丙基-氨基)-丙醇、3-(甲基-丁基-氨基)-丙醇、3-(甲基-己基-氨基)-丙醇、3-(甲基-辛基-氨基)-丙醇、3-(乙基-丙基-氨基)-丙醇、3-(乙基-异丙基-氨基)-丙醇、3-(乙基-丁基-氨基)-丙醇、3-(乙基-己基-氨基)-丙醇、3-(乙基-辛基-氨基)-丙醇、4-(甲基-乙基-氨基)-丁醇、4-(甲基-丙基-氨基)-丁醇、4-(甲基-异丙基-氨基)-丁醇、4-(甲基-丁基-氨基)-丁醇、4-(甲基-己基-氨基)-丁醇、4-(甲基-辛基-氨基)-丁醇、4-(乙基-丙基-氨基)-丁醇、4-(乙基-异丙基-氨基)-丁醇、4-(乙基-丁基-氨基)-丁醇、4-(乙基-己基-氨基)-丁醇、4-(乙基-辛基-氨基)-丁醇、2-(n-哌啶基)-乙醇、3-(n-哌啶基)-丙醇、4-(n-哌啶基)-丁醇、5-(n-哌啶基)-戊醇、6-(n-哌啶基)-己醇、8-(n-哌啶基)-辛醇、10-(n-哌啶基)-癸醇、12-(n-哌啶基)-十二烷醇、2-(n-吡咯烷基)-乙醇、3-(n-吡咯烷基)-丙醇、4-(n-吡咯烷基)-丁醇、5-(n-吡咯烷基)-戊醇、6-(n-吡咯烷基)-己醇、8-(n-吡咯烷基)-辛醇、10-(n-吡咯烷基)-癸醇、12-(n-吡咯烷基)-十二烷醇、2-(n-吗啉代)-乙醇、3-(n-吗啉代)-丙醇、4-(n-吗啉代)-丁醇、5-(n-吗啉代)-戊醇、6-(n-吗啉代)-己醇、8-(n-吗啉代)-辛醇、10-(n-吗啉代)-癸醇、12-(n-吗啉代)-十二烷醇、2-(n'-甲基-n-哌嗪基)-乙醇、3-(n'-甲基-n-哌嗪基)-丙醇、4-(n'-甲基-n-哌嗪基)-丁醇、5-(n'-甲基-n-哌嗪基)-戊醇、6-(n'-甲基-n-哌嗪基)-己醇、8-(n'-甲基-n-哌嗪基)-辛醇、10-(n'-甲基-n-哌嗪基)-癸醇、12-(n'-甲基-n-哌嗪基)-十二烷醇、2-(n'-乙基-n-哌嗪基)-乙醇、3-(n'-乙基-n-哌嗪基)-丙醇、4-(n'-乙基-n-哌嗪基)-丁醇、5-(n'-乙基-n-哌嗪基)-戊醇、6-(n'-乙基-n-哌嗪基)-己醇、8-(n'-乙基-n-哌嗪基)-辛醇、10-(n'-乙基-n-哌嗪基)-癸醇、12-(n'-乙基-n-哌嗪基)-十二烷醇、2-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-乙醇、3-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-丙醇、4-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-丁醇、5-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-戊醇、6-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-己醇、8-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-辛醇、10-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-癸醇、12-(n'-异丙基-n-哌嗪基)-十二烷醇、3-氧杂-丁醇、3-氧杂-戊醇、2,2-二甲基-4-氧杂-戊醇、3,6-二氧杂-庚醇、3,6-二氧杂-辛醇、3,6,9-三氧杂-癸醇、3,6,9-三氧杂-十一烷醇、4-氧杂-戊醇、4-氧杂-己醇、4-氧杂-庚醇、4,8-二氧杂-壬醇、4,8-二氧杂-癸醇、4,8-二氧杂-十一烷醇、5-氧杂-己醇或5,10-二氧杂-十一烷醇。

此外，作为溶剂，可以使用乙氧基化的和/或丙氧基化的醇以及乙氧基化/丙氧基化的混合醇，特别是r^a-(o-ch2-ch2)x-oh或者r^a-(o-ch(ch3)-ch2)x-oh或r^a-(o-ch2-ch(ch3))x-oh，其中r^a为c1至c20-烷基和x为10至20的整数；或者乙氧基化的和/或丙氧基化的氨基醇，例如r^b2n(-ch2-ch2-o)y-h或者r^b2n(-ch(ch3)-ch2-o)y-h或r^b2n(-ch2ch(ch3)-o)y-h，其中y为1至4的整数。r^b为具有1-6个碳原子的烷基，其中氮也可以与取代基r^b一起形成五至六元环。任选地，所述环还可以被一个或多个短链烷基(例如甲基、乙基或丙基)取代。

然而，可以有利的是，还在酯化前对甲基丙烯酸进行纯化，其中原则上可以使用本领域技术人员已知的任何纯化方法来进行纯化，所述纯化方法常规地用于纯化被污染的、通过丙烯的催化气相氧化而获得的(甲基)丙烯酸。

如果脱水在气相中进行，那么优选的是，首先使甲基丙烯酸冷凝，从而获得甲基丙烯酸水溶液。在此，原则上可以使用本领域技术人员已知的任何冷凝方法，例如分级冷凝，如在wo-a-2004/035514、wo-a-03/014172或ep-a-ep1163201中所描述的，或者通过完全冷凝，如在ep-a-0695736中所描述的。还可以考虑的是，在冷凝的情况下添加另外的溶剂，特别是水，以便尽可能完全地吸收甲基丙烯酸。

然后，可以在进一步的纯化步骤中使在冷凝后获得的甲基丙烯酸水溶液或者在液相脱水的情况下获得的甲基丙烯酸水溶液去除水和其他污染物。在此，可以首先在共沸剂存在下通过共沸蒸馏来除去水，如例如在de-a-19853064中所描述的。还可以考虑的是，使用高沸点有机溶剂来吸收甲基丙烯酸，如例如在ep-a-0974574中所公开的。除了这些蒸馏方法外，还可以使用膜来进行除水，如例如在de-a-4401405中所提出的。此外，还可以考虑通过结晶方法来纯化在液相脱水的情况下得到的或者通过冷凝获得的甲基丙烯酸水溶液。

在除水后获得的甲基丙烯酸可以在进一步的步骤中更进一步进行纯化。因此，可以通过进一步的蒸馏步骤来去除仍然含有的高沸点污染物。然而，下述情形是特别优选的，即通过结晶方法来进一步纯化在除水后获得的甲基丙烯酸，如例如在de-a-10149353中所描述的。

然后，任选地，如此获得的经纯化的甲基丙烯酸可以经历酯化。

此外，一种用于制备甲基丙烯酸或甲基丙烯酸酯的方法为解决开头所提及的任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤：

iia)通过上文所描述的方法来制备包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸，

iib)裂解包含2-羟基异丁酸单体单元的聚羟基链烷酸从而形成2-羟基异丁酸，以及任选地，中和2-羟基异丁酸和/或纯化2-羟基异丁酸，

iic)使2-羟基异丁酸脱水从而形成甲基丙烯酸，以及任选地，使甲基丙烯酸盐或者甲基丙烯酸酯化。

一种用于制备聚甲基丙烯酸或聚甲基丙烯酸酯的方法也为解决开头所提及的任务作出了贡献，所述方法包括下列步骤：

iiia)通过上文所描述的方法来制备甲基丙烯酸，

iiib)甲基丙烯酸的自由基聚合，

其中，任选地，在自由基聚合之前或之后，甲基丙烯酸的羧基基团可以至少部分地被酯化。

在下面的实施例中，实例性地描述了本发明，但不应当将本发明局限于在实施例中所提及的实施方案，本发明的应用范围由整个说明书和权利要求书中得出。

下面的附图为实施例的组成部分。

图1：杂合质粒pet101/d-topo::icma-icmb。

图2：杂合质粒pbbr1mcs-2::icma-icmb。

图3：在给样品掺添以2-羟基异丁酸后进行样品im-86中2-羟基异丁酸的定量。在此使用乳酸甲酯峰(保留时间：7.16分钟)作为内标。描绘了经掺添的样品和原始样品的gc-ms-色谱图片断。

图4：将2-羟基异丁酸加至样品im-89。描绘了原始样品(a)和经掺添的样品(b)的样品nmr-谱片断。

实施例

1.基因组dna的分离以及片段icma和icmb的扩增

根据制造商的说明，用dneasyblood&tissue试剂盒(qiagengmbh,hilden)从aquincolatertiaricarbonis菌株(a.tertiaricarbonisdsmz18512)中分离出基因组dna，并将其用作pcr的模板以扩增出片段icma(1.7kbp；dq436456)和icmb(0.4kbp；dq436457)。这些片段编码酶e3。在此，使用寡核苷酸aqt-icma_fw5’-caccatgacctggcttgagccgcag-3’(正向引物；起始密码子标有下划线)和aqt-icma-hind_rev5’-aaaaaagcttcctgctcagaagaccggcgtctcgcg-3’(反向引物；终止密码子和hindiii-切割位点标有下划线)用于扩增icma，和使用寡核苷酸aqt-icmb-hind_fw5’-aaaaaagcttcccaccatggaccaaatcccgatccgc-3’(正向引物；起始密码子和hindiii-切割位点标有下划线)和aqt-icmb_rev5’-tcagcgggcgccgcgcgcggcgac-3’(反向引物；终止密码子标有下划线)用于扩增icmb。

用pfu聚合酶(promega,madison,usa)来进行聚合酶链式反应(pcr，根据saiki等人,1985,enzymaticamplificationofβ-globingenomicsequencesandrestrictionsiteanalysisfordiagnosisofsicklecellanemia.science230:1350-1354)。在此，进行35个循环，每个循环为95℃60秒，65℃30秒和72℃4分钟。pcr的实施在循环变温器(primus96advanced；peqlabbiotechnologiegmbh,erlangen)中进行。

根据制造商的说明，用qiaquickpcrpurification试剂盒(qiagengmbh,hilden)来纯化所述片段，紧接着用hindiii进行限制酶切。将这两个批料经由该hindiii-切割位点进行连接。

使用连接产物icma-icmb(2.1kbp)作为pfu-pcr的模板，其中使用寡核苷酸aqt-icma_fw5’-caccatgacctggcttgagccgcag-3’(正向引物；起始密码子标有下划线)和aqt-icmb_rev5’-tcagcgggcgccgcgcgcggcgac-3’(反应引物；终止密码子标有下划线)(35个循环，每个循环为95℃60秒，65℃30秒和72℃4.5分钟)。根据制造商的说明，将所获得的具有相应大小的pcr产物用qiaquickpcrpurification试剂盒(qiagengmbh,hilden)进行纯化。

2.富养罗尔斯通氏菌表达载体的制备

根据制造商的说明，将经纯化的pcr片段icma-icmb(2.1kbp)连接到载体pet101/d-topo(invitrogengmbh,karlsruhe)中。将所获得的杂合质粒pet101/d-topo::icma-icmb(图1，seqidno.1)转移到感受态大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt)中，并通过限制酶切和测序来进行检查。

为了达到在富养罗尔斯通氏菌菌株(其在作为野生型的情况下具有酶e1、e2和e4的活性)中进行表达，必须将构建体克隆到合适的泛宿主性(broad-host-range)载体中。所使用的载体为pbbr1mcs-2，其描述于kovach等人,(1995).fournewderivativesofthebroad-host-rangecloningvectorpbbr1mcscarryingdifferentantibiotic-resistancecassettes.gene,166:175-176中。

为此，用酶xbai和saci对质粒pet101/d-topo::icma-icmb和pbbr1mcs-2进行限制酶切，并将片段icma-icmb连接到目标载体pbbr1mcs-2中，并且用所产生的杂合质粒pbbr1mcs-2::icma-icmb(图2，seqidno.2)转化感受态大肠杆菌dh5α细胞(newenglandbiolabs,frankfurt)。

通过限制酶切和测序对该质粒进行检查，并将其转移到感受态大肠杆菌s17-1细胞(使用该菌株可能实现质粒的接合转移，尤其是在富养罗尔斯通氏菌菌株中)中。为此，用大肠杆菌s17-1pbbr1mcs-2::icma-icmb作为供者和用富养罗尔斯通氏菌h16(重新分类为钩虫贪铜菌(cupriavidusnecator)，dsmz428)及富养罗尔斯通氏菌phb-4(重新分类为钩虫贪铜菌，dsmz541)作为受者进行点交配接合(spotmating-konjugation)(如描述于friedrich等人,1981,naturallyoccurringgenetictransferofhydrogen-oxidizingabilitybetweenstrainsofalcaligeneseutrophus.jbacteriol147:198-205中)。

可以获得携带质粒pbbr1mcs-2::icma-icmb的转接合子。

3.在重组的富养罗尔斯通氏菌细胞中产生2-羟基异丁酸

为了研究2-羟基异丁酸的形成，使在实施例2中所描述的携带质粒的富养罗尔斯通氏菌菌株在50mlvollbrecht-msm-培养基((nh4)2hpo4,2.0g；kh2po4,2.1g；mgso4×7h2o,0.2g；fecl3×6h2o,6mg；cacl2×2h2o,10mg；痕量元素溶液(pfennig和lippert,1966),0.1ml)中生长。另外，给该培养基补充葡糖酸钠(15g/l)、卡那霉素(50μg/ml)和辅酶b12(60μg/ml)。将细胞在30℃和160rpm下在温控摇床上进行温育。在30小时后，再次进料葡糖酸钠(1.5％,w/v)和辅酶b12(60μg/ml)。在培养52小时后，通过在5000rpm(4℃)下离心来进行收获。将培养物上清液贮存于-20℃直至分析。

借助于定量¹h-nmr-光谱学进行2-羟基异丁酸的检测和定量。将样品定量地进行浓缩。从残留物中记录¹h-nmr-谱，并计算相对于作为内标的tsp(三甲硅烷基丙酸)的含量。2-羟基异丁酸在该谱中在大约1.36ppm处显示出单峰，并且为了保险起见，添加了纯物质(图3)。

在经分析的样品中，检测到最大0.72mmol/kg的2-羟基异丁酸的浓度。与此相反，在具有空质粒的相应对照批料中，没有检测到2-羟基异丁酸。借助于gc-ms和添加纯物质2-羟基异丁酸来定量地和定性地确认所述nmr-测量结果(图4)。在该情况下，在30mrtx-1701毛细管柱(fisherscientific,pittsburgh,usa)上进行色谱分离。在冻干后，用衍生化试剂“methelute”(pierce,rockford,usa)吸收样品。通过分流/不分流注射器(split-/splitless-injektor)直接进样0.5μl该溶液。通过用数据库谱图调整该质谱来进行2-羟基异丁酸峰的鉴定。为了评定2-羟基异丁酸的含量，给样品掺添以确定量的比较物质2-羟基异丁酸。在经分析的样品中，检测到最大44μg/ml的浓度。在具有空质粒的对照批料中，没有检测到2-羟基异丁酸。类似地，从作为碳源的果糖(1.5％,w/v)开始合成，也可以检测到2-羟基异丁酸。

4.将2-羟基异丁酸脱水成甲基丙烯酸

在搅拌下向5ml根据实施例3产生的2-羟基异丁酸溶液(0.2g/l)中掺入naoh(0.06mg)。在真空下(300托)于185-195℃在搅拌和回流冷凝下使该溶液进行温育。在5小时的时间段期间，每小时再次添加在5ml中的0.5mg2-羟基异丁酸，其包含0.4重量％的对甲氧基苯酚，以防止甲基丙烯酸聚合。在温育24小时后，结束反应。2-羟基异丁酸向甲基丙烯酸的转化合计超过90％。通过蒸馏从该反应批料中分离出甲基丙烯酸。

序列表

<110>evonikrohmgmbh

<120>产生2-羟基异丁酸的重组细胞

<130>2008p00128

<160>2

<170>patentinversion3.4

<210>1

<211>7870

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>质粒

<400>1

caaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaa60

acaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgat120

ataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgta180

gaggatcgagatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcg240

gataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggaattcaggagccct300

tcaccatgacctggcttgagccgcagataaagtcccaactccaatcggagcgcaaggact360

gggaagcgaacgaagtcggcgccttcttgaagaaggcccccgagcgcaaggagcagttcc420

acacgatcggggacttcccggtccagcgcacctacaccgctgccgacatcgccgacacgc480

cgctggaggacatcggtcttccggggcgctacccgttcacgcgcgggccctacccgacga540

tgtaccgcagccgcacctggacgatgcgccagatcgccggcttcggcaccggcgaggaca600

ccaacaagcgcttcaagtatctgatcgcgcagggccagaccggcatctccaccgacttcg660

acatgcccacgctgatgggctacgactccgaccacccgatgagcgacggcgaggtcggcc720

gcgagggcgtggcgatcgacacgctggccgacatggaggcgctgctggccgacatcgacc780

tcgagaagatctcggtctcgttcacgatcaacccgagcgcctggatcctgctcgcgatgt840

acgtggcgctcggcgagaagcgcggctacgacctgaacaagctgtcgggcacggtgcagg900

ccgacatcctgaaggagtacatggcgcagaaggagtacatctacccgatcgcgccgtcgg960

tgcgcatcgtgcgcgacatcatcacctacagcgcgaagaacctgaagcgctacaacccga1020

tcaacatctcgggctaccacatcagcgaggccggctcctcgccgctccaggaggcggcct1080

tcacgctggccaacctgatcacctacgtgaacgaggtgacgaagaccggtatgcacgtcg1140

acgaattcgcgccgcggttggccttcttcttcgtgtcgcaaggtgacttcttcgaggagg1200

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caagaaatccggaatcgatgcggttgcgcttccactgtcagaccgcggcggcgacgctga1320

ccaagccgcagtacatggtcaacgtcgtgcgtacgtcgctgcaggcgctgtcggccgtgc1380

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ccgacgtgatcgacccgctgggtggcagctactacgtcgaggcgctgaccaccgagtacg1560

agaagaagatcttcgagatcctcgaggaagtcgagaagcgcggtggcaccatcaagctga1620

tcgagcagggctggttccagaagcagattgcggacttcgcttacgagaccgcgctgcgca1680

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tcaagatcgagatccacccgtacgacaacacgacggccgaacgccagatttcccgcacgc1800

gccgcgttcgcgccgagcgcgacgaggccaaggtgcaagcgatgctcgaccaactggtgg1860

ctgtcgccaaggacgagtcccagaacctgatgccgctgaccatcgaactggtgaaggccg1920

gcgcaacgatgggggacatcgtcgagaagctgaaggggatctggggtacctaccgcgaga1980

cgccggtcttctgagcaggaagcttcccaccatggaccaaatcccgatccgcgttcttct2040

cgccaaagtcggcctcgacggccatgaccgaggcgtcaaggtcgtcgctcgcgcgctgcg2100

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cacggtcttccccaagatcttcaagctcctggacgagagaggcgctggcgacttgatcgt2280

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cgccgcgcgcggcgcccgctgaaagggcgagctcaattcgaagcttgaaggtaagcctat2460

ccctaaccctctcctcggtctcgattctacgcgtaccggtcatcatcaccatcaccattg2520

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aaggaggaactatatccggatatcccgcaagaggcccggcagtaccggcataaccaagcc2700

tatgcctacagcatccagggtgacggtgccgaggatgacgatgagcgcattgttagattt2760

catacacggtgcctgactgcgttagcaatttaactgtgataaactaccgcattaaagctt2820

atcgatgataagctgtcaaacatgagaattaattcttgaagacgaaagggcctcgtgata2880

cgcctatttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcaggtggcact2940

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cctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagct3660

tcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgc3720

tcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtct3780

cgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctac3840

acgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcc3900

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