一种人工耐盐蛋白、合成方法及编码基因和基因的应用与流程

本发明属于基因工程
技术领域：
，具体涉及一种人工耐盐蛋白、合成方法及编码基因和基因的应用。
背景技术：
：目前，世界上有4×103～9×103hm2土地受盐渍化的影响，我国就有2.6×107hm2，其中耕地约6.6×103hm2，土地盐渍化已成为影响作物生长的一个重要因素。随着工业的发展，灌溉用水的质量不断下降，土壤盐渍化有不断加剧的趋势。因此，盐渍化的治理、综合开发及植物耐盐性的提高、盐水资源的利用等成因对植物的生长影响巨大培育耐盐作物的品种是开发利用盐碱地的有效途径。现有技术中培育耐盐作物品种的主要方法有：野生耐盐植物的驯化；传统的育种：作物与野生亲缘种的远缘杂交；突变型的筛选和基因工程育种等。但是由于对植物耐盐的生化基础理解的不够深入，迄今尚未获得具有实践意义的耐盐作物品种。随着分子生物学的迅速发展，植物耐盐生理生化机制日益明确，使得克隆与植物耐盐相关基因成为可能。例如，授权公告号CN103204915B的专利公开了甘薯耐盐相关蛋白IbEST及其编码基因与应用，所述IbEST蛋白来源于甘薯品种，所述蛋白在其他品种是否具有耐盐性未可知。再例如授权公告号CN102796713B的专利公开了植物耐盐相关蛋白和基因及其作为筛选标记的应用，具体公开了一种命名为GmVP的植物耐盐相关蛋白，将所述植物耐盐相关蛋白转入单子叶植物或双子叶植物中均能够表现出耐盐性。然而植物来源的耐盐蛋白或基因存在种属物种的限制，应用范围受限制。但是目前现有技术中，没有任何报道提供一种人工合成的耐盐蛋白，也没有关于人工合成的耐盐蛋白在转基因微生物中的报道。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种人工耐盐蛋白、合成方法及编码基因和基因的应用，使所述人工合成的耐盐蛋白在微生物宿主中能够提高其耐盐能力。为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：本发明提供了一种人工耐盐蛋白NLEA，具有序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。本发明提供了所述的耐盐蛋白NLEA的合成方法，包括以下步骤：1)从LEA数据库调取不同种类的LEA蛋白；2)将所述步骤1)调取的不同种类的LEA蛋白进行多序列比对，得到保守短肽；3)从所述步骤2)得到的保守短肽中筛选出亲水指数高于3.5的亲水短肽；4)将所述步骤3)得到的亲水短肽按照亲水短肽的等电点由大到小的顺序排列，拼接，得到耐盐蛋白NLEA。优选的，所述步骤3)中亲水指数采用式I所示计算公式计算得到：f(i)为单个氨基酸的亲水数；n＝11。优选的，所述步骤3)中在保守短肽筛选亲水短肽前对所述保守短肽进行聚类分析，得到聚类到不同分枝的保守短肽。本发明提供了所述的耐盐蛋白的编码基因NELA，具有序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。本发明还提供了含有所述编码基因的重组表达载体。优选的，所述重组表达载体为pYES2-nlea。本发明提供了含有所述重组表达载体的宿主。优选的，宿主的种类包括酿酒酵母、大肠杆菌或农杆菌。本发明还提供了所述的基因在微生物转基因细胞培养中作为筛选标记分子的应用。本发明提供了所述的耐盐蛋白NLEA的合成方法，包括以下步骤：1)从LEA数据库调取不同种类的LEA蛋白；2)将所述步骤1)调取的不同种类的LEA蛋白进行多序列比对，得到保守短肽；3)从所述步骤2)得到的保守短肽中选择亲水指数高于3.5的亲水短肽；4)将所述步骤3)得到的亲水短肽按照亲水短肽的等电点由大到小的顺序排列，拼接，得到耐盐蛋白NLEA。本发明通过调取LEA蛋白数据多种LEA保守氨基酸序列进行生物信息学分析；具体通过对亲水性，等电点，电荷极性等物理性质进行分析，找到其中耐盐性评价较高的短肽，然后根据等电点的大小排列，拼接得到一条由110个氨基酸残基组成的新的亲水氨基酸序列。本发明提供的方法构建步骤简单，方法标准可靠，不受物种种类的限制。构建的耐盐蛋白质转入到微生物宿主细胞中，能够产生耐盐性的特性。结合实施例表明，转NLEA酿酒酵母在氯化钠的摩尔浓度为0.5mol/L和0.6mol/L时与对照组有明显的区别，转NLEA酿酒酵母最高能承受0.8mol/LNaCl。本发明提供了一种人工耐盐蛋白NLEA，具有序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。本发明提供的人工耐盐蛋白NLEA具有较高的亲水性，亲水性高的蛋白质，一方面能够降低细胞的水势，利于细胞从环境中吸收水分，另一方面细胞中水分含量提高，能够降低离子的浓度，减轻离子毒害作用，因此，所述耐盐蛋白NLEA使细胞达到耐盐特性。附图说明图1为In-Fusion技术的原理；图2为实施例2中载体双酶切后琼脂糖凝胶电泳图；图3为实施例3中含有耐盐蛋白的编码基因NELA的表达载体；图4为实施例5中盐胁迫下酿酒酵母生长曲线；图5为实施例6中不同盐胁迫下转NLEA酿酒酵母与野生菌株的表型观察。具体实施方式本发明提供了一种人工耐盐蛋白NLEA，具有序列表中SEQIDNo.1所示的氨基酸序列。本发明提供了所述的耐盐蛋白NLEA的合成方法，包括以下步骤：1)从LEA数据库调取不同种类的LEA蛋白；2)将所述步骤1)调取的不同种类的LEA蛋白进行多序列比对，得到保守短肽；3)从所述步骤2)得到的保守短肽中筛选出亲水指数高于3.5的亲水短肽；4)将所述步骤3)得到的亲水短肽按照亲水短肽的等电点由大到小的顺序排列，拼接，得到耐盐蛋白NLEA。本发明从LEA数据库调取不同种类的LEA蛋白。本发明中，所述LEA数据库优选为LateEmbryogenesisAbundantProteinsDataBase，网址为http://forge.info.univ-angers.fr/～gh/Leadb/index.php。本发明中，所述调取的方法为下载。所述不同种类的LEA蛋白的数量优选为不同植物来源的1643种LEA蛋白。得到不同种类的LEA蛋白后，本发明将所述不同种类的LEA蛋白进行多序列比对，得到保守短肽。本发明中，所述多序列比对的工具优选为生物信息学软件BioEdit。所述多序列比对的方法没有特殊限制采用本领域技术人员所熟知的多序列比对的方法即可。本发明中，所述保守短肽的长度优选为11个氨基酸。当保守短肽的长度大于11个时，本发明优选多肽整体上亲水性较强的保守短肽。得到保守短肽后，本发明从所述保守短肽中选择亲水指数高于3.5的亲水短肽。本发明中，所述亲水指数优选采用式I所示计算公式计算得到：f(i)为单个氨基酸的亲水数，n＝11。本发明中，所述单个氨基酸的亲水数如表1所示；表1常用氨基酸的亲水数氨基酸缩写亲水数氨基酸缩写亲水数Arg(R)4.5Gly(G)0.4Lys(K)3.9Ser(S)0.8Asn(N)3.5Thr(T)0.7Asp(D)3.5Ala(A)-1.8Gln(Q)3.5Met(M)-1.9Glu(E)3.5Cys(C)-2.5His(H)3.2Phe(F)-2.8Pro(P)1.6Leu(L)-3.8Tyr(Y)1.3Val(V)-4.2Trp(W)0.9Ile(I)-4.5本发明中，在筛选亲水短肽前优选对所述保守短肽进行聚类分析，得到聚类到不同分枝的保守短肽。所述聚类分析的目的是筛选出不同氨基酸组成的保守短肽。本发明中所述聚类的工具优选为生物信息学软件MEGA6。所述聚类的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的聚类方法即可。得到亲水短肽后，本发明将所述亲水短肽按照亲水短肽的等电点由大到小的顺序排列，拼接，得到耐盐蛋白NLEA。本发明中，将所述亲水短肽进行分子量、等电点和电荷极性进行分析。所述分析的工具优选为在线软件SMART。本发明中，所述亲水短肽的分子量，等电点，电荷极性等特征如表2所示；表2亲水短肽的分子量，等电点，电荷极性等特征一览表本发明中，所述拼接的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的拼接方案即可。本发明中，所述耐盐蛋白NLEA的组成大多数氨基酸残基为碱性和亲水性氨基酸，无半胱氨酸和色氨酸，亲水性较强，保守性强，无复杂的三级结构。本发明提供了所述的耐盐蛋白的编码基因NLEA，具有序列表中SEQIDNo.2所示的核苷酸序列。在本发明中，所述编码基因NLEA的筛选方法优选包括以下步骤：A.根据耐盐蛋白的氨基酸序列，利用一个氨基酸对应一个或多个密码子，将氨基酸序列翻译成核苷酸序列；当一个氨基酸对应多个密码子时，选择优势密码子；所述优势密码子为在GeneticCodes数据库中，同一氨基酸的不同密码子在酵母菌基因组中的使用频率，使用频率分高的密码子，为优势密码子；B.对所述翻译得到的核苷酸序列进行调整，避免GC含量大于60％的序列。本发明还提供了含有所述编码基因的重组表达载体。本发明中，所述重组表达载体优选为pYES2-nlea。在本发明中，所述重组表达载体的构建方法优选包括以下步骤：Ⅰ以公司合成的编码基因NLEA序列为模板，进行PCR扩增，对得到的PCR扩增产物回收，得到回收PCR产物；Ⅱ用SacI和EcoRI双酶切对质粒PYES2进行酶切，得到性化的质粒PYES2；Ⅲ胶回收产物线性化的质粒PYES2和胶回收PCR产物NLEA利用In-Fusion反应进行连接，得到重组表达载体；所述步骤Ⅰ和步骤Ⅱ之间没有时间顺序的限制。本发明以合成的编码基因nlea序列为模板，进行PCR扩增。本发明中，所述PCR扩增用正向引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.3所示；所述PCR扩增用反向引物的核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.4所示。本发明中，所述PCR扩增体系优选包括DNA模板1μL，5×PhushionHFbuffer4μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，10μM基因特异引物1μL，PhusionDNA聚合酶0.2μL，DMSO0.6μL，剩余用水补齐20μL。本发明中，所述PCR扩增程序优选为：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。所述PCR扩增后，本发明对得到的PCR扩增产物回收，得到回收PCR产物。所述扩增产物回收优选采用试剂盒法进行。所述试剂盒的种类没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的扩增产物用试剂盒的即可。本发明用SacI和EcoRI双酶切对质粒PYES2进行酶切。本发明中，所述SacI和EcoRI双酶的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的SacI和EcoRI即可。本发明实施例中，所述SacI和EcoRI酶购自北京NEB公司。本发明中，所述质粒PYES2的来源没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的质粒PYES2的来源即可。本发明实施例中，所述质粒PYES2中国农业大学赠送。本发明中，所述酶切的反应体系为：20000单位/mlSacI1μL，EcoRI1μL，10×CutSmart2.5μL，PYES25μL；酶切温度优选为50℃，孵育1h；65℃，失活15min。得到质粒PYES2和胶回收PCR产物NLEA后，本发明将胶回收产物线性化的质粒PYES2和胶回收PCR产物NLEA进行连接，得到重组表达载体。本发明中，所述连接优选利用In-Fusion反应进行连接。所述In-Fusion反应的原理是插入片段与线性化载体末端有15个同源碱基(见图1)。本发明中，所述In-Fusion反应的体系为：线性化载体PYES23μL；PCR产物5μL；5×In-FusionHDEnzymePremix2μL；反应温度为50℃，温育15min。本发明中，所述重组表达载体优选在应用前进行验证。所述验证的方法包括以下步骤：①将重组表达载体通过热击转化转入大肠感受态细胞DH5α后，用氨苄青霉素进行筛选；②将所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，PYES2-NLEA载体上游有T7引物和infusion-NLEA反向引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定，得到阳性克隆；③对阳性克隆进行测序，测得的序列与原始序列进行比对，相似度达到100％的阳性克隆为转化成功的重组大肠杆菌。本发明还提供了含有所述重组表达载体的宿主。本发明中，宿主的种类优选包括酿酒酵母、大肠杆菌或农杆菌。本发明中，含有所述重组表达载体的宿主在氯化钠的摩尔浓度为0.5mol/L～0.8mol/L范围内具有耐盐性。本发明中，所述含有所述宿主的制备方法优选为：将所述重组表达载体转化入宿主中。本发明中，所述转化的方法没有特殊限制，采用本领域技术人员所熟知的转化方案即可。本发明还提供了上述技术方案所述编码基因在微生物转基因细胞培养中作为筛选标记分子的应用。本发明中，所述作为筛选标记分子的应用具体为：将转基因的细胞或宿主在盐度条件下培养，只有正常生长的细胞或宿主才是转基因成功地材料，未转化有耐盐蛋白的宿主不能在盐度条件下生长。下面结合实施例对本发明提供的一种人工耐盐蛋白、合成方法及编码基因和基因的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1以通过测序带有合成的基因的质粒为模板，以合成基因为模板。公司合成好的基因是直接连到puc57这个公司自制载体上的，该基因不能独立存在。以合成好的基因为模板，以SEQIDNo.3所示的正向引物和SEQIDNo.4所示反向引物进行扩增的。PCR扩增体系为：反应总体系包括puc57-NLEA1μL，5×phushionHFbuffer4μL，10mmol/LdNTPs0.4μL，10μM基因特异引物1μL，PhusionDNA聚合酶0.2μL，DMSO0.6μL，剩余用水11.8μL补齐。PCR扩增程序为：98℃30s，35个循环的程序为98℃10s，60℃30s，72℃1min，最后72℃5min。50μL全部点样，琼脂糖电泳后回收PCR产物。实施例2双酶切载体PYES2以通过测序鉴定的质粒PYES2为模板，选择SacI和EcoRI为酶切位点，进行双酶切。反应体系为：20000units/mlSacI1μL，EcoRI1μL，10×CutSmart2.5μL，PYES25μL；50℃，孵育1h；65℃，失活15min，25μL全部点样，琼脂糖电泳后回收酶切产物。图2为双酶切后载体PYES2的琼脂糖凝胶电泳图。实施例3表达载体PYES2-NLEA的构建将鉴定正确的胶回收产物线性化的质粒PYES2和胶回收PCR产物NLEA利用In-Fusion反应进行连接。其体系为：线性化载体PYES23μL；PCR产物5μL；5×In-FusionHDEnzymePremix2μL。50℃，温育15min。将构建好的重组载体通过热击转化转入大肠感受态细胞DH5α，具体包括取2μL的连接产物于50μL的DH5α感受态细胞中。冰浴30min。42℃热击50s。迅速放于冰上2min。加入700μL液体LB培养基。37℃，250rpm，摇1h。5000rpm，离心1min。吸走上清液600μL。剩150μL吸打悬浮菌体。将剩余菌液全部涂布于含有100mg/mlAmp抗性的固体LB平板上。用氨苄青霉素进行筛选。将转化所得的菌斑摇菌提质粒，保存进行菌落PCR鉴定，PYES2-NLEA载体上游有T7引物和infusion-NLEAR引物，以转化所得质粒为模板进行PCR鉴定。对阳性克隆进行测序。将测序结果与编码基因进行序列比对。序列完全一致的即为构建成功的PYES2-NLEA。图3为含有耐盐蛋白的编码基因NELA的表达载体。实施例4表达载体PYES2-NLEA的转化酿酒酵母菌。1)取50μL的酿酒酵母感受态细胞于冰上融化，加入2μL已构建好的重组载体。5μL已变性的线性化DNA，加入50μLPEG/LiAc，轻柔混匀，冰上放置半小时。2)向1)中加入20μLDMSO。4)42℃水浴15min。5)高速离心15s。6)弃上清，用1mlYPDPlus培养基悬浮菌体，30℃摇菌1h。7)高速离心15s，弃上清，用0.9％NaCl溶液悬浮细胞。8)分别用NaCl溶液稀释菌液，10倍，100倍。9)取100μL稀释后发菌液涂布与营养缺陷型培养基SC-Ura。10)30℃培养3-5天，筛选阳性克隆。利用营养缺陷型培养基是用来筛选该重组质粒是否转入酵母菌。因为该培养基是尿嘧啶缺陷型培养基，pYES2这个质粒含有尿嘧啶基因，只有转入该质粒的酵母菌才能在此培养基上生长。实施例5转基因酵母的表型鉴定将转入空载体PYES2酿酒酵母菌(对照)和转PYES2-NLEA酿酒酵母菌置于含有半乳糖诱导的液体尿嘧啶选择培养基中，观察其生长曲线，结果发现在转PYES2-NLEA酿酒酵母菌生长趋势好于空载体PYES2酿酒酵母菌。然后高温灭菌。生长三天后观察转空载体PYES2和转PYES2-NLEA的酿酒酵母生长情况(图4)。由图4可以得知，转PYES2-NLEA的酿酒酵母菌在600mMNaCl处理时长势明显优于转空载体PYES2对照酿酒酵母菌。实施例6将转入空载体PYES2酿酒酵母菌(对照)和转PYES2-NLEA酿酒酵母菌置于含有半乳糖诱导的固体尿嘧啶选择培养基。该培养基中含有不同浓度的盐处理。不同的盐浓度分别是：0M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M、0.5M、0.6M、0.7M、0.8M、0.9M和1.0M。不同盐胁迫下转NLEA酿酒酵母与野生菌株的表型进行观察，不同盐度胁迫下转NLEA酿酒酵母与野生菌株的表型见图5。由图5可以看出，氯化钠的摩尔浓度为0.5M和0.6M时与对照组有明显的区别，转NLEA酿酒酵母最高能承受0.8MNaCl。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。SEQUENCELISTING<110>天津农学院<120>一种人工耐盐蛋白、合成方法及编码基因和基因的应用<130>2017<160>5<170>PatentInversion3.3<210>1<211>110<212>PRT<213>人工序列<400>1ArgGluGluGluGluGlnArgArgGlnArgArgArgGluGluGluGlu151015GlnArgArgGlnArgArgArgGluGluGluGluGlnArgArgGlnArg202530ArgArgGluGluGluGluGlnArgArgGlnArgArgArgGluGluGlu354045GluGlnArgArgGlnArgArgArgGluGluGluGluGlnArgArgGln505560ArgArgArgGluGluGluGluGlnArgArgGlnArgArgArgGluGlu65707580GluGluGlnArgArgGlnArgArgArgGluGluGluGluGlnArgArg859095GlnArgArgArgGluGluGluGluGlnArgArgGlnArgArg100105110<210>2<211>336<212>DNA<213>人工序列<400>2atgagagaagaagaggaacaaagaagacaaaggcgtagagaggaagaggaacagaggcgt60caaagaaggagagaggaagaagaacagagaaggcaaaggagaagggaagaagaggagcaa120agaaggcaaagacgtagggaagaagaagagcaaaggagacagaggaggcgtgaagaagaa180gaacaaagaagacaacgtagaagggaagaggaagaacaaagacgtcagagaagacgtgag240gaagaagagcagagaagacaaagacgtcgtgaagaggaagagcagagaagacaaagaaga300agagaagaagaagaacaacgtagacaaaggagatag336<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>3ttaagcttggtaccgagctc20<210>4<211>16<212>DNA<213>人工序列<400>4gatatctgcagaattc16<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5cgtaatacgactcactataggg22当前第1页1 2 3